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方法論記事

ネットワーク薬理学の統合によるシナマルデヒドのオキサリプラチン誘発神経毒性に対する保護効果の調査

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DOI:

10.3791/69013

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2025年11月28日

 ,  ,  , 
1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Medical Oncology, Cancer Hospital of China Medical University, Cancer Hospital of Dalian University of Technology, Liaoning Cancer Hospital & Institute, 2China Medical University, 3Liaoning University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

本研究は、ラット背根神経節(DRG)細胞におけるオキサリプラチン(OXA)誘発ダメージに対するシナマルデヒド(CA)の保護効果を調査します。その基礎となるメカニズムは、ネットワーク薬理学および実験的検証を通じて明らかになったJAK2/STAT3シグナル伝達経路の抑制とSLC7A11-GSH-GPX4経路の活性化にあります。

要約

本研究は、ラット背根神経節(DRG)細胞におけるオキサリプラチン(OXA)誘発ダメージに対するシナマルデヒド(CA)の保護効果を調査します。CAの薬理学的活動が分析され、その潜在的なターゲットおよび代謝物は、伝統中医学システム薬理学データベース・分析プラットフォーム(TCMSP)、統合薬理学ベースの伝統中医学ネットワーク計算研究プラットフォーム(TCMIP)、およびPharmMapperプラットフォームを用いて特定されました。CCK-8アッセイは薬剤の最適濃度を決定するために用いられ、一方でマロンジアルデヒド(MDA)アッセイは脂質過酸化のレベルを評価するために適用されます。細胞内のFe2+ および活性酸素種(ROS)のレベルは蛍光プローブを用いて定量化されました。OXA処理DRG細胞におけるp-STAT3、XCT、GPX4を含むタンパク質発現レベルに対するCAの影響を免疫ブロッティング を通じて 調査しました。ネットワーク薬理学解析により、「CA-神経障害性疼痛(NP)-フェルポトーシス」における14の重複標的が特定されました。実験結果により、4.0 μmol/LのCAを用いた24時間処理が最適な効果をもたらし、DRG細胞内のMDA、Fe2+、ROSレベルを大幅に低下させることが示されました(P < 0.05)。さらに、CA処理はJAK2、STAT3、p-STAT3、TFRC、ErbB-1、核因子κB(NF-κB)(P < 0.05)の発現をダウンレギュレーションし、XCT、GPX4、FTH1の発現(P < 0.05)をアップレギュレーションしました。これらの発見は、CAがJAK2/STAT3シグナル伝達経路を阻害し、SLC7A11-GSH-GPX4軸を活性化することでDRG細胞におけるOXA誘発性の損傷を緩和することを示唆しています。

概要

近年、フェロプトーシスは非細胞死の一種として、さまざまな化学療法薬によって誘発される組織損傷に関与することが証明されています。フェロプトーシスの核心的なメカニズムは、鉄依存性脂質過酸化生成物の蓄積です。シスプラチン神経毒性のメカニズムに関する研究では、この薬剤が複数の経路を通じて神経細胞フェロプトーシスを誘発し、この過程が神経毒性の発症に直接結びついていることが明らかになりました。具体的には、シスプラチンはグルタチオンペルオキシダーゼ4(GPX4)活性を阻害します。フェロプトーシスにおける重要な「ブレーキ分子」として、GPX4の不活化は脂質過酸化物(L-OOH)の除去を妨げ、神経細胞膜に酸化的損傷をもたらします2。一方、オキサリプラチンは神経細胞内のフェロプトーシスの放出を促進し、フェントン反応を通じて活性酸素種(ROS)の生成を悪化させることで、フェロプトーシスのカスケードをさらに増幅します。この証拠は、神経変性の標的制御がオキサリプラチンの神経毒性を緩和する潜在的な戦略である可能性を示唆しています。

オキサリプラチン(OXA)は、大腸がんに対する広く使われている第三世代のプラチナ系化学療法薬で、強力な抗腫瘍効果を示しますが、しばしば重大な神経毒性と関連しています。慢性投与はしばしばOXA誘発性神経障害性疼痛(OINP)を引き起こし、発生率は60%に達します4、機械的異痛症、熱痛覚過敏、冷性過敏症が特徴です5。OINPの有病率にもかかわらず、現在の治療戦略は不十分であり、患者の生活の質を大幅に低下させています。したがって、OINPの分子メカニズムの解明と新規治療標的の特定は、継続中の重要な研究分野です。

シナマルデヒド(CA)はシナモンエッセンシャルオイルの主要な有効成分であり、黄色で粘性のある液体7,8を持ち、殺虫剤9、抗菌剤10、抗真菌11、抗酸化剤12、抗糖尿病13、抗がん14、抗炎症作用、神経血管保護効果15,16.新たな証拠は、CAがJAK/STATシグナル伝達経路17の活性化を阻害する可能性を示唆しています。CAの化学式はC9H8Oで、その化学構造は図1に示されています。伝統中国医学の天然モノマーとして、CAは幅広い薬理学的活動を示します。神経保護の観点から、多くの研究でCAは血脳関門を通じて中枢神経系に侵入し、Nrf2/AREシグナル伝達経路を活性化して抗酸化酵素(HO-1やNQO1など)の発現を促進し、神経細胞内のROSの蓄積を減少させ、虚血性脳卒中における神経酸化的損傷を緩和できることが確認されています。 アルツハイマー病およびその他の疾患18,19。同時に、CAはミクログリアの過剰活性化を抑制し、炎症因子(TNF-α、IL-1βなど)の放出を減少させ、神経炎症反応を減少させることができます20。しかし、CAがフェロトーシス経路を調節することでオキサリプラチンによる神経毒性を緩和できるかどうかは報告されていません。

JAK2/STAT3シグナル伝達経路は、細胞膜で受信した信号を細胞核に伝達する重要な細胞内シグナル伝達機構であり、細胞増殖、分化、アポトーシス、酸化ストレス、炎症反応などの主要な生物学的プロセスと密接に関連しています21。炎症反応と密接に関連する経路として、JAK3/STAT3シグナル伝達経路は活性化状態で炎症反応を引き起こし、組織の炎症損傷を引き起こすことがあります。研究によると、血管性認知症のラットにおけるJAK3/STAT3シグナル伝達経路の阻害は炎症反応や酸化損傷を軽減し、認知機能の改善につながることが示されています22。さらに、JAK3/STAT3シグナル伝達経路の阻害はてんかんラットの炎症反応を緩和し、神経細胞アポトーシスの発生率を減少させ、脳損傷を軽減することも可能です。カフェイン酸(CA)は神経系に一定の保護効果を持っていますが、その改善効果がJAK3/STAT3シグナル伝達経路の調節に関連しているかどうかは、現時点で明確に結論づけられていません。

本研究は、ジャック2/STAT3シグナル伝達の in vitro 阻害およびLC7A11-GSH-GPX4軸の活性化が、ラットDRG細胞におけるOXA誘発性損傷を軽減できるかどうかを検証することを目的としています。さらに、CAの潜在的な抗フェロプト効果を探り、ネットワーク薬理学を通じて特定された主要標的がDRG細胞の炎症調節に果たす役割を検証しています。

現在のオキサリプラチン誘発神経毒性の治療法は、主にキレートフリープラチナイオンを中心に神経損傷を軽減することに焦点を当てており、カルシウムマグネシウム複合体の使用などが挙げられます。主な目的は、急性末梢神経障害(例:手足のしびれやしびれ)の緩和です24。しかし、正確なメカニズムは依然として明確ではありません。これらの治療は、オキサリプラチンによって引き起こされる軸索変性や神経線維の劣化などの慢性疾患を逆転させる能力がなく、累積的な神経毒性の予防効果も限定的です。本実験では、5μM OXA処理下の4μM CAの神経保護効果を、抗炎症作用と抗フェロトーシス機構を組み合わせて探究しました。この発見は、このメカニズムの活性化がOINPにおける重要な開始段階であることを裏付けています。特異的阻害剤の発見は、既存の非特異的アプローチに取って代わり、治療介入の精度と効果の両方を高める可能性があります。

本実験で用いられた in vitro モデルは、OINPの研究のために単離されたラット背根神経節(DRG)ニューロンを用いています。しかし、このモデルは遺伝的背景、代謝特性、毒性感受性においてヒト一次細胞と大きく異なり、臨床的に直接適用する研究結論を困難にする場合があります。さらに、 生体内 神経組織の機能的維持は多細胞協調や動的微小環境の精密な調節に依存しており、これらはin vitro モデルを完全に再現するのが難しい複雑な要因です。

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プロトコル

注:この細胞株はラットの細胞株から派生しました。

1. ネットワーク薬理学解析

注:リンクは 材料表に記載されています。

  1. CAの可能な標的の発見
    1. PubChemデータベースから構造情報を取得し、CAの生物学的メカニズムの可能性を探ります。その後、SwissTargetPredictionの高度な計算能力を活用してターゲット予測解析を行います。
    2. 分析の正確性と包括性を高めるために、予測対象をTCMSPやTCMIPを含む中医専用データベースと照合してください。
    3. 関連する文献をレビューし、追加の潜在的な標的を特定しましょう。統合された標的リストを複製して包括的なデータセットを作成し、CAを含むさらなる生物学的活性研究や薬剤開発の重要な参考資料となります。
  2. 神経障害性疼痛(NP)の潜在的な標的の特定
    1. GeneCardsデータベースとTTDデータベースを活用し、「神経障害性疼痛」と「フェロプトーシス」というキーワードを使って広範な検索を行います。GeneCardsデータベースから「関連性スコア」が中央値を超える遺伝子ターゲットを優先してください。これらの遺伝子は研究焦点により関連性が高いことを示します。
    2. 以前に選択された遺伝子標的を、TTD(治療標的データベース)から取得したデータと統合します。統合プロセス中に、すべての選択された遺伝子標的とTTDデータベースのエントリーを照合することで、潜在的な標的の包括的な同定を確保します。統合された遺伝子ターゲットデータセットから重複項目を体系的に除去します。得られるデータセットに潜在的なターゲットのリストが一意であることを確認しましょう。
  3. 「CA-NP-フェロプトーシス」の交差標的の特定
    1. オンラインで生成されたベン図を用いて、CA、NP、フェロプトーシスのターゲットの交差点を特定します。
    2. これらの交差標的は「CA規制NPフェロプトーシス経路」の候補として指定されました。
  4. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの構築
    1. さらに調査するために、「CA-NP-フェロプトーシス」「CA-NP」「CA-フェロプトーシス」の共通標的をSTRINGデータベースに提出してください。
    2. インタラクションスコアの閾値を「最高信頼度>0.4」に設定し、第1層と第2層の両方で最大インタラクター数を10人に制限します。その他のパラメータにはデフォルト設定を適用し、「CA-NP-フェロプトーシス」用に4.5 PPIネットワークを構築します。
  5. GOおよびKEGG濃縮解析
    1. 「CA-NP-フェロプトーシス」の交差ターゲットをDAVIDプラットフォームにアップロードし、以下のパラメータを付けてください:「識別子選択:公式遺伝子シンボル」「リストタイプ:ジェネリスト」「種:ホモ・サピエンス」。遺伝子オントロジー(GO)の濃縮解析は、生物学的プロセス(BP)、細胞成分(CC)、分子機能(MF)の3つのカテゴリーで実施されました。
    2. KEGG経路濃縮解析を行い、Hiplotプラットフォーム上で作成されたバープロットを使って結果データを可視化します。

2. 分子ドッキング

  1. 有効成分とその疾患関連標的との相互作用を明らかにするために、PubChemデータベースから活性物質の構造情報を小分子として取得し、標的タンパク質の3D構造をタンパク質モデルとしてProtein Data Bank(PDB)から取得します。
  2. PyMOLを利用して、水分子や非必須配位子を除去してタンパク質受容体構造を前処理します。その後、ターゲットタンパク質と有効物質をAutoDock Tools 1.5.7でドッキング準備し、AutoDock Vinaで半柔軟な分子ドッキングを実行します。
  3. 受容体タンパク質の結合エネルギーと活性物質結合部位を解析します。JAK2タンパク質の構造(PDB ID: 3e64)はX線結晶学データと最適分解能に基づきPDBデータベースから選定されました。
  4. PyMOLソフトウェアを使って、配位子を除去し、水分子を除去し、水素を加えてJAK2構造を準備します。活性化合物の小分子構造はPubChemから提供されました。
  5. タンパク質と化合物の構造をAutoDock Tools 1.5.7に読み込み、ドッキングボックスを定義し、AutoDock Vinaで分子ドッキングを行います。

3. 細胞培養

注:以下の手順は検証実験で繰り返し使用されます。厳格な無菌技術を守ってください。この実験の部分では低速の水平ローター遠心分離機が使用されました。

  1. 75%アルコール入りの滅菌細胞の外包装と培養ボトルを消毒し、その後、細胞を直径10cmのペトリ皿5皿に広げて十分な細胞在庫を確保するまで、超クリーンな作業台で培養皿に移し、サブカルチャーを行います。
  2. 細胞は-80°Cで凍結保存し、次の実験に備えます。
    1. DMEM、細胞培養グレードDMSO、胎児用牛血清(FBS)、15 mL遠心分離機チューブ、ピペット、クライオビアル、氷浴を準備します。DMSOを1 mL、FBS 1 mL、DMEM 8 mLを混合し、合計体積を10 mLにします。DMSOを氷で15分間冷やします。まずベース培地を遠心分離機チューブに移し、回転しながら予備冷却済みのDMSOをゆっくり加えます。ピペットでよく混ぜ、そっとFBSを加えて再度混ぜます。混合物は氷浴で保存し、後で使うために保管してください。
      注:DMSO濃度が20%〜50%の場合、LDH放出が有意に増加し、高濃度のDMSOは細胞毒性を持ち、10%は比較的安全であることを示しています。これは実験25には影響しませんでした。
    2. 対数増殖する細胞を取り、PBSで3回洗浄し、その後400μL/10cm皿に0.25%のトリプシンを加えます。
      注:細胞質の後退が起こり、接続が緩んだり、大規模な浮遊の兆候が見られると、消化プロセスは即座に停止します。
    3. 前消化準備:キー試薬(0.25%トリプシン-EDTA溶液およびDRG完全培地)を37°Cまで予熱します。 細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出し、残留培地が消化効率に影響しないように滅菌ピペットで古い培地を廃棄します。細胞溶出を防ぎつつ、5mLの滅菌PBSで単層培養細胞を優しく2回洗い流し、残留血清を除去します。
    4. 培養容器に予熱した0.25%トリプシン-EDTA溶液2mLを加え、単一細胞層を完全に覆います。室温で1〜3分間孵育します。この期間中、30秒ごとに逆立顕微鏡で細胞を観察します。ほとんどの細胞が収縮し、丸くなり、明確な細胞間隙を見せ始めたら(過剰消化や細胞損傷を防ぐため)、すぐに消化を止めてください。
    5. 素早く4mLの完全予熱培地を培養容器に加えます。無菌ピペットで混合物を5回優しくピペットし、細胞クラスターを単一細胞懸濁液に分散させます。単一細胞懸濁液全体を無菌の15 mL遠心分離機管に移し、低速水平ローター遠心分離機(25°C)で300 x g 5分の遠心分離で細胞ペレットを収集します。
    6. 上澄液を捨て、準備済みの冷凍保存培地5mLを加えます。ピペットで優しく吹きかけて細胞を均一に混ぜます。均等に5本のバイアルに分けてください。
    7. クリオビアルにセル名、凍結日、オペレーターをラベル付けします。冷凍容器に入れて-80°Cの冷凍庫で保存し、一晩の保存後に液体窒素に移します。
  3. 細胞蘇生
    1. 手袋を着用し、液体窒素容器からバイアルを取り出し、すぐに37°Cの温かい水に浸し、時折振って1分以内に速やかに解凍させます。
    2. 37°Cの水浴からバイアルを取り出し、キャップを開けてピペットで細胞懸濁液を吸引し、遠心分離機チューブに移し、培養液の体積を10倍に加え、よく混ぜて300 x g で5分(25°C)遠心分離します。
    3. 上澄液を捨て、10%胎児用牛血清(この細胞培養の完全な培地)を補足した培地5mLを加え、培養皿に接種し、37°C、湿度95%、CO25 %の培養盤で静的に培養します。
    4. 翌日に培養培地を交換し(残留DMSOや死細胞を除去するため)、培養の観察を続けて成長状態を確認しましょう。細胞密度が高い場合は、次の実験のために迅速にサブカルチャーを行いましょう。
  4. 細胞計数
    注:この実験の部分では低速の水平ローター遠心分離機が使用されました。
    1. 数える室とカバースリップを清掃するために事前に75%アルコールを用意し、後で使うために乾燥させます。
    2. 消化・遠心分離した細胞を1 mLの培地に再懸浮させ、細胞懸濁液50 μLを1.5 mLのEPチューブで150 μLの培地で希釈して4倍の希釈を行います。
    3. 均等に振動させ、10μLを取り、カバースリップとカウントチャンバーの間に注入して、気泡を避けつつチャンバーを完全に満たします。顕微鏡の下に置いて観察と数えを取る。カウントの原則:省略や再カウントを行わないこと;上下および左の境界に接するセルはカウントしますが、下および右の境界に接するセルは除外します。
    4. 実験要件に従い、プレートまたは皿シード用の所望セルカウントとカウント結果に基づいてセル体積を計算し、その後全培地を補足します。

4. 細胞生存率アッセイプロトコル

注:デュロキセチンが西洋医学のコントロール薬として選ばれたのは、末梢神経障害性疼痛の治療に広く使用され臨床的に検証された薬であるためです。この適応症における有効性が確立されており(臨床実践ガイドラインおよびランダム化比較試験によって裏付けられているため)、対照群は検査介入の相対的有効性を評価するための信頼できる参照を提供できます。

  1. まず、古い培地を培養容器から捨て、細胞表面を5mLのPBSで洗い流して残留血清を除去します。次に、0.25%トリプシン-EDTA溶液2mLを加え、室温で1〜3分間培養します。顕微鏡観察で細胞の縮小、丸み、剥離が確認された場合は、直ちに4 mLのDRG完全培地を加えて消化を終え、ピペッティングで細胞を再懸浮させます。
  2. セル懸流液を遠心分離機管に移し、低速水平ローター遠心機(25°C)で300 x g で5分間遠心分離してセルペレットを収集します。 上澄液を捨て、細胞ペレットを15 mLの遠心分離管に再懸濁させ、その後十分に再懸濁して懸濁液を混合します。
  3. 1.5mLのEPチューブを取り、まず培地150μLを加え、その後細胞懸濁液50μLを加えます。よく混ぜて4倍の希釈を達成します。
  4. その後、75%アルコールでカウントチャンバーを清掃し、ガラスを覆い、乾かしてEPチューブを均等に振って再度振ります。
  5. 10μLのセル懸濁液を取り出し、カバーガラスとカウントチャンバーの間に注入し、液体がカウンティングチャンバーに満ちて気泡を発生させないようにします。
  6. 顕微鏡で観察し、カウント原理に従って細胞数を数え、省略や重複を避けてください。
    注:カウントされた細胞数がnの場合、遠心分離管内の細胞濃度はn/mLとなります。
  7. 実験要件に従い、96ウェルプレートに1井戸あたり2,000セルの密度でシードを行います。
  8. まず、96ウェルプレートの周辺円の各ウェルに200μLのPBSを注入し、グループ分けに従って細胞含有培地を加えます。
  9. 37°C、湿度95%、CO25 %で24時間培養した後、古い培地を吸引し、PBS200μLで2回洗浄します。実験装置によれば、CAを段階的に希釈(0 μM、2 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM)し、96ウェルプレートに200 μLを加えます。
  10. 細胞はOXA(5μM)で24時間前処理し、その後DRG細胞には異なる濃度のCA(0μM、2μM、4μM、8μM、16μM、32μM)でそれぞれ24時間処理します。
    注:この実験のセクションは、CAの最適な薬物濃度を決定することを目的としています。
  11. 96ウェルプレートをPBSバッファーで3回洗浄し、各ウェルに新たに調製したCCK-8作業液200μLを加えます。この工程は暗闇の中で行われ、実験時間は10分以内に完了するよう制御されています。溶液を37°C、湿度95%、CO25 %のインキュベーターで4時間培養します。最後に、マイクロプレートリーダーを使って吸光度値を測定します。すべての実験を同じ条件下で少なくとも3回繰り返してください。

5. 開発開発局(MDA)

  1. 15cmの皿に10個×6個のDRG 細胞を種付けし、37°C、湿度95%、CO25 %の培養箱で一晩培養します。培地を取り出し、薬剤を加え、37°C、湿度95%、CO25 %のインキュベーターで24時間培養します。
  2. 培地を取り出し、PBS5mLで一度洗浄します。消化後、DMEM培地を使って細胞を円錐形の管に集めます。
  3. 処理済みのDRGセルをそれぞれ5 mLのマイクロチューブに加えます。低速の水平ローター遠心分離機で300 x g で5分間遠心分離し、上清液を除去します。次にPBSを1mL加え、ピペッティングで混合し、新しい1.5mLマイクロチューブに移します。低速の水平ローター遠心分離機で300 x g で5分間遠心分離し、上清液を除去します。
  4. 抗酸化PBS溶液100μLを加え、ピペットで混合し、細胞懸濁液を準備します。MDA標準溶液を準備します。
    注:蛍光法を用いた標準MDA溶液の調製を参照してください。詳細な手順はキットの「キットコンポーネント」セクションを参照してください。
  5. サンプルチューブと標準チューブにそれぞれ100μLのリシスバッファーを加え、ボルテックス発振器で十分に混合します。室温で5分間置きます。
  6. 各チューブに準備済みの作業液250 μLを加え、ボルテックスミキサーで十分に混ざります。水浴を自然光の環境で95°Cまで15分間加熱し、その後氷水浴に5分間入れて冷ます。高速角ローター遠心分離機は10,000 x g で10分間(4°C)使用されます。
  7. 100μLの上清液を黒い96ウェルプレートに加えます。蛍光マイクロプレートリーダー(例:540 nm、電磁:590 nm)を使って蛍光強度を測定します。標準曲線に基づいて試料中のMDA濃度を計算します。

6. Fe2+検出キットを用いて測定した細胞内のFe 2+含有量

  1. 水浴を事前に予熱し、温度を37°Cに上げてください。 手袋を着用し、液体窒素からDRGセルを取り出し、ビニール袋で包み、37°Cの温水に浸しながら断続的に優しく揺らして1分以内に完全に解凍させます。
  2. 解凍後、37°Cの水浴からバイアルを取り出し、キャップを開けて細胞懸濁液を吸引し、15 mLの遠心分離機チューブに移し、培地10 mLを滴ごとに加えて十分に混ぜます。低速水平ローター遠心機で300 x g で5分間(25°C)使用。
  3. 遠心分離後、上清液を捨て、新鮮な培地10mLを加え、ピペットで十分に混ぜて再度遠心分離します。この手順を3回繰り返してから新しい培養皿に接種してください。
  4. 細胞を37°C、湿度95%、CO25 %のインキュベーターで静的に培養します。翌日に培地を交換して残留DMSOや死細胞を除去し、その後培養を続けます。細胞密度が高い場合は、サブカルチャーを適時に行います。その後、対数成長期の細胞を集め、消化し、遠心分離し、再懸濁させます。再懸濁した細胞を密度70%〜80%の12ウェルプレートに播種し、その後プレートを37°C、95%湿度、5%CO2 インキュベーターに戻してさらに培養します。
  5. 翌日、細胞の状態を観察し、実験装置に応じて対応する処理を行い、その後37°C、95%湿度、5%CO2 のインキュベーターに戻して培養を継続します。
  6. 24時間の投与後、元の培地を廃棄し、細胞をPBSで一度洗浄します。FerroOrangeプローブ(1μM)をHBSSで希釈した100μL/ウェルを加え、37°C、湿度95%、二酸化炭素5%で30分間培養します。
  7. 次に、Hoechst 33342の生細胞染色液(100倍)を1:100の比率で細胞プレートに加え、室温の暗い環境で5分間培養して細胞核を染色します。
  8. 蛍光顕微鏡で染色効果を観察し、記録のために写真を撮ってください。その後、ImageJを使って平均蛍光強度を計算し、実験を3回繰り返して統計解析を行います。

7. ROS検出キット

  1. 対数成長段階の細胞を取り、消化・遠心分離し、再懸濁させた後、12ウェルプレートに密度(70%〜80%)で細胞をシードします。細胞を十分に混合した後、37°C、湿度95%、CO25 %のインキュベーターに入れて培養を続けます。
    注:消化、遠心分離、再懸濁の各ステップについては、ステップ4.1を参照してください。
  2. 翌日に細胞の状態を観察し、実験装置に応じて対応する処理を行い、その後細胞を37°C、95%湿度、5%CO2 インキュベーターに戻して培養を継続します。投与後24時間経過後、元の培地を捨て、細胞をHBSSで2回洗浄します。
  3. 高感度DCFH-DA染料作動液200 μLを加え、37°C、95%湿度、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。
  4. 上澄液を捨て、HBSSで2回洗い、Hoechst 33342生体染色液2μL(100x)で5分間染色し、その後蛍光顕微鏡で検査します。統計解析を用いて実験を3回繰り返します。

8. TEMを用いて観察された細胞のミトコンドリア形態

  1. 十分に培養された細胞から培地を捨て、室温の2.5%グルターアルデヒド固定液1mLを加え、室温の暗闇で約5分間固定します。細胞スクレーパーで一方向に優しくこそげ落とします。
  2. セル懸流液を遠心分離機管に移し、低速の水平ローター遠心分離機を用いて25°C、600 x g の遠心分離機で3分間移動させます。
  3. 固定液の上澄液を捨てた後、新しい電子顕微鏡固定液(12ウェルプレートなら1孔あたり1mL)を加え、室温で光の少ない場所で30分間固定し、その後4°Cに移して保存します。
  4. 脱水浸透:サンプルを埋め込み板に挿入し、37°Cのオーブンで一晩加熱します。
  5. 埋め込み培地を60°Cのオーブンで48秒重合します。超音波検査機で60〜80nmの超薄い断片を切除しました。
  6. 切片を2%酢酸ウラニル飽和アルコール溶液で15分間染色し、その後さらに15分間クエン酸鉛で染色します。染色された部分は室温で一晩乾燥させます。透過電子顕微鏡で断面を観察し、撮影してください。

9. ウェスタンブロッティング

  1. 細胞全体のタンパク質を抽出します
    1. 細胞を処理し、6cmのペトリ皿に接種し、密度が70%になるまで接種します。
      注意:細胞復活と接種の手順はステップ3.3を参照してください。
    2. 培養皿に3 mLのOA(5 μM)を加え、4時間後にCA(4 μM)を加えます。
    3. 氷の箱、PBSの予冷却剤、細胞スクレーパー、準備済みの溶解バッファー、そして複数のラベル付きEPチューブを事前に準備してください。
    4. 薬物処理後、培養培地を細胞から取り出し、事前に冷却したPBSで2回洗浄します。このプロセスは氷上で行い、残留するPBSは真空遠心分離機で吸引します。
    5. 各ペトリ皿にラベルを付け、300μLの溶解バッファーを加え、不完全な溶解や凍結を防ぐために5分間氷の上に置き、絶え間ない攪拌を続けます。
    6. その後、予備冷却されたセルスクレーパーを使って接着細胞を剥離し、各スクレイピング後に300μLをEPチューブに集めます。スクレーピングごとに新しいセルスクレーパーを使い、再利用しないでください。
    7. EPチューブの上部を持ち、ボルテックスミキサーでしっかりと混ぜ、その後25分間氷に置き続けます。この時点で、遠心機の予冷には一定の時間が必要なため、事前に4°Cの高速角ローター遠心分離機を起動してください。
    8. タイマー終了後、再び渦を流し、その後4°C遠心機で4500 x g の高速角ローター遠心機で15分間動作します。
    9. 次にドライバスヒーターを起動し、温度を100°Cに設定します。
    10. BCAタンパク質定量キットを取り出し、サンプルと試薬を96ウェルプレートに加え、よく混ぜて37°C、湿度95%、CO25 %のインキュベーターで30分間反応させます。抽出されたタンパク質含有量を多機能マイクロプレートリーダーで測定し、その結果に基づいて残りの溶解バッファーを調整して各サンプルの濃度を一定に保ちます。
    11. 最後に、各上清液の内容に基づき、6×ローディングバッファーを1/5の体積に加えてタンパク質ローディングシステムを準備します。新しいEPチューブに150μLの上清液を慎重に吸引します。6×のローディングバッファー30 μLを上清液に加え、通常1:5の比率で十分に混ぜます。混合物は氷で保存してください。
    12. その後、ヒーターで100°Cで6分間加熱し、EPチューブのキャップを押さえて開かないようにしてください。加熱後、氷水浴で冷やします。
  2. 10%濃度のタンパク質ジェルを準備します。
    1. ジェルプレートは純粋な水で洗い流し、自然乾燥させ、余分な水分を拭き取り、水染みやほこりはできるだけ避けてください。
    2. ジェルキャスティングスタンドを取り出し、前方に2枚のガラス板の短い板、後ろに長い板を置き、底面を揃えてガラス板間の隙間がスタンド底部のシーリングストリップにぴったり合うようにし、漏れを防ぎます。その後、プレートをしっかりとクランプしてジェル鋳造の準備をします。
    3. 下部ゲルは純水6mL、1.5 M Tris-HCl(pH 8.8)3.75 mL、10% SDS 0.15 mL、30% Acry/bis 5 mL、10% APS 75 μL、TEMED 7.5 μL を準備します。
    4. 泡立ちを防ぐために優しく回し、その後、2枚のガラスプレートの間に素早く均等に加え、上部のジェルを入れるスペースを確保します。その後、液体の表面を1 mLのイソプロパノールで平らにし、約30分間放置します。
    5. ジェルの準備用に純水で櫛をすすぐ後、自然乾燥させておき、別に置いてください。下部のゲルが完全に固まったら、イソプロパノールを注ぎ、純水で2〜3回慎重にすすいで液体を吸収し、残った液体を排出するためにゲルプレートを逆さまにします。
    6. 上部スタッキングゲルは、純水6 mL、0.5 M Tris-HCl(pH 6.8)2.5 mL、10% SDS 0.1 mL、30% Acry/bis 1.34 mL、10% APS 50 μL、TEMED 10 μL で準備します。
    7. 上層を埋め、15孔、厚さ1.5mmのコームを慎重に挿入します。1〜2分後に隙間を補充し、この過程で気泡の形成を最小限に抑えてください。完全に重合したジェルを使いましょう。
  3. タンパク質ゲル電気泳動
    1. ランニングバッファーとトランスファーバッファを事前に設定し、トランスファーバッファーは4°Cの冷蔵庫で事前に冷蔵してください。
    2. プロテインゲルを超純水ですすいで、清潔な電気泳動タンクを取り出し、プロテインゲルの短いプレート2枚を内側と反対側に挟み、ランニングバッファーを注ぎ、漏れがないか確認します。
    3. コームを慎重に取り除き、1井戸あたり10μLを合計4つのサンプルグループで充填します。1ゲルあたり3つのサンプルグループをロードし、各グループ間で4μLのタンパク質マーカーで区切って合計15ウェルにします。
    4. サンプルを装填した後、残りのランニングバッファーをすべて電気泳動タンクに注ぎ、蓋をして電圧を140Vに設定し、20分間定電圧電気泳動を行います。
    5. タンパク質バンドが濃縮後に分離ゲルに入ると、一定電圧電気泳動のために電圧を120Vに調整します。この過程で、NC膜をトランスファーバッファーに浸します。ブロモフェノールブルーが試料がゲルの下端に達したことを示したら電気泳動を停止し、膜移動の準備をします。
    6. フォームボックスに氷を半分入れ、トランスファークランプ、事前に冷やしておいたトランスファーバッファー、浸したNCメンブレンを取り出します。トランスファーバッファーの半分を平らな四角い容器に注ぎます。
    7. プロテインジェルを取り出し、超純水でしっかりすすいで、黒い面を下向きに、透明面を上に向けて置きます。中央にスポンジ1層、ろ紙1層、プロテインジェル、NC膜を敷き、さらにもう1層のろ紙とスポンジを重ねます。
    8. 気泡を取り除くために押した後、転送カセットをクランプして転送タンクに入れます。両方のプロテインジェルが完全に挿入されたら、トランスファーバッファーをすべてトランスファータンクに注ぎ、冷却のためにアイスパックを2つ追加し、蓋をします。
    9. 転送カセットを氷で囲み、120Vの一定電圧で90分間転送します。移動過程でかなりの熱が発生するため、冷却のために氷浴が必要です。
    10. NC膜を取り出し、20mLのポンソーS染色液に浸して染色し、鉛筆でマーカーサイズをマークし、検出対象のタンパク質の大きさに応じて鉛筆で膜を切ります。
    11. ポンソーS染色液を回収してください。染色液をPBSで洗い流し、NC膜を20mLのブロッキングバッファーでキュベートし、室温で低速でシェーカーで1〜2時間ブロッキングします。
    12. ブロッキング溶液を廃棄し、脱色シェイカーでPBSで素早く2回洗浄してブロッキング溶液を完全に除去し、抗体培養箱内の各抗体のウェスタンブロット使用比率に応じて対応する抗体を加え、4°Cで一晩培養します。
    13. 一次抗体は別に回収し、-20°Cで保存します。 膜は脱色シェイカーでTBSTを4回素早く洗い、1回5分ずつ洗浄し、一次抗体を完全に除去しました。次に、ブロッキングバッファー4mLと二次抗体を加え、室温のスローシェーカーで膜を1時間培養します。
    14. 二次抗体をTBSTバッファーで4回、それぞれ5分間洗浄し、その後PBSバッファーに置き換えてNC膜を完全に湿らせます。
    15. ECLの化学発光試薬取扱説明書に従い、発光溶液を準備して膜表面に落とし、その後1〜2分間培養した後、ゲルイメージングシステムで現像します。
    16. 生データをImage Jイメージングシステムで処理し、それをPhotoshopソフトウェアに転送して図を作成します。

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結果

ネットワーク薬理学と分子ドッキング
CAの潜在的標的の特定:CAの薬理活性の包括的な調査において、関連文献の広範なレビューから60の潜在的な標的が厳密に選ばれました。分析の範囲をさらに拡大するため、TCMSPデータベースを通じてCAに関連する可能性のある12のターゲットが特定されました。精度と徹底性を高めるために、SwissTargetPredictionプラットフォームの高度な予測機能が採用され、さらに1つの潜在的なターゲットが得られました。すべてのデータソースの統合と厳密な重複除去を経て、CAの最終的な60の潜在的なターゲットが確立され、その後の研究の基盤となりました(表1)。

疾患の潜在的標的の特定:「NP」に関連する潜在的標的をGeneCardsおよびTTDデータベースから取得し、それぞれ1516および13のNP関連標的を得ました。重複の統合および除去後、1516個のユニークな潜在的なNPターゲットが特定されました。さらに、GeneC...

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ディスカッション

フェロプトーシスは最近確認された細胞死の一種であり、細胞内の鉄の過剰蓄積と脂質過酸化を特徴とします。形態学的には、フェロプトーシスはミトコンドリアの縮小、クリステア構造の喪失または減少、膜密度の増加として現れますが、細胞膜や核の形態は影響を受けません。機構的には、フェロプトーシスはグルタチオン(GSH)の枯渇とGPX4活性の低下によって引き起こされ、GPX4触媒によるグルタチオン還元酵素 反応による 脂質過酸化物の代謝が阻害されます。鉄鉄イオンは脂質酸化を触媒しROSを生成し、鉄依存性誘導体は多様な経路を通じてGPX4を標的化し、ROSを細胞内に蓄積させます。細胞内抗酸化物質システムの容量が限られているため、このROS過負荷は細胞構造を損傷し、細胞死を引き起こします。これによりフェロプトーシス27が引き起こされます。新たな証拠により、フェロプトーシスと神経障害との強い関連が確立されています。Millieらは、G...

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開示事項

開示すべき金銭的利益相反はありません

謝辞

病院とその部門が提供した優れた環境に心から感謝の意を表します。これにより、これらの成果を達成できたと申し上げます。同時に、長年にわたりたゆまぬ努力と貴重な貢献をしてくださった多くの研究所メンバーの皆様にも心から感謝申し上げます。参加者一人ひとりの努力は私たちの成功に欠かせないものであり、今後も医療分野の進歩のために共に取り組み続けていきます。中国国家自然科学基金(82104838)、中国振興基金スパークプログラム(XH-D001)、遼寧省重点研究開発プログラム(2024JH2/102500062)、遼寧省自然科学基金(2025-MSLH-490)です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 グリシンバイオフロックス1275KG001
 トリスベースバイオフルックス1115KG001
0.5 M トリスHClバッファー(pH  6.8)バイオラッド1610799
1 M トリス-HCL(PH 7.5)ビヨタイムST775
1.5 M トリスHClバッファー(pH  8.8)バイオラッド1610798
APSビヨタイムST005
基本的な電気泳動電源バイオ・ラッド パワーパックベーシック
BCAタンパク質定量キットビヨタイムP0012
ベータアクチン組換え抗体華比オ81115-1-RR
二酸化炭素インキュベーター熱力学150L
CCK-8アッセイキットApexbioK1018
細胞活性および細胞傷害性アッセイキットビヨタイムC2015M
シナマルデヒド(カリフォルニア州)マックリンC805134純度98%
脱色シェイカーカイリン・ベルTS-100
DMEM(ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム)BasalMediaL110KJ
DMSOシグマD2650
背根神経節(DRG)フーヘン略歴FH165シリアルナンバー:20211227-1
DRG完全媒体フーヘン略歴FH-DRG
ECL発光解熱力学34580
エルブB-1プロテインテック06-8471:2000
胎児 牛 血清マックリンFO193
鉄系イオン検出プローブ - フェロオレンジ道津島F374
FTH1細胞シグナル伝達技術4393S1:1000
ゲルイメージングシステムバイオ・ラッド ケミドック・タッチ
ハンクスのバランスソルト溶液(HBSS)ソーラービオH1025
高速冷蔵遠心分離機エッペンドルフ5804R
Hoechst 33342 ライブセル染色ソリューションビヨタイムC1028
免疫組織化学キットバイオシャープBS-24-PB
逆蛍光顕微鏡システムライカライカ Dmi 8
JAK2組換えウサギ単クローナル抗体 [SY0245]華比オET1607-351:2000
実験室逆位相差顕微鏡ライカライカ Dmi 1
低速遠心分離機エッペンドルフ5804
MDAコンテンツ検出キットサンゴンD799762
マイクロプレートリーダーSUNRISEとnbsp;テカン
多機能マイクロプレートリーダーBMGLABTECH PHERAstar FS
NFとカッパ;B p65 ポリクローナル抗体プロテインテック10745-1-AP1:1000
パラホルムアルデヒドマックリンP804536
ポンソー染色ソリューションビヨタイムP0022
プロテインマーカー熱力学26617
P-STAT3(Ser727)細胞シグナル伝達技術9134S型1:1000
P-STAT3(タイア705)細胞シグナル伝達技術9145S型1:2000
組換え抗グルタチオンペルオキシダーゼ4抗体[EPNCIR144]アブカムAB1250661:1000
組換え抗XCT抗体[EPR27115-64]アブカムAB3076011:1000
ROSアッセイキット道津島R252
SDS-PAGEタンパク質ローディングバッファー(6倍)ビヨタイムP0289
脱脂粉ミルクバイオシャープBS102-500g
ドデシル硫酸ナトリウム SDSバイオフルックス3250GR500
STAT3(F-2)サンタクルーズSC-80191:200
テメッドソーラービオ  T8090  
TFRCインビトロジェン13-68000.5 & micro;g/mL
トゥイーン80セレックS6702
超クリーン作業台HDLDL-CJ-2NDI
直立顕微鏡オリンポスCX 31
垂直電気泳動バイオ・ラッド ミニプロテアンテトラ
湿式移送タンクバイオ・ラッド ミニトランスブロット
&α;-チューブリン&α;-チューブリンER130905
GraphPad プリズム統計解析
ImageJソフトウェアタンパク質ブロットのグレー値を取得する

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