下肢動脈硬化性閉鎖性糖尿病ラットモデルの確立と評価

サマリー

下肢動脈硬化症は糖尿病の一般的な合併症です。ここでは、動脈硬化性閉塞性疾患の進行を血管に注入して血管構造を破壊し、血管疾患治療の新たなプラットフォームを提供する新しい動物モデリング手法を提示します。

要約

本研究は、糖尿病ラットにおける下肢動脈硬化症(ASO)の新規ラットモデルの確立と検証を目指しました。従来の大腿動脈結紮とは異なり、外腸骨動脈に95%エタノール(0.1 mL)を注射しました。術後、1日目、3日目、7日目、14日目にドップラー超音波、サーマル画像、湿式筋量測定を用いて動脈閉塞および後肢虚血を評価しました。血管および筋肉組織の組織学的解析を行い、モデルの成功率と安定性を評価しました。高濃度エタノール(95%)は血管内皮細胞の損傷を誘発し、大腿動脈閉塞を引き起こします。対照群と比較して、ドップラー超音波検査では影響を受けた肢の動脈径が徐々に減少し、流速が増加することが認められました。サーマルイメージングでは四肢の温度低下が示され、筋体重測定では同側の筋肉量が有意に減少していることが示されました。組織病理学的解析により、動脈内腔閉塞、微小血管密度の低下、経過による病変の進行性悪化が確認されました。結論として、95%エタノールの腸骨動脈注射は下肢動脈閉塞の病態生理学的特徴を効果的に再現し、糖尿病ラットにおける閉塞性動脈硬化の研究に新しいモデルを提供します。

概要

糖尿病下肢動脈閉塞(DLEAO)は糖尿病患者の障害および死亡の主な原因であり、生活の質を著しく低下させ、社会経済的負担を大きく引き起こします^。糖尿病性動脈疾患の病因は、高血糖、脂質異常、慢性炎症、血管機能障害の複雑な相互作用を含みます^。動物モデルはこれらのメカニズムの解明に重要な役割を果たし、治療開発に重要な洞察をもたらしています。動物モデルは、ヒト糖尿病患者の末梢動脈疾患(PAD)の病態生理をシミュレートする貴重なツールとして機能します。これらのモデルにより、高スループットかつ再現性の高い研究が可能となり、疾患の進行を調査し、その基礎となるメカニズムを明らかにします。さらに、動物モデルを用いた前臨床試験は、薬理学的薬剤、遺伝子治療、再生医療アプローチ(例:幹細胞^{療法)など}、新規治療に不可欠なデータを提供します3。このような基礎研究は、その後の臨床試験の情報提供やトランスレーショナル医療の発展に不可欠です。

現在、大腿動脈結紮法(FAL)は後肢虚血のラットモデルを構築するために実験室で広く用い^{られています。}このアプローチは下肢に虚血症状を急速に誘発^します5;しかし、その結果生じる動脈血栓症は、下肢動脈疾患(LEAD)を伴う糖尿病患者で観察される病態生理的進行とは異なります。LEADは内皮損傷、炎症因子の蓄積、平滑筋細胞の増殖を伴います^2,6。さらに、FALは急速な新生血管形成と側副血管形成を引き起こし、モデル^5,7の直後に低流量灌流を回復させます。これは糖尿病性鉛の慢性進行とは対照的です。したがって、ヒト動脈硬化の病態生理学的メカニズムをより正確に再現する動物モデルの開発が必要です。

糖尿病動物モデルでは、バルーンカテーテルや化学的誘導(例:塩化鉄刺激)による大腿動脈の内膜機械的損傷は、内皮剥離、炎症細胞浸潤、平滑筋細胞の移動・増殖などの病理学的変化を効果的に引き起こし^ます。このアプローチは、ヒト動脈硬化の特徴的な病理的特徴をよりよく再現します。従来のFALモデルと比較して、エタノール誘発法の核心的な利点は、糖尿病性LEADの複雑な病態生理過程をより正確にシミュレートできる点にあります。エタノールは血管内皮を直接破壊し、血小板凝集と血栓形成を活性化し、糖尿病のLEAD⁹における初期反応を模倣します。さらに重要なのは、血管微細構造を徐々に破壊することで、FALモデルで一般的に見られる急速な側副循環補償を効果的に回避し、糖尿病性LEAD¹⁰の典型的な慢性低灌流状態を成功裏に再現することです。対照的に、大腿動脈結紮による虚血モデルには顕著な限界があります。齧歯類(例:マウス、ラット)は発達した側副循環により急性虚血を迅速に補償し、虚血の重症度が不安定でヒト臨界四肢虚血(CLI)の再発が不十分です^11,12。さらに、ヒト末梢動脈疾患(PAD)は主に動脈硬化の慢性進行に起因するのに対し、大腿動脈結紮モデルは急性虚血性イベントを表しており、根本的に異なる病態生理的メカニズム^{を持っています。}本研究の主な目的は、患者の病況進行を正確に模倣する、安定的かつ長期にわたる糖尿病下肢動脈硬化症(LEAOD)の実験モデルを確立し特徴づけることでした。エタノール誘発閉塞は操作上は単純で、低侵襲注射のみで済むため、技術的な障壁と動物の死亡率を低減します。その主要パラメータは容易に標準化されており、高い再現性を確保しています。さらに、この方法はコスト効率が良く、専門機器の必要性がなく、実験室間で容易に移行可能です。現在、新規治療介入を検証するための持続的な動物モデルは依然として不足しています。

プロトコル

本研究は煙台玉黄頂病院動物倫理委員会の承認プロトコルのもとで実施されました。本研究では、12時間の明暗サイクルで飼育された40匹のオスのスプラグ・ドーリーラット(体重:250〜300g、年齢:6週)を用いました。生後7週から高脂肪・高ショ糖の食事が自由に与えられ、8週間は水を自由に提供しました。食事開始から4週間目に、ストレプトゾトシン(STZ)注射¹⁶によって糖尿病が誘発されました。8週間後、糖尿病モデルの確立が成功していることが確認され、その後の実験に臨みました。後肢動脈閉塞手術は、以下に説明する14週齢のラットに対して行われました。

1. 糖尿病ラットにおける後肢動脈硬化の外科的誘導

1. すべての手術器具および材料を、材料 表 および 図1に示した通りに準備してください。
2. 麻酔装置でイソフルラン(1.5-2.5%)と酸素(_O2、1-2 L/min)を投与してラットを麻酔します。呼吸は自然に維持してください。つま先のつまみ反射を使って麻酔の深さを評価し、手術面の麻酔を確保しましょう。
3. ネズミを拘束台の上で仰向けにします。除毛クリームとカミソリの刃を使って腹部から下肢の毛を除去します。
4. 手足を固定しろ。後肢の皮膚をアルコールで消毒してください。曲がったピンセットとハサミを使って右太ももの内側に2〜3cmの切開を入れます。
   注:すべての外科手術は、動物モデルの一貫性と再現性を確保するために経験豊富な外科医によって実施されました。
5. 顕微鏡で周囲の組織を解剖し、外腸骨動脈/静脈と大腿神経を露出させます。血管と神経を隔離してください。外腸骨動脈が浅大腿動脈と深部大腿動脈に分岐するまでの経緯をたどります。
6. 大腿動脈の中間部分と深部大腿動脈を血管クリップでクランプします。ゆっくりと95%エタノール0.1mLを遠位外腸骨動脈に注入します。60秒後、クリップを外します。圧迫によって止血を達成します。傷を一層ずつ閉じていきましょう。
   注:注射中、動脈の即時白化と同側足の一時的な震えが観察され、血管内エタノール投与が成功したことが確認されました。
7. 術後は影響を受けた四肢を固定しないでください。感染を防ぐために、ペニシリンナトリウム注射(400,000 IU)を筋肉内投与してください。
   注:この片側下肢動脈閉塞モデルでは、対側の四肢が対照群として機能します。閉塞時間は処置後24時間から計算されます。

2. 下肢温度の測定

1. ラットを麻酔し、手術台の上で仰向けにします。
2. 後ろ肢は両方剃り、左右対称に配置してください。
3. 赤外線サーモグラフィーシステムを使って両後肢の温度を測定します。

3. 動脈径と血流速度

1. ネズミに麻酔をかけろ。
2. 超音波装置とプローブを準備しろ。
   1. 超音波検査機は前面パネルの電源ボタンを押して起動します。
   2. 高周波リニアアレイプローブ(例:40 MHz)を選択し、システムに接続します。
   3. プローブ表面にたっぷりと音響結合ジェルを塗布します。
3. 浅大腿動脈の位置を特定してください。
   1. 体温を保つために、ラットを温めパッドの上に仰向けに置きます。
   2. 内側太ももの毛を両側、膝関節の約1〜2cmの位置で電動クリッパーで剃ります。
   3. プローブを皮膚表面に対して垂直に優しく置き、剃った部分の上に置きます。
   4. プローブの位置をBモードで調整し、大腿動脈を脈動性の無響管状構造として視覚化します。
4. 動脈の直径を測ってください。
   1. Bモード映像を凍結するには、マシンやソフトウェアインターフェースの 「フリーズ 」ボタンを押してください。
   2. 画面上のメニューから 測定ツール を選択します。
   3. キャリパー関数を使って、動脈の近い壁から遠い壁までの内径を測定します。
   4. 同じ場所で3回測定を繰り返し、平均値を記録します。
5. 血流速度を測定してください。
   1. PWドップラーアイコンをクリックしてパルス波ドップラーモードに切り替えます。
   2. サンプルゲートを動脈内腔の中心に位置させます。
   3. 角度補正ツールを使ってドップラー角度を≤60°に調整します。
   4. 更新またはキャプチャを押して、少なくとも3つの心拍サイクルにわたる速度波形を記録します。
   5. ソフトウェアの 自動トレーシング機能 を使って、収縮期のピーク速度(PSV)と拡張末期速度(EDV)を計算してください。
   6. 保存をクリックしてデータを 保存し、 結果をスプレッドシート(例:CSV、Excel)ファイルにエクスポートします。

4. 筋肉計量

1. 深麻酔後、頸椎脱臼による安楽死。
2. 両後肢の腓腹筋を切り離し、アキレス腱を保存します(図2)。
3. すぐに筋肉を電子天秤に置いて、濡れた体重を測ります。
4. 対側の筋肉をコントロールとして使います。
5. 4つの時点からの測定値を比較し、曲線グラフで提示します。

5. 組織病理学的解析

1. 4つの時点で、1群のラットを迅速に安楽死させてください。
2. すぐに両側の浅大腿動脈を摘出してください。
3. 動脈組織を4%のパラホルマルデヒドで固定します。
4. 組織をパラフィンに埋め込み、厚さ5μmで切片します。
5. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行い、組織病理学的変化を調べます。

6. 統計分析

1. すべてのデータは平均±標準偏差(SD)として表します。p値<0.05で統計的に有意な差を考えます。

結果

本研究では、動脈内エタノール注射を用いて糖尿病性SDラット(n = 40)モデルを構築しました。このモデルは、注射後14日以内に超音波で反対側動脈径および血流速度の減少を確認した結果、85%の成功率(33/40)を特徴としました。モデル関連の死亡率は主に初期期間に8%(5/40)を記録しました。エタノールの細胞毒性は壊疽などの非特異的組織損傷のリスクを伴うものの、注意深いモニタリングにより、直径と流量の減少が主な意図された効果であることが確認されました。グループ間での再現性は良好で(グループ間変動<15%)にもかかわらず、これらの変化の大きさには個人間変動が明らかでした。

下肢温度結果の解析
サーモグラフィー画像では、手術した後肢の温度が対側に比べて低下していることが明らかになりました。影響を受けた肢と非影響を受けた肢体の体温差は時間とともに徐々に大きくなり、手術側の体温低下はより顕著でした。この四肢温度の低下は、血管灌流が不十分であることを示し、基準温度調節を維持できていないことを示しています(

ディスカッション

まとめると、糖尿病患者で観察される臨床症状に非常に近い進行性動脈閉塞のラットモデルを確立することに成功しました。後肢低灌流の一貫した評価は、超音波測定および2週間を超える筋肉湿体重評価を用いています。大腿動脈の結紮により浅い血管閉塞が誘発され、深部静脈系の完全な血液循環が可能になりました¹⁷。近位動脈やその枝で結紮を行うと、側支血流が減少し、重度の虚血性症状を引き起こします。しかし、同じ動脈が異なる個体で同一位置に結紮されても、側支血管の個体数や虚血進行の個体間差異が大きいため、虚血損傷の程度は異なります^18,19。

観察される急性虚血は患者の臨床進行と一致しません。大腿動脈結紮後、虚血性後肢の血流は著しく減少し、結紮されていない側の血流の約25%にとどまりました。連続的なLDI測定により^、虚血性血流が時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GraphPadバージョン8.0.1			リド:SCR_002798
電話ベースの赤外線温度計	ヒクマイクロ		HM-TJP10B-3AMF
スプラグ・ドーリーネズミ	濟南鵬岳実験動物育種株式会社		250 g
超音波検査機	ヴェヴォ2100