方法論記事

レーザースペックルコントラストイメージングを使用したラットの足の皮膚における閉塞後反応性充血の評価

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DOI：

10.3791/68986

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2025年10月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1V.A. Negovsky Research Institute of General Reanimatology, Federal Research and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitology, 2Research and Development Center of Biomedical Photonics, Orel State University, 3College of Engineering and Physical Sciences, Aston University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、レーザースペックルコントラストイメージングと侵襲的血圧測定を使用して、麻酔ラットの皮膚における閉塞後反応性充血のパラメーターを評価する方法を提示します。

要約

レーザースペックルコントラストイメージング(LSCI)は、ヒトおよび実験動物の微小血管灌流を評価するための最新の非侵襲的技術です。LSCI と侵襲的血圧 (BP) 測定および血管閉塞検査を組み合わせることで、閉塞後反応性充血 (PORH) の研究が可能になり、微小血管血流予備能と血管反応性の評価が可能になります。この記事では、LSCI を使用して、全身麻酔下でラットの後足の PORH を記録し、視覚化する技術を示します。特別な空気圧カフを膨らませて、脛骨のレベルで一時的な(180秒)血管閉塞を作成します。その後の PORH (ピーク充血および動態指数) の評価は、研究中の病理学的プロセス (循環ショック、心不全、高血圧など) のメカニズムと重症度に関する追加情報を提供したり、安静時の灌流を評価するときに明らかではない新薬の血管効果を特定したりできます。侵襲的血圧モニタリングにより、皮膚血管コンダクタンスの計算と全身血行動態の変化の考慮が可能になり、これは重篤な病気の実験モデルにおいて特に重要です。出血性ショックのラットモデルにおける微小血管機能障害を特定するためのこのアプローチの使用も実証されます。

概要

微小血管機能障害は、多くの心血管疾患、内分泌疾患、その他の疾患の病因に関与しており、組織の灌流と酸素化を損ない、全身血行動態の血管運動調節機構を破壊します(例えば、高血圧症)1。微小循環障害は、外傷、敗血症、およびさまざまな種類のショック(出血性、敗血症性、心原性など)を伴う重症患者の臓器機能障害のメカニズムにおいても、病態生理学的に大きな意味を持っています。2.

現在、組織灌流と微小血管機能を非侵襲的に評価するための臨床および前臨床研究では、レーザー ドップラー フローメトリー (LDF)、レーザー ドップラー イメージング (LDI/LDPI)、レーザー スペックル コントラスト イメージング (LSCI) など、いくつかのレーザーベースの方法が使用されています。その中でも、LSCI は、クリニックにおける皮膚灌流の非侵襲的評価に最も有望です。この方法は、実行が簡単で、高い空間的および時間的分解能の両方で調査領域全体を視覚化できるため、LDFおよびLDI / LDPIよりも明らかな利点があります3。LSCI は、レーザー光を使用してスペックル パターンを作成し、それを分析して血流動態を視覚化する技術です。微小循環のリアルタイムで高解像度の評価が提供され、神経科学4、腹部外科5、皮膚科6、その他の血管研究 7,8 など、臨床と実験の両方の現場でさまざまな研究分野に不可欠です。

安静時の皮膚灌流値の単純な評価は、微小血管障害を特定するための有益ではないことがよくあります。これは、皮膚循環の本質的な機能的特徴(高い変動性、温度への依存性、ストレス、およびその他の要因)と、身体の代償反応中の「偽の正常な」組織灌流(たとえば、敗血症性ショックの初期段階での心拍出量の増加)の両方によるものです。標準的な機能負荷を追加で使用することで、微小循環をより適切に評価し、安静時条件下に隠れている微小血管機能障害を特定できます1。LSCI は、薬理学的刺激下での皮膚微小循環の評価に有用であることも知られています9。

LSCI と血管閉塞検査の組み合わせにより、微小循環の重要な機能パラメータ、特に血流予備能と微小血管系の反応性を反映する閉塞後反応性充血 (PORH) の現象を非侵襲的に評価できます10。このアプローチは、ベースライン灌流測定値からは明らかではない機能的微小循環異常を特定するための臨床研究で広く使用されています11 が、PORH の評価は前臨床動物研究ではまれです12,13。臨床研究と比較して、in vivo 実験で血管閉塞試験を使用すると、研究者は PORH のメカニズム、重篤な疾患の病因、および血管作動薬の薬力学を評価する追加の機会が得られます。もちろん、これらの機会は、動物の人道的な扱いに関する現代の生命倫理基準の範囲内でなければなりません。

このプロトコルは、LSCI と侵襲的血圧測定を使用して、麻酔ラットの皮膚における PORH のパラメーターを評価する方法を提示します。後者はラットの頸動脈のカテーテル挿入を含み、平均動脈圧(MAP)と脈拍数の測定を可能にします。さらに、臨床検査のために動脈血サンプルを採取する場合があります (例: 動脈血ガス分析)。このプロトコルは、主に、実験手順の完了後に動物を麻酔から目覚めさせることを伴わない急性実験を対象としていることは注目に値します(たとえば、重篤な病気のモデル化)。ラットの微小循環を評価するために私たちが提案する方法は比較的単純であり、内皮機能障害の評価を含む血管生理学と病態生理学の比較研究、および新しい血管作動薬の前臨床試験に特に役立ちます。

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プロトコル

以下に説明する手順は、集中治療医学およびリハビリテーション学の連邦研究および臨床センターの倫理審査委員会によって承認されたプロトコルの一部として実行されました。

1.血管閉塞のための空気圧カフの準備

  1. ラット用の非侵襲的血圧(NIBP)測定システムの空気圧カフを使用して、ラットの後足に一過性の血管閉塞を作成します。
  2. カフをアネロイド圧力計と、人間の血圧を測定するための従来の機械式眼圧計のゴム製ポンプに接続します。透明な3mmプラスチックチューブ(そのうち1mはNIBPシステムに含まれています)の3つのセグメントと適切なサイズのTコネクタを使用します(図1)。
  3. 組み立てられた空気圧システムを動物に使用する前に、その機能と気密性を確認してください。膨らませた状態でカフ圧が200〜220mmHgに数分間維持されていることを確認します。

2. 動脈カテーテル、ワークステーション、手術器具の準備

  1. 作業エリアを70%アルコールで処理します。手術台を滅菌ドレープで覆います。カテーテルと器具をガス滅菌します(生存手順および慢性実験)。
  2. 頸動脈カテーテル法には、長さ 12 cm の PE-50 カテーテル (外径 0.9 mm、内径 0.6 mm) を使用し、端から 25 mm のところにロック リングを使用します。動脈穿孔を防ぐには、エッジが滑らかなカテーテルを使用してください。
  3. 鈍針22Gとヘパリン化生理食塩水(5 IUヘパリン/ 1 mL)で満たされた2 mL注射器をカテーテルの外側の端に取り付けます。カテーテルをヘパリン化生理食塩水(0.1〜0.2 mL)で洗い流し、開存性を確保し、血栓形成を防ぎます。

3. 麻酔と術前の取り扱い

注:すべての麻酔薬は呼吸と循環を抑制する可能性があります。致命的な過剰摂取を避けるには、動物の種類、系統、年齢、健康状態に基づいた適切な投与が重要です。担当者は、動物麻酔とバイタルサインのモニタリングに関する訓練を受けなければなりません。手順は、関連する施設動物管理および使用委員会 (IACUC) または同等の倫理機関によって承認されなければなりません。針、メス、その他の鋭利な器具を取り扱うときは注意が必要です。鋭利物容器は必ず使用してすぐに廃棄してください。針を折り返さないでください。人獣共通感染症を感染させたり、身体的外傷を引き起こしたりする可能性のある針刺し傷のリスクに注意してください。

  1. チルタミン(10 mg / kg)+ゾラゼパム(10 mg / kg)2%生理食塩水溶液、およびキシラジン(5 mg / kg)生理食塩水0.5%溶液の混合物の腹腔内(IP)注射によってラットを麻酔します。反射神経(つま先のつまみ)がないかどうかをチェックして、麻酔が適切であることを確認します。
  2. 首の前部と後部(肩甲骨間領域を含む)から毛皮を剃ります。これらの領域の皮膚を皮膚消毒剤(70%アルコール)で処理します。動物を加熱された手術台の上に仰臥位に置きます。
  3. 麻酔の深さ(自発的な動き、痛みを伴う刺激への反応)、呼吸パターン(頻度、深さ、リズム、喘鳴)、皮膚および粘膜の色を定期的に評価することにより、麻酔された動物の状態を監視します。必要に応じて、ティレタミン+ゾラゼパム10 mg / kg IPの追加注射を使用してください。
  4. 加熱テーブルと断熱毛布を使用して、動物の直腸温度を36.5〜37.0 °Cに維持することにより、重大な低体温症を回避します。

4.左頸動脈カテーテル法

  1. 首の腹側面に2cmの正中線の皮膚切開を行います。止血剤と鉗子を使用して、首の筋肉と筋膜を縦方向に鈍く解剖して左頸動脈を露出させ、血管の5〜7 mmの部分を分離します。迷走神経を頸動脈から慎重に分離し、損傷を避けます。
  2. 4-0シルク縫合糸を使用して、動脈の尾側部分に緩いネクタイを置き、血管の頭蓋端を結紮します。動脈の下に配置された顕微手術鉗子の顎を使用して、動脈を優しく伸ばし、切開後の出血を防ぎます。
  3. 頭蓋方向に45°の角度を付けた顕微手術用ハサミを使用して、2つの結紮糸の間の動脈に横方向の切開を行います(血管の直径の半分以下の深さまで)。
  4. 動脈に小さな切開を行った後、鉗子の助けを借りて心臓に向かって固定リングまでカテーテルを挿入します。カテーテルを血管の内腔に保持しながら、尾側結紮糸を締め、カテーテルの固定リングの上に追加の結び目を結びます。
  5. 注射器に少量の血液を吸引してカテーテルの開存性を確認し、カテーテルを再度洗い流します。固定リングから2〜3 cmの滑らかなニードルホルダーでカテーテルをクランプします。鈍い針と注射器をカテーテルから取り外します。
  6. 慎重にネズミをうつ伏せの姿勢に変えます。手術用ハサミを使用して、肩甲骨の間に0.5〜1.0cmの正中線の皮膚切開を行います。止血クランプを背側切開部から腹側切開部に向かって皮下にトンネルします。カテーテルの外側の端をつかみ、皮下トンネルに注意深く通し、肩甲骨間領域に引き出します。
  7. カテーテルの外側の端に2mLのシリンジを取り付けた鈍い針を挿入します。
  8. 非外傷性針と4-0モノフィラメント縫合糸を使用して、腹側および背側の外科創を閉じます。

5.侵襲的血圧測定

  1. 侵襲的血圧測定システムから校正されたトランスデューサーに、ヘパリン化生理食塩水(5 IUヘパリン/ 1 mL)を充填します。
  2. 動物を腹側の位置に置きます。2 mLシリンジを鈍針から外し、カテーテルをトランスデューサーに接続します(図2)。カテーテルからクランプを取り外し、0.1〜0.2 mLのヘパリン化生理食塩水で血圧ラインを洗い流します。
  3. データ収集システムを使用して、血圧と心拍数を測定および記録します。血圧波形(振幅10〜15 mm Hg以上)の明確な脈動は、カテーテルの開存性と正しい位置を示しています。
    注:血圧を正確に測定するには、トランスデューサーを動物の心臓の高さに配置する必要があります。血圧測定線に気泡が現れた場合は、内臓の空気塞栓症を避けるために気泡を取り除いてください。
  4. 平均動脈圧(MAP)およびその他のベースラインの生理学的変数を測定する前に、麻酔した動物を15〜20分間安定させます。
  5. データ収集ソフトウェアアプリケーションを開きます。 [ファイル ] メニューから [ 新規] を選択します。
  6. 正しい物理入力(入力1など)が選択されていることを確認します。対応するチャネル(チャネル1など)ヘッダーのドロップダウンメニューの矢印をクリックし、[ チャネル設定]を選択します。
  7. ダイアログボックスで、予想される信号に合わせて電圧範囲(±100 mV)を調整します。表示単位をmmHgに設定します。
  8. サンプリングレートの調整: ツールバーの「 サンプリングレート」 ボタンをクリックします。侵襲的な血圧の場合は、サンプリングレートを200Hz(200サンプル/秒)に設定します。研究目的に脈波形態解析が含まれる場合は、サンプリング レートを 1 kHz に上げます。
  9. [ 開始] ボタンをクリックして、実験データの記録を開始します。
  10. 目的のデータセグメントがキャプチャされたら、[ 停止] ボタンをクリックします。 ファイル |名前を付けて保存... 一意のファイル名を付けます。

6. LSCIを用いた皮膚灌流測定

  1. ネズミの後ろ足の足底面を水に浸したガーゼで拭き、皮膚をきれいにします。
    注:皮膚の充血を引き起こす可能性のあるアルコールやその他の溶液は使用しないでください。
  2. 空気圧カフをラットの後足の脛骨と腓腹筋の高さに置きます。
    注意: カフの内腔から指と足首を挿入するときは、膨張式メンブレンを損傷したり、膝の軟部組織を圧迫したりしないように注意してください。
  3. ラットの足をガーゼの上に置き、さらにつま先を粘着テープで固定して、動きのアーティファクトを最小限に抑えます(図2)。
  4. LSCI法を使用して皮膚灌流を記録するためのデータ収集ハードウェアとソフトウェアを準備します。
    注:提示された作業では、ハードウェアは高速近赤外線(NIR)モノクロカメラ、カメラ対物レンズ、NIR線形偏光子、およびディフューザーセットを備えたレーザー光源で構成されています。ソフトウェアは、指定された フレームレート(毎秒90フレーム) と 露光時間(11ミリ秒)でフレームをキャプチャするビデオ録画ツールで構成されています。カメラの視野である領域の実際の寸法は 16 x 16 mm です。
  5. 関心のある領域(足根骨と中足骨)がカメラの対物レンズの焦点にあることを確認してください。
  6. 照明が均一で、関心のある領域全体にわたって過剰にならないようにレーザー光源を調整します。
  7. 測定対象物からの鏡面反射が最小限に抑えられるように、線形偏光子を調整します。
  8. ビデオ録画ツールのパラメーターが正しく設定されていることを確認してから、[ キャプチャ] ボタンをクリックして、生のモノクロ画像を30秒間記録します(ベースライン記録は、多かれ少なかれ可能です)。画像を使用して、スペックル灌流値を計算します(以下の式(2)を参照)。
    注:この研究では、特別に開発された実験セットアップが使用されましたが、LSCI法を実装する市販のデバイスを利用して、このプロトコルに従って測定を行うことができます。得られた結果に対する外部照明の影響を最小限に抑えるために、暗い部屋でLSCI測定を実行することをお勧めします。

7. 血管閉塞検査とPORH評価

  1. ゴムポンプのリリーフバルブを閉じます。
  2. ベースラインの皮膚灌流(安静時)をキャプチャした後、動物の手足の空気圧カフを動物の収縮期血圧よりも高い圧力(手足の損傷を引き起こすことなく動脈および静脈の血流を確実に閉塞するために通常200〜220 mmHg)まで急速に膨らませます。
  3. 皮膚 LSCI 信号を 180 秒 (研究の目的に応じて 30-300 秒) 記録を続けて血管閉塞を確認し、その後スペックル灌流の「生物学的ゼロ」を決定します。
  4. 目標の閉塞時間に達した後、カフを急速に収縮させ、皮膚 LSCI 信号をさらに 180 秒間 (多かれ少なかれ) 記録し続けて、PORH ダイナミクスを記録します。
  5. 血管閉塞前、閉塞中、および閉塞後に皮膚灌流評価と同時に侵襲性動脈圧波形を記録します。これらのデータを使用して、MAPと皮膚血管コンダクタンスを計算します(以下を参照)。
  6. ソフトウェア環境で記述されたアルゴリズムを使用してスペックル灌流値を取得します。最初のステップは、生のモノクロ画像をスペックルコントラスト画像に変換することです。式(1)を使用して平均スペックルコントラストを計算します。
    figure-protocol-1    (1)
    ここで、強度は、特定の時間における各ピクセルの強度です。
    注:コントラストが計算される画像の数は、処理の結果に大きく影響する可能性があります。この研究では、平均 90 枚以上の画像を使用する時間的 LSCI アルゴリズムが使用されました。
  7. 式 (2) を使用して、スペックル コントラストの値をスペックル灌流値に変換します。
    figure-protocol-2  (2)
  8. (この長方形の領域内)でスペックル灌流値を平均化するための対象領域(足根骨と中足骨)を含む長方形の領域を選択します。このような手順によって得られたスペックル灌流の時間発展(グラフ)を使用して、研究されたパラメータをさらに計算します。
  9. 測定された皮膚灌流値に基づいて、主要なPORHパラメータを計算します( 図3)。
  10. 式 (3) を使用して皮膚血管コンダクタンス (CVC) を計算します。
    figure-protocol-3   (3)
    ここで、LSCI安静は ベースラインで記録された皮膚斑点灌流の平均値です (任意の単位 = AU)。MAP は、同じ期間に記録された平均動脈圧 (mmHg) です。
  11. 式 (3) を使用してピーク皮膚血管コンダクタンス (CVCmax) を計算し、ピーク充血 (LSCImax) と MAP の適切な値を代入します。

8. 実験手順と繰り返し測定

  1. ベースラインで皮膚灌流、PORH、およびその他の関心のある生理学的変数を記録した後、承認された研究プロトコルに従って実験的介入を実行します (たとえば、病理学的プロセスのモデリングおよび/または血管作動薬の投与)。
  2. シミュレートされた病理学的プロセスの発達または投与された薬物の効果の達成後の次の研究時点で、PORH およびその他の生理学的変数を再評価します。

9. 実験終了

  1. 急性期実験が完了したら、深部全身麻酔(チレタミン+ゾラゼパムおよびキシラジン)下で2%リドカイン(2 mL)の動脈内注射によりラットを安楽死させます。現地の法律およびプロトコルに応じて、施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認された実験用げっ歯類に対する人道的安楽死の代替方法を使用します。
    注:生存手順と麻酔からの動物の計画的な回復のために、低体温症の予防と適切な術後鎮痛(例:ケトプロフェン5-10 mg / kg IM)を含む、動物の状態の適切なケアと定期的な評価を提供します。

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結果

上記の微小血管機能評価方法は、体重250〜300 gのWistar雄ラットにおける出血性ショック(計算された血液量の35%の失血)のモデリングを伴う一連の実験に適用されました。出血のある動物のグループ(HS、n = 13)では、出血の完了から30分後に侵襲性血圧の同時モニタリングを伴うPORHパラメータの評価が行われました。偽手術動物の対照群(偽、n = 10)では、出血は誘発されませんでしたが、同様の期間にわたって同じ測定が行われました。グループ間の差は、マンホイットニー のU 検定を使用して分析されました。結果は中央値と四分位範囲として表されます。

図4は、動物の対照群と比較して、急性失血によって誘発されるPORH(血管閉塞の180秒後)の変化を示しています。失血後の出血性ショックは、動脈性低血圧の発症によって確認されました (MAP は 61 [49;63] HS の ...

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ディスカッション

ここでは、げっ歯類の in vivo 実験で皮膚微小循環と血管反応性を評価するための近代化された技術について説明します。生理学的および薬理学的研究でこの方法を標準化して使用するには、いくつかの追加の考慮事項を考慮する必要があります。上記のプロトコルでは、ラットはチルタミン + ゾラゼパム + キシラジンの組み合わせで麻酔されますが、これは主に実験動物を扱うための地域の基準によって規定されており、ブプレノルフィン、ケタミン、およびその他の一般的に使用される注射可能な鎮痛薬および麻酔薬へのアクセスが制限されています。軽度の手術を伴う薬理学的研究では、適切な機器が利用可能な場合は、イソフルラン/セボフルラン単剤麻酔が好ましい。異なる麻酔レジメンが血行動態パラメーターに影響を与える可能性がありますが、この研究では注射麻酔と吸入麻酔の直接比較は行われませんでした。すべての実験グループで同じ注射プロトコルを使用することで、一貫性が維持されました。」

提案されたプロトコルは急性実験の実現を対象としていますが、麻酔から動物を目覚め...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、プロジェクト 24-25-00310 の下でロシア科学財団によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
外科用縫合糸ナイロン製非外傷性針、4C-0.5x16-4/0-NMedtekhnika, ロシア該当なし青い。長さ75cm。USP 4/0(MP1.5)。手術創の縫合用
ラット頸動脈用カテーテル、鈍端シリンジ針付き 22 GSciCat、ロシア 該当なしPE-50、長さ12cm、外径=0.9mm、内径=0.6mm。固定リング1個付き
Deltran 使い捨て圧力トランスデューサユタメディカルプロダクツ、米国 606912インチケーブル
DiscofixC 輸液療法とモニタリング用3ウェイ活栓B. ブラウン、ドイツ 16494C
ヘパリンBelmedpreparaty、ベラルーシ 該当なしヘパリンナトリウム5000 IU / ml、アンプル5 mL
リドカインVelpharm, ロシア該当なし注射液20 mg / mL、アンプル2 mL
空気圧式カフ「収縮期」ニューロボティクス、ロシア該当なしげっ歯類の非侵襲的血圧測定の一部。タイプ5-10mm尾(ラット)
塩化ナトリウムPharmasyntez、ロシア 該当なし注入用溶液 0.9%、250 mL
ソフトウェアラボチャート8 ADInstruments, オーストラリア該当なしバージョン 8.1.13
ソフトウェア MATLAB MathWorks Inc.、米国該当なし バージョン R2019b
使い捨て滅菌シリンジ、1 mL、3液型Huaian City Hengchun Medical Product Co. Ltd.、中国該当なし 27G針
使い捨て滅菌シリンジ、2 (2.5) mL、3液型Vogt Medical Vertrieb GmbH、ドイツ131052423G針
縫合糸 SILK-SPolytechmed、ロシア 該当なし非吸収性、編組、シリコンコーティングを施した天然シルク製、カセットの黒色。USP 4/0 (MP1.5)。長さ100m。結紮血管用
ザイラInterchemie, オランダ該当なし キシラジン 20 mg/mL、50 mL
ゾレチル 100Virbac、フランス 該当なし 塩酸チルタミン 50 mg/mL、塩酸ゾラゼパム 50 mg/mL、5 mL

参考文献

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