選択的REM睡眠剥奪法(SNiFFer)による選択的鼻をパチクさせてREM睡眠を奪う方法

Summary

齧歯類における急速眼球運動(REM)睡眠の選択的剥奪のための新しいプロトコルを提案します。

Abstract

睡眠は大まかに急激眼球(REM)段階と非REM段階に分類され、その機能を研究するために様々な睡眠剥奪技術が開発されています。従来の方法、例えば機械的刺激やREM睡眠中に動物を落とすなどは、急速な慣れや意図しないストレス効果を引き起こし、解釈を困難にします。ここでは、齧歯類のREM睡眠不足に対する新しく穏やかで優しい方法、SNiFFerをご紹介します。齧歯類は鼻の刺激に非常に敏感であることが知られています。この方法では、柔らかい筆でREM睡眠中に動物の鼻を優しく撫で、確実に興奮を引き起こします。この技術をREM睡眠中に選択的に適用するために、AIベースのリアルタイム脳波計(EEG)睡眠段階分類システムを活用しました。介入はREM睡眠エピソード中のみが誘発され、睡眠状態に関係なく同じ刺激パターンを受けたヨーク付き対照群も含まれました。さらに、SNiFFerをトレース恐怖条件付けパラダイムに適用し、学習後6時間以内のREM睡眠剥奪が記憶の定着に干渉するかどうかを検証しました。ヨークされた対照群と比較して、SNiFFerを処理した動物は総REMエピソードおよびREMエピソードの持続時間が有意に減少し、この方法の特異性と有効性を示しています。結論として、SNiFFer技術はマウスのREM睡眠剥奪に対して非常に選択的かつ低侵襲的な触覚アプローチを提供します。実験条件の精密な制御を可能にし、記憶と認知におけるREM睡眠の役割を調査する新たな可能性を開いています――くすぐったいひとつも。

Introduction

急速眼球運動(REM)睡眠は、記憶の定着などの認知過程において重要な役割を果たします^1,2。脳におけるREM睡眠の機能的意義を調査するために、REM睡眠剥奪は実験的アプローチとして一般的に用いられます。現在、齧歯類のREM睡眠剥奪を誘発するために広く使われている主な方法は4つあります:回転円板法¹、植木鉢法³、エアパフ法⁴、物理刺激法^5,6。回転円盤法や花鉢法はREM睡眠を排除するのに非常に効果的ですが、水への曝露や身体的疲労など、動物に大きなストレスをもたらすこと^{が多く、行動}や生理学的結果の解釈を混乱させることがあります。同様に、エアパフ法や従来の物理刺激法は、身体に広範で非特異的な刺激を届ける傾向があり、刺激の強度にばらつきや^対照群の選択肢が限られている^4,8。

私たちは、 補足ファイル1 および 補足表1に掲載されている60年以上にわたるREM睡眠不足研究を網羅した包括的な文献比較を実施しました。私たちは、ジュヴェ、レヒチャッフェン、ベルグマン、トゥフィク、アンデルセン、ボルベリーなど主要な研究分野からの基礎的な歴史的、機構的、神経化学的、ホルモン的、行動的研究を取り入れました。 補足表1は 主要な論文を年代順に整理しています。REM睡眠剥奪技術の方法論的進化をたどり、主な生物学的、神経化学的、ホルモン的、免疫性、体温調節的、行動的知見をまとめています。本稿は包括的な歴史的レビューではなく方法論として構成されているため、補足情報として追加されています。

これらの制限に対処するため、私たちはREM睡眠剥奪において高い選択性を持つ新しい方法を開発しました。この技術は、正確に制御された方法でげっ歯類からREM睡眠を選択的に奪うことを目的としています。このアプローチでは、刺激を動物の鼻に限定します。これは齧歯類の中でも最も敏感な部位の一つ^です。さらに、AIによるリアルタイム睡眠段階分類システムを用いて、時間特異性¹⁰でREM睡眠エピソードを検出・中断します。このAIシステムは、過去4秒のEEG信号を単一のチャネルから参照し、現在のマウスの睡眠段階を評価します。この構成により、ヨークされたコントロールグループの導入も可能となり、時間的にマッチした介入が可能になります。物理刺激に基づくREM睡眠剥奪技術に分類されていますが、私たちのプロトコルは従来の方法とは異なります。まず、AIを用いたリアルタイム睡眠段階解析を適用し、正確かつ一貫したREM特異的介入を行いました。次に、刺激部位をマウス6で最も敏感な鼻の上部に限定^し、刺激の持続時間や強度の変動を最小限に抑えます。最後に、交絡因子のコントロール群に同じ量の刺激を受けたヨークドコントロール群を新たに設定しました。このプロトコルは、REM睡眠に特有の機能を調査する方法を提案します。

この手法の有用性を評価するため、私たちはREM睡眠が痕跡恐怖記憶の定着化に果たす役割を調査するために応用しました。過去の研究では、REM睡眠不足が海馬依存性恐怖記憶の固定化を損なうと報告されており、遅延恐怖記憶も含まれ^ます。しかし、REM睡眠剥奪が分散した複雑な脳回路を関与させる記憶過程に与える影響については、矛盾する証拠^{があります。}痕跡恐怖記憶の統合には、足震(無条件刺激)、聴覚手がかり(条件付き刺激)、およびそれらの間の痕跡間隔の関連付けが必要であり、この過程は海馬、内側前頭前野、扁桃体¹⁴を含む複数の脳領域を動員することが知られています。したがって、マウスには記憶の定着に重要な時間帯である¹⁵の直後6時間、つまり記憶の固定化に重要な時間帯を制限^{しました。}このプロトコルを用いて、REM睡眠剥奪が分散神経系の協調活動に依存する記憶痕跡の定着化に与える影響を評価しました。本記事では、効果を検証する詳細な実験プロトコルを記述する新しい手法を提示します。

Protocol

すべての動物実験は筑波大学の動物管理・利用委員会によって承認されました。本研究では、オスとメスのC57BL/6Jマウス(生後11〜13週、20〜35g)を用いました。本研究で使用される材料および器具の完全なリストは 材料表に掲載されています。

1. 脳波電極の外科的埋め込み¹⁷

1. 麻酔と動物の準備
   1. 4%イソフルランを空気と混ぜて3分で麻酔を誘導します。足筋の引き込み反射や筋緊張の欠如、呼吸パターンの安定により適切な麻酔が確認されました。
   2. 電気シェーバーを使って、後ろから目の間の背側の頭と首の部分を剃ります。マウスがひげの動きなど覚醒を示したら、再び麻酔を誘導します。
2. 頭部固定と頭蓋骨露出
   1. 動物を立体的フレームに固定し、鼻と頭蓋の位置を確実に保ちます。この時点から手術終了まで、麻酔はイソフルラン蒸気ポンプシステムによって継続的に維持されていました。
   2. 角膜乾燥を防ぐために両目に眼科軟膏を塗布してください。脱毛クリームで残った髪を除去します。
   3. 頭皮の中央に切開を入れ、皮膚を優しく引き戻して、後耳のラインから前方の眼線にかけて頭蓋骨を露出させます。粘膜組織は綿棒で除去します。
3. ランドマークの識別と水平化
   1. bregmaとlambdaの同定;立体アームを調整して、これらの点が±0.05 mm以内に水平になるようにします。横座標±ブレグマから3.0 mm)も水平であることを確認しましょう(±0.05 mm)。
4. 穴あけとネジの配置
   1. ブレグマに対して次の座標をマークしてください。これらの座標に合わせて4つのパイロットホールを掘ってください。前後方/内側–外側:+1.5 mm / ±1.5 mm、–3.0 mm / ±1.7 mm。
   2. 各穴にEEG記録用のネジを埋め込み、シアノアクリレート系のゲルグルーで固定します。露出した頭蓋骨と頭部を薄く歯科セメントで包み、覆います。
5. 術後ケア
   1. 5%グルコース溶液0.5mLとイブプロフェン(または同等の鎮痛剤)0.13mLを投与します。
   2. ネズミを元のケージに戻します。円筒形のプレキシガラスケージ(直径21.9cm、高さ31.6cm)で、断熱されたチャンバー(45.7 x 50.8 x 85.4 cm)内に設置されています。チャンバーは23.5°C±2.0°C、相対湿度50.0%±10.0%、12時間の明暗サイクル(明暗時:午前9時から午後9時)で維持されています。
   3. 動物を温めたリカバリーケージに入れます。ケージの前でネズミが起きるまで待ちましょう。手術後は動物を個別の収容所に収容し、実験期間中はグループ収容に戻されませんでした。

2. 取り扱いと慣れ

1. 実験スケジュール
   1. 手術後24〜48時間の軽度段階で取り扱いを開始します。4日間連続で続けてください。
2. 手術手順
   1. 1日目はマウスを2分間用意して2回分。マウスを実験者の開いた手のひらの上に置き、指を伸ばして手のひらを上に向けてください。ネズミは自然と高い場所に登る傾向があるため、手のひらを前腕よりやや高く位置に置いてください。ネズミを自由に動かすことを制限なく許してください。もしネズミが前腕に登ろうとしたら、尾の付け根を軽く持ってそっと手のひらに戻します。各インターバルは20分以上です。これは光の段階で行うべきです。
      注意:ネズミが手から飛び降りたり噛んだ場合は、初日のみ布やティッシュペーパーで手を覆ってください。服は再利用可能で、2週間ごとに洗濯してください。
   2. 2〜4日目には、マウスを2分間用意して3回分使います。各インターバルと実施期間は1日目と同じです。慣れの行動評価:慣れていないネズミは通常、ジャンプしたり強く噛んだりして逃げようとしますが、慣れ親しんだネズミは逃げる試みは最小限で、強い噛みつきもほとんどありません。
   3. 最終ハンドリングセッションの最後に、マウスをEEG記録ケーブルに接続します。
      注意:寝床材が過剰でネズミの鼻を妨げる場合は、手作業でいくつかを取って取り除き、取り扱いの際や接続時に取り除いてください。

3. 基礎的な脳波記録

1. 術後5日目と6日目から始めます。毎日11時から17時まで連続して脳波検査を記録してください。寝床の素材がネズミの鼻へのアクセスを妨げる場合は、余分な寝床を徐々に取り除き、動物への影響を最小限に抑えつつ、鼻へのアクセスを明確にしてください。

4. 恐怖条件付け^18,19

1. 術後7日目(または8日目)から10:00から11:00の間に開始します。準備として、空調チャンバー(30×25×24cm)に70%エタノールをスプレーします。このチャンバーは透明なアクリル壁とステンレス製グリッドフロア(直径2.0mmの棒が6.0mm間隔で配置)で構成されています。
2. トレーニングプロトコル(合計セッション1,100秒)
   1. 180秒、400秒、620秒、840秒、1060秒の5つの聴覚キュー(20秒の上昇音、5〜20kHz、1.25Hz、0.8秒の持続時間)を届けます。各サウンドキューには、218秒、438秒、658秒、878秒、1098秒で届くフットショック(1.0 mA、2秒)と組み合わせてください。

5. REM睡眠不足

1. REM睡眠剥奪グループ(RSDグループ)
   1. 恐怖条件付け(ZT2-ZT8)直後、AIベースの睡眠段階分類システムを起動してリアルタイムで脳波をモニタリングし、REM睡眠のリアルタイム検出を可能にします。REM睡眠を検出したら、柔らかい筆で動物の鼻を優しくくすぐり、再び目覚めるまで続けます。刺激開始から覚醒までの平均潜伏は0.89±0.063秒(平均SEM)±。
   2. 実験中、覚醒は触覚刺激に対する行動反応、特に刺激後のひげの動きとして定義されました。各ティックルのタイムスタンプを記録して後で分析してください。
      注意:くすぐりの動きは固定された方向パターン(例:前後、上向き、円形)なしに行われ、鼻の上部に限定された軽い触覚刺激を一定に保ちました。鼻が塞がっている場合は、通常露出している振動(ひげ)領域に刺激を直接向けます。マウスが筆から背を向けている場合は、必要に応じてケージを回転させて鼻へのアクセスを妨げないようにしてください。上部の開いたケージを使用する場合は、上から刺激を加えて鼻や振動の安定アクセスを確保することもあります。
2. ヨークドコントロール群(ヨークドグループ)
   1. それぞれのヨークマウスをREM睡眠不足のマウスとペアにします。パートナーのREM睡眠エピソードに合わせて、マウスに鼻をくすぐりをかけ、開始時と持続時間に合わせて行います。各マウスはREM睡眠剥奪実験の間ずっと同じ専用のペイントブラシを使っています。使用後は弱酸性の水をブラシに吹きかけ、ティッシュで拭き取ってください。使用間隔は少なくとも24時間空けて、洗浄した筆が完全に乾いていることを確認してください。

6. 記憶想起テスト

1. 文脈想起テスト(テストA)
   1. 睡眠不足から24時間(±3時間)から始めましょう。ネズミを元の調整室(エタノール臭70%)に戻します。5分間のフリーズ動作を記録してください。
2. 音声キューによる想起テスト(テストB)
   1. テストAの3時間後にセッションを行います。
   2. コンテキスト準備:コンテキストB(高さ30cmの三角柱)で水を噴射し、3つの壁からなり、辺の長さは31cm、24cm、24cmです。2面の壁は白い紙で覆われ、3面目は透明なアクリルでできており、背景には青い長方形が見えます。この構造はプラスチック製の床と透明なアクリル天井を持っています。
   3. 6分間のフリーズ動作を記録してください。180秒のトレーニングと同じ180秒の音声キューを1回だけ伝えます。

7. データ分析

1. 睡眠段階のスコアリング(図1C-G)¹⁷
   1. 各覚醒/NREM/REMごとに、人間の専門家スコアデータに基づき、総量、エピソード数、エピソード平均持続時間、睡眠移行数を計算します。各段階の基準は以下の通りです。
      ウェイク:低振幅、高周波(β/γ)
      NREM:高振幅、低周波(δ)
      REM:低振幅、シータ優性
2. 剥奪の質(図1B)
   1. 各くすぐり刺激が適用される睡眠段階を、人間の専門家が注釈したEEGデータとタイムスタンプを比較して評価します。
3. 凍結挙動(図1H、J-K)
   1. FreezeFrame4(Actimetrics)を使って、恐怖条件付けや想起テスト中の不動(呼吸を除く)を定量化します。
      1. FreezeFrame 4のソフトウェアを起動し、 レコーダー モードを選択してください。ファイルメニュー(左上)から、録音ファイルを保存する先フォルダを指定します。左パネルの4つの白い入力フィールドに、各マウスに対応する固有の識別子を入力し、画面右側の4つのファイル表示ウィンドウと一致させます。
      2. インターフェース下部の プロトコル パネルをクリックし、実験設計に基づく録音パラメータを定義してください。録音の総時間や聴覚の手がかりや足の衝撃のタイミングを含みます。
      3. 画面中央の 「参照 」をクリックすると背景参照画像を取得します。マウスをコンディショニングチャンバーに入れてから「 開始 」をクリックして録画を開始します。
4. 識別指数分析(図1L)
   1. 識別指数は以下の式で計算します。
      テストAで平均5分でフリーズ - テストBで最初の3分でフリーズする/テストAで平均5分で最大フリーズ、テストBで最初の3分でフリーズ。
5. 衝撃反応性指数分析(図1I)
   1. 恐怖条件付けセッションにおいて、ショック開始前後の動物の2次元動きを手で測定します。衝撃反応度指数は以下の式で計算します。
      ショック中の動き - 運動前衝撃 / ショック中の動き + 動き

Results

EEG電極の外科的埋め込み
マウスは手術中は完全に麻酔をかけるべきです。もがくなど麻酔の失敗の兆候が見られた場合は、プロトコルから除外すべきです。同様に、出血が10秒以上続く場合はマウスの脳に深刻な損傷を与える可能性があり、実験からの除外が推奨されます。手術後、ほとんどのマウスは通常1時間以内に目覚めます。歩行や眼球運動は手術前の状態と似た正常な状態に戻るはずです。

取り扱いと慣れ
マウスがてんかんや取り扱い中に痛みを感じた場合は、実験から除外すべきです。慣れ育成の間、マウスは抱きしめると通常硬くなってしまいます。この慣れ期は通常、2^日 目か^3日目の 初めに訪れます。EEGケーブルを接続する際は、マウスの目を柔らかい布で優しく覆い、落ち着かせて動きを抑えてください(補足図1)。事前に適切な取り扱いが行われていれば、マウスは通常、ケーブル接続のためにヘッドピンを...

Discussion

このプロトコルにより、ヨーク付きコントロールマウスを用いたマウスで選択的なREM睡眠剥奪が可能になります。植木鉢や回転ディスク技術などの従来の方法とは異なり、このシステムは動物が同じ概日リズム時間で同じ刺激を受ける、細かくマッチした対照群の実装を可能にします。さらに、この方法は刺激部位の変動を最小限に抑え、従来の優しい取り扱いやエアパフ法で共通する制限となっています。その結果、この技術によりREM睡眠機能のより正確な分離が可能になる可能性があります。

このプロトコルの重要なステップは、REM睡眠剥奪セッション中に鼻を正確かつ優しく刺激することです。他の身体部位への刺激は刺激効果の変動をもたらすことがあります。さらに、非特異的または過剰な刺激は急性ストレスを引き起こし、その後の行動評価の信頼性を損なう可能性があります。

もう一つの考慮点は、使用する床材の量です。過剰な寝床は被験者の鼻を隠し、刺激の伝達に支障をきたすことがあります。ネズミの鼻が詰まっているように見...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5%のグルコース	おつかば	35061410
6ピンヘッダー	広瀬	172-0989
接着剤	小西	16351
麻酔装置	信濃聖作所	SN-487-0T
クリンプハウジング	広瀬	688-9095
クリンプソケット	広瀬	688-8982
フリーズフレイム4	メッド・アソシエイツ	リッド:SCR_014429	バージョン 4.104
GraphPad プリズム	グラフパッド	リド:SCR_002798	バージョン 10.5.0
イブプロフェン	東京化学工業	I0415
イソフルラン	ヴィアトリス	901036504
ロックタイト454	ヘンケル	UFI: MAK2-7WRP-G202-F235
マウス(C57BL/6J)	ジャクソン研究所	リッド:IMSR_JAX:000664	11.0 - 13.0週の恐怖コンディショニングセッション
ペイントブラシ	村台生堂	4943668000448	SDflat No.8、先端長:8.2 mm;幅:18.8 mm
プロビニス液体	少府	21400BZZ00451000	250 mL
プロヴィニツ パウダー	少府	21400BZZ00451000	250 g
SleepSignRecorder	キッセイ・コムテック	リッド:SCR_018200	バージョン 1.2.10
ステンレス製のねじ	山崎	該当なし	φ1.0 & times;2.0
標準立体タキシック計器	ALAサイエンティフィック	68038
ひまわり油	シグマ・オルドリッチ	S5007-250ML
ホワイト・ペトロラタム	太陽製薬	K09-TS