方法論記事

移植前の損傷した肺移植片のリハビリテーションのための Ex-vivo 肺灌流中の熱プレコンディショニング

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DOI：

10.3791/69084

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2025年10月31日

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1Service of Thoracic Surgery, Department of Surgery and Anesthesiology Services, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University, 2Service of Adult Intensive Care Medicine, Department of Interdisciplinary Centers and Logistics, Lausanne University Hospital and Faculty of Biology and Medicine, Lausanne University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、校正された熱ストレスへの一時的な曝露を組み込んだラットの ex-vivo 肺灌流モデルを提示し、損傷した肺移植片の治療的再調整のための内因性保護メカニズムを促進します。このアプローチはスケーラブルで再現性があり、肺移植の成功率を向上させるための非薬物療法の開発をサポートします。

要約

生体外肺灌流 (EVLP) は肺移植における画期的な進歩として浮上し、ドナー肺の機能評価と辺縁移植片のリハビリテーションのための治療介入の両方を可能にします。再調整戦略には、薬理学的および非薬理学的アプローチが含まれます。後者の中で、一過性の制御された熱ストレス (「サーマル プレコンディショニング」、TP) が、内因性の保護熱ショック応答を誘発することにより、損傷した肺を回復する効果的な手段であることを実証しました。ここでは、循環死(DCD)後の提供をシミュレートして、温虚血にさらされた肺を再調整するためにTPを組み込んだラットEVLPモデルの段階的なプロトコルを提示します。プロトコルには、肺の準備、カニューレ挿入、灌流、および熱ショック反応の誘導が詳しく説明されています。TPは、EVLPの初期に灌流液温度を41.5°Cまで30分間上昇させ、その後、灌流の残りの部分で37°Cに急速に戻すことで構成されます。6時間のEVLPモデルでは、TP処理された肺(n = 30)は、対照と比較して、熱ショックタンパク質70発現の増加、静的肺コンプライアンスの改善、浮腫の減少、フォンヴィレブランド因子(内皮損傷バイオマーカー)の放出の低下、および組織学的損傷の軽減を示しました(n = 30)。このプロトコルは、血管抵抗、気道内圧、肺コンプライアンス、酸素化のリアルタイムモニタリングを可能にし、灌流液と組織の両方における分子および形態学的分析をサポートします。この再現性がありスケーラブルなプロトコルは、より大きな動物またはヒトの EVLP システムに適応でき、移植結果の改善を目的とした非薬理学的介入を研究するための実用的なトランスレーショナル プラットフォームを提供します。

概要

生体外肺灌流 (EVLP) は、肺移植の分野における大きな進歩を表しています。その最も重要な影響は、辺縁肺の機能評価を可能にし、移植のために廃棄される臓器の使用を可能にすることにより、利用可能なドナー肺移植片のプールを拡大することにあります 1,2。限界 (または拡張基準) ドナー肺とは、次の基準の 1 つ以上を指します: ドナーの年齢が 55 歳以上、PaO2/FiO2 が 300 未満、虚血時間が 6 時間以上、喀痰微生物学が陽性、異常な X 線撮影3.生理学的評価に加えて、EVLP は、移植前の移植片の質を改善することを目的としたさまざまな治療介入を適用するためのプラットフォームとして機能する可能性があります (治療的再調整の概念)4。そのため、EVLP は、損傷した (辺縁) 肺をリハビリし、肺移植後の早期および長期転帰の両方を損なう主要な合併症である原発性移植片機能障害 (PGD) のリスクを軽減するまたとない機会を提供します 5,6。PGD は虚血再灌流障害 (IRI) のプロセスの臨床発現であり、その病態生理学は酸化ストレス、炎症、補体および凝固カスケードの活性化、および細胞死プロセスの誘導に依存しています 7,8,9。最終的に、これらのメカニズムは肺内皮と上皮の正常な機能を破壊し、PGD6、10、11、12 の 2 つの重要な特徴である酸素化能力の低下を伴う非心原性肺水腫を引き起こします。

前臨床および臨床の両方で、肺移植中の IRI を軽減するためのさまざまな ex vivo 治療戦略の有効性が実証される実験研究が増えています。例としては、ほんの数例を挙げると、酸化剤およびフリーラジカルを標的とする薬理学的製剤、細胞死経路、炎症メディエーター、ならびに細胞ベースの治療および遺伝子治療が含まれます 13,14,15,16,17,18,19,20.このような治療アプローチを超えて、EVLP は、生理学的ストレスを肺移植片に直接適用し、その後の病態生理学的損傷に対する適応耐性を提供する固有の保護メカニズムを引き出すためのプラットフォームとしても機能する可能性があります。そのような戦略の 1 つは、EVLP 中に肺移植片に一時的で致死的ではない熱ストレスを加えることです。実際、熱ストレスの状態は、分子シャペロンとして作用し、さまざまなストレス刺激へのさらなる曝露に対する耐性を与える一連の熱ショックタンパク質(HSP)の発現から生じ、適応的な熱ショック応答を促進することが長い間知られていました21。HSP誘導に加えて、(a)NF-E2関連第2因子(NRF2)抗酸化および細胞保護経路を含む、熱曝露後にいくつかの追加の細胞適応が同定されており、その熱ストレスでの活性化は細胞保護遺伝子ヘムオキシゲナーゼ22,23を著しくアップレギュレートします。(b)小胞体におけるタンパク質毒性ストレス(ERストレス)を扱い、熱による活性化は、熱ストレス24、25、26の強度に応じて、保護的または有害である可能性がある折り畳まれていないタンパク質応答(UPR)。(c)オートファジー、損傷した細胞小器官および高分子のリソソーム分解を促進する細胞保護プロセスであり、温度および時間依存的な方法で熱によって活性化または阻害される可能性があります27,28。

このような「熱プレコンディショニング」が、酸化ストレス、炎症、細胞死、内皮機能障害の軽減という点で大きな利点をもたらし、肺IRIに対する有意な保護につながることを実証しました。したがって、我々は、熱プレコンディショニングが、移植前の損傷した肺移植片の生体外治療的リハビリテーションのための新しい非薬理学的方法を表す可能性があることを提案しました29,30,31。熱プレコンディショニングには、既存の薬理学的および非薬理学的戦略に比べていくつかの利点がある可能性があります。統合された細胞内因性応答を誘発することにより、IRI に関連する異なる病態生理学的経路に対する保護を同時に提供する可能性がありますが、他の戦略は一般に単一の経路を標的とします。さらに、薬理学的化合物の使用に関連する潜在的な副作用のリスクを回避します。本稿の目的は、損傷したラット肺の ex vivo 肺灌流中の熱プレコンディショニングの詳細な段階的なプロトコルを提示することであり、これはさまざまな環境、特に研究目的でより大きな動物モデルまたはヒトの肺に適用できます。

EVLP には、ラット単離灌流肺システム IPL-2 を利用します。セットアップを図1に示し、以下を含む:灌流液リザーバー(図1-1);灌流液循環(図1-2A)および灌流液サンプリング(図1-2B)用の2つのローラーポンプ。灌流液温度を維持するためのサーモスタットウォーターバス(図1-3)。流入灌流液を脱酸素化およびカルボン酸化するために、6%O2、10%CO2、および84%N2の混合物を含むガスタンク(図示せず)に接続された膜ガス交換器(図1-4)。左心房 (LA) および肺動脈 (PA) の圧力を監視するための 2 つの圧力センサー (図 1-5) (PA 圧力センサーは図には表示されません)。PA、LA、および気管カニューレ用の専用接続を備えた心肺ブロックを収容する加熱および密閉チャンバー (図 1-6)。肺換気および気道内圧および静的肺コンプライアンスの測定のために気管カニューレに接続された人工呼吸器 (図 1-7)。PA流入のレベルで灌流液温度を表示する電子体温計(図1-8)。接続プラットフォーム(図1-9)の要素が図2に詳細に示されています。PA(図2-1)、LA(図2-2)、および気管(図2-3)カニューレの接続。心肺ブロックの重量を継続的に監視するための重量モジュール (図 2-4) への接続。PA流入時の灌流液温度を監視するための温度センサー(図2-5)。回路の詳細な回路図の説明は、他の場所にあります 18.

プロトコル

注:この研究には、成体雄のSprague-Dawleyラットを使用しました(n = 60;年齢、8〜11週齢、体重、300〜450 g)。動物は地元の動物施設に収容され(2匹/ケージ)、12時間の光/12時間の暗いサイクルで維持され、餌と水に無制限にアクセスできました。すべての動物は「実験動物の世話と使用に関するガイドライン」(NIH Publication no. 96-23)に従って治療され、すべての実験は、地元の動物管理委員会(Direction Générale de l'Agriculture, la Viticulture et Affaires Vétérinaires de l'Etat de Vaud(認可3456aおよび3456x1))によって承認された実験プロトコルに従って実施されました。動物のサイズと体重は、ラットEVLPモデルでの以前の研究に基づいて、解剖学的利便性(肺と血管のサイズ)のために選択されました。他の株(特にWistarラット)が灌流液中に存在するデキストラン溶液に対して過敏反応を示す可能性があることを考慮して、Sprague-Dawley株が選択されました1,32。

1. EVLP回路の概要

メモ: セットアップは図 1 に説明されており、接続プラットフォームの要素 (図 1-9) を図 2 に詳細に示します。回路の詳細な概略図は、前述の18。

  1. 非細胞緩衝細胞外溶液を使用して、 ex vivo灌 流を行います。灌流液がリザーバーからガス交換器を通って流れ、肺灌流のためにPAカニューレを通って誘導され、LAカニューレを通ってリザーバーに戻ることを確認します。流入(PA)および流出(LA)圧力を継続的に監視します。
  2. すべてのトランスデューサ(PA圧、LA圧、肺重量、ポンプ速度)をアナログ/デジタルコンバータボックスに接続します(図3)。基本データ収集ソフトウェア(BDAS)を開きます。水柱を使用した2点校正(0; 10 cm H2O)を使用して圧力信号を校正します。2点校正(0 gと1 g)を使用して、重量モジュールを校正します。10 mL/分で1分間の灌流液サンプリングを使用してポンプ速度を校正します。既知の圧力とポンプ速度を適用し、結果の妥当性を評価することにより、信号の品質を制御します(信号校正の詳細なプロトコルとビデオは、補足資料に記載されています)。
  3. すべての主要なパラメータ(PA、LA圧、肺重量、流量)をシステムソフトウェアによってリアルタイムに記録し、パソコンで視覚的に表示します。
    注:BDASによって記録された生理学的信号は、メニューバーの ファイルエクスポート コマンドを使用してテキストファイルにエクスポートされます。選択した時点(60分ごと)に抽出されたデータはスプレッドシートに転送され、統計分析のためにソフトウェアにコピー&ペーストされます。
  4. 式 (1) を使用して肺血管抵抗 (PVR) を計算します。
    figure-protocol-1(1)
  5. さまざまな生物学的マーカーを測定するための専用の時点で灌流液のサンプル(1〜2 mL)を取得します。

2. サーマルプレコンディショニングアプリケーション

  1. サーモスタットウォーターバス(図4-1)を接続して、灌流液加熱のための一定で正確で調整可能な水温を確保します。ウォーターバス内に内蔵されたモーターポンプを使用して、加熱された水を循環させます。
  2. 二重壁のガラス容器をリザーバーとして使用し(図4-2)、容器の壁の間に温水を循環させることで灌流液の温度を維持します。
  3. 加熱された水容器(図4-3)内に蛇行チューブを備えた加熱コイルを使用して灌流液を駆動し、 ex-vivo 肺製剤に入る直前に水から灌流液への熱交換を可能にします。
  4. 暖かい環境を維持するためにサーモスタットウォーターバスから循環する水で満たされた二重壁の容器である臓器室(図4-4)に心肺ブロックを収容します。
  5. 温度センサーと温度計(図2-5 および 図4-5)の場合、肺動脈(PA)に入る実際の灌流液温度を継続的に監視するために、タイプKビーズ空気/表面センサーを流入カニューレにしっかりと適用します。温度はデジタル温度計に表示されます。
  6. 流入温度を37°Cに維持するには、ウォーターバスを38〜38.5°Cに設定します。
    注:チューブ内の流れに沿った灌流液からの熱損失を補償するために、流入時に37°Cを維持するには、ウォーターバス温度を38〜38.5°Cに設定する必要があると判断しました。灌流液からの熱損失によっては、流入時に所望の温度を保証するためにこれらの設定を調整する必要がある場合があります。
  7. EVLPの60分間後に、ウォーターバス温度を43°Cまで上げて41.5°Cの流入温度に達することにより、5分間で得られ、30分以上維持することにより、ex-vivo加熱プロトコルを開始します。
    注:以前の研究29では、図5に示すように、40°Cから43.5°Cの温度範囲と3時間のEVLPプロトコルを使用して、熱プレコンディショニング(TP)の最適温度を決定しました。有害な影響を及ぼさずに最適な保護を提供する加熱温度(図5Bに要約されているように)は41.5°Cであることがわかりました。 したがって、この温度はその後のすべての実験で使用され、EVLPの持続時間は最大6時間29,30,31でした。
  8. この過渡加熱の後、ウォーターバスに氷を加えて、急速に(5分で)ウォーターバス温度を38°Cに下げて、流入カニューレ内の灌流液温度を37°Cに戻し、EVLPプロトコルの終了までこの温度を維持します。
  9. 生理学的変数 (肺コンプライアンス)、浮腫形成、および分子エンドポイント (熱ショックタンパク質、抗酸化酵素、炎症性サイトカイン、およびアポトーシス、オートファジー、小胞体ストレス、および内皮細胞損傷のバイオマーカーの発現) を決定します。

3. 熱プレコンディショニングのための詳細なEVLPプロトコル

  1. 動物の準備
    1. カニューレや手術器具など、必要な材料を準備します(図6A、Bおよび材料表)。
    2. 動物の体重を量って、投与されるすべての物質、灌流液の流量、および換気パラメータの適切な投与量を計算します。
    3. 麻酔薬混合物を準備します:80 mg / kgのケタミンと8 mg / kgのキシラジンを同じ注射器に入れます。
      注:麻酔薬は安全なキャビネットに保管する必要があります。
    4. ヘパリン、等張生理食塩水(1 mLシリンジ)で体重1.7 U / gを調製します。
    5. 5%イソフルラン(専用の誘導チャンバーで気化)を使用して動物を麻酔し、続いて調製した麻酔薬混合物を腹腔内注射します。フェイスマスクを介して1〜2%イソフルランで麻酔を維持します。
      注: 失血中のあえぎを避けるために、深い麻酔を維持することが重要です。
      オペレーターを保護するために、イソフルラン抽出システムを備えたセットアップを使用してください。
      すべての針と注射器は、適切なバイオハザードと鋭利な廃棄物容器に捨ててください。密閉された鋭利なバイオハザード容器は、指定された廃棄物の流れを通して廃棄されます。
    6. 動物を喉から陰茎の部分まで剃り、湿らせた温かい紙を使用して残っている毛皮を取り除きます。
    7. 後足をつまんで麻酔の深さを確認します。反射がある場合は、イソフルラン濃度を上げます。
    8. 動物を仰臥位に置き、粘着テープで四肢すべてを固定します。
  2. EVLPに対する心肺ブロックの抽出
    注:この手順では、さまざまなステップをタイムリーで非外傷性で再現性の高い方法で実行するための集中的なトレーニングが必要です。最もデリケートなステップは肺動脈カニューレ挿入であり、最良の結果を得るには、鏡面手術顕微鏡を使用して拡大下で実行する必要があります。完全な手順は、よく訓練された 1 人の研究者によって実行できます。このような実験的独立性を達成するには、経験豊富な研究者の監督下で最低 15 回の完全な手順が必要です。
    1. 喉の正中線の皮膚をそっと持ち上げ、小さなハサミを使用して尾側から頭側の軸に沿って5cmの縦方向の切開を行います。
    2. 唾液腺葉を分離し、喉頭と気管がはっきりと露出するまで、湾曲した鉗子を使用して胸骨舌骨筋の筋膜を注意深く解剖します。
    3. 気管の下に4-0のシルク縫合糸を通し、鉗子を気管の下に置いたままにして、きれいな結び目を準備します。
    4. Stahl 式33 を使用して、生体内換気と肺調達の一回換気量 (Vt) を計算します。
      figure-protocol-2× figure-protocol-3
    5. 生体内換気および肺調達専用の人工呼吸器( 材料表を参照)を、呼吸数70回/分、吸気酸素分率(FiO2)0.5、呼気終末陽圧(PEEP)3cmH2O。
      注:PEEPを3 cm H2Oに設定するには、人工呼吸器の呼気アームを、水で満たされた容器の表面から3 cm下に挿入されたプラチナ硬化シリコンチューブに接続します。
    6. 2つの軟骨リングの間に横方向の切開を作成し、換気のために外径2 mmのカニューレ(長さ14 mm、EVLP換気カニューレ、 図6B)を挿入し、縫合糸を締めて固定します。
    7. カニューレを人工呼吸器に接続し、人工呼吸器の呼気アームに接続された水で満たされた容器に気泡が存在することにより、効果的な換気を確認します。
    8. 先端が鈍いハサミを使用して、腹部に沿って皮膚を切開し、腹腔に入り、正中線の腹壁の筋肉を横隔膜まで切開して続けます。
    9. 綿棒を使用して腸をそっと脇に動かし、下大静脈を露出させます。
    10. 調製したヘパリン溶液を静脈に注入し、5分間循環させます。次に、大静脈と大動脈を横断して放血します。
    11. 動物が完全に失血し、死亡が確認されたら、換気を停止し、人工呼吸器を気管カニューレから外して肺を収縮させ、温虚血の発症を示します。総温虚血時間(WIT)を1時間に保ちます。
      注: 臨床 DCD 肺提供で報告されている WIT の中央値は 33 分ですが、1 年生存に対する最大 60 分の WIT 持続時間の有害な影響は報告されていません。したがって、現在、ほとんどのセンターは、WIT34 の許容上限として 60-90 分に同意しています。したがって、前に詳述したように、ラットモデルでの1時間WITの使用は、臨床シナリオ35に関連しています。
    12. 1時間の合計温虚血時間が終了する15分前(すなわち、温虚血の45分後)に、60 mLのシリンジ(ホルダーに固定)に冷たい(4°C、冷蔵庫に保管)保存液( 表1の組成を参照)。
      注:注射器の底は動物の20cm上に設定されています。氷水に浸したシリコンチューブを使用して、シリンジをPAカニューレに接続します(図6C)。
    13. 組織の損傷を避けるために、鈍い端のリスターハサミを使用して正中胸骨切開を行い、ゴムバンドに取り付けられた鈍いリトラクターと横隔膜に取り付けられたマイクロモスキート止血剤を使用して胸壁を慎重に引っ込めて肺を露出させます。肺実質との直接接触を避けてください。
      注:このステップから、組織の乾燥を防ぐために、必要に応じて肺の表面に少量の生理食塩水を塗布します。
    14. 心臓の左心室の頂点に「X」字の切開を行い、心臓内のハサミを左心房までスライドさせて、後でLAカニューレを挿入しやすくします。
    15. メインPAの下に5-0シルク縫合糸を通し、事前に結ばれたダブルノットを準備し、自家製のホルダーで縫合糸の片側を保持します(図6D および 図7A)。
    16. 後でLAカニューレを固定するために、心臓の周りに追加の縫合糸を準備します(図7B)。
    17. メインPAに小さな切開を行い、PAカニューレを挿入し、気泡が入らないようにします。
    18. PAカニューレを介して25 mLの低温保存液をすぐに肺に灌流し、寒冷虚血時間を開始します。
      注:この灌流には、上記のホルダーのシリンジの高さからの受動圧を使用します。
    19. カニューレを適切な縫合糸で所定の位置に固定します。
    20. PA カニューレ挿入の直後に、気管カニューレを人工呼吸器に再接続し、初期設定で換気を再開し、呼吸数を 25 呼吸/分に減らします。
    21. 左心室の切開部から左心房にLAカニューレを挿入します。
    22. 左心房からの流れが妨げられないように注意しながら、2 番目の事前に結ばれた縫合糸 (心臓の周り) でカニューレを固定し、25 mL の保冷液全体を通過させます (~15 分かかります)。
    23. 保存液灌流の最後に、ブルドッグクランプ(図7C、青い円)でPAカニューレをクランプし、チューブから外します。
    24. 気管と周囲の組織を注意深く解剖して肺を動かします。
    25. 肺が完全に膨張している間(1回換気量)、動脈瘤クリップ(図7C、赤い円)を使用して気管をクランプします。
    26. 下行大動脈と他の支持血管を解剖して心肺ブロックを解放し、気管をそっとつかんで持ち上げます。
    27. 心肺ブロックを保存液の入った皿に腹臥位で置き、4°Cで1時間の総冷虚血時間保存します。
      注:手術の最後に、生物学的遺体を廃棄物処理袋に入れ、専用サービスによるさらなる除去を行います。
  3. Ex-vivo 肺灌流と熱プレコンディショニング
    注:プロトコルのさまざまな段階(図 8).
    1. サーモスタットウォーターバスにアイスバケツを入れて、灌流液の温度を15°Cに下げます。
    2. リザーバーに100mLの灌流液を入れ、システム内を循環させます。ヒトアルブミンベースの灌流溶液( 表1の組成を参照)を、 ex-vivo 灌流用の無細胞緩衝細胞外溶液として使用します。
    3. 灌流液のpHを測定し、生理学的レベル(7.35〜7.45)に維持し、それに応じてトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(THAM)緩衝液を追加します。
    4. 心肺ブロックの重量を量り、動脈瘤クリップを気管の所定の位置に保ちながら、換気カニューレから始めてEVLPシステムに取り付けます。
    5. 肺血管系への気泡の侵入を注意深く避けながら、PAカニューレを接続します(気泡トラップが満たされていることを確認してください)。
    6. 数滴の灌流液を排出し、LA カニューレに接続します。
    7. ドレナージ回路に接続された流出ラインの高さを調整して、左心房圧を3mmHgに設定します。
    8. 重量モジュールをゼロにし、EVLP全体で心肺ブロックの重量変化を監視します。
    9. Lindstedt と Schaeffer によって開発された式を使用して、理論上の心拍出量 (CO) を計算します。
      figure-protocol-4
    10. 表2に概説されているように、灌流(理論COの2%)を開始し、指定されたパラメーターに従って灌流液流量(理論COの7.5%)と温度を徐々に増加させます。
      注:EVLP中、灌流液流量は計算された理論COの2%から7.5%の間で設定されます。この低い灌流液流量により、肺動脈圧を正常範囲内に保ち、特に温かい虚血性損傷肺における早期肺水腫のリスクを軽減できます。これにより、ユーザーは長時間準備を維持することができます。他の研究者はラット EVLP に同等の流量を使用しましたが、他の研究者は理論上の CO38 の最大 20% の流量を使用しました。
    11. ウォーターバスの温度を徐々に上げて、灌流液の温度を調整します。
      注意: 怪我をしないように、すべての暖房器具に手を近づけないように注意してください。
    12. 灌流液温度が35°Cに達したら、気管から動脈瘤クリップを取り外し、 生体外 換気専用の人工呼吸器を始動することにより、人工呼吸器を開始します( 材料表を参照)。
      注:圧力校正は、2点校正(0および30 cm H2O)を使用して14日ごとに実行されます。チューブの校正は、プログラムされたプロトコルに従って各使用時に実行され、チューブとカニューレの抵抗に関連する外部要因を補正します。
      1. 気道内圧の測定を伴う肺容積の段階的な増加のプログラムされたプロトコルに従って、専用の時点で呼吸信号と肺コンプライアンスを継続的に記録するため、人工呼吸器の設定とデータ収集には参照ソフトウェアを使用します(フローチャート、 図8を参照)。
      2. コンプライアンスは、圧力体積ループの収縮リムに適合した方程式によって自動的に計算されます(Salazar-Knowles方程式)。
      3. すべての換気データを表示し、専用のパソコンに保存し、スプレッドシートにエクスポートします。選択した時点でデータを抽出し、別のスプレッドシートに転送し、統計分析ソフトウェアにコピーして貼り付けます。
    13. 呼吸数と一回換気量をそれぞれ 7 ストローク/分と 3 mL/kg で 10 分間設定し、その後 15 ストローク/分と 6 mL/kg に 10 分間増やし、最後に 30 ストローク/分と 6 mL/kg に増やします。EVLP全体で呼気終末陽圧(PEEP)を3 cm H2Oに設定します(表2)。
    14. 気道内圧を 15 cm H2O に 6 秒間設定して無気肺を予防するために、EVLP の 30 分ごとにリクルートメント操作を適用します。
    15. 1時間、2時間、3時間、4.5時間、および6時間のEVLPで、肺のコンプライアンスとピーク吸気圧(Pmax)を決定するために、総肺容積10 mL / kg体重まで段階的な肺膨張を適用します。
      注: コンプライアンス測定は、上記の採用操作に従って実行されます。
    16. 60分間のEVLP後、流入PAカニューレで灌流液温度を37°Cに達するように上げます。
    17. EVLPの60分後に ex-vivo 加熱プロトコルを開始します。
    18. 図2、図3、および図4-5に示すように、水浴温度を43°Cまで上げて、流入PAカニューレで41.5°Cに達します(これには~5分かかります)。
    19. この温度を60分から90分EVLPまで維持します(合計30分)。
      注:以前の研究では、41.5°Cで30分間が肺全体のレベルで熱損傷を促進しないことを示しました29。そのような条件下での熱損傷をテストするために、特定の in vitro 細胞生存率アッセイは実施しませんでした。
    20. 30分間加熱した後、ウォーターバスに氷を加えて、流入カニューレの温度を急速に(5分間)37°Cに戻します。
      注:対照群では、熱プレコンディショニングを行わずに、灌流液温度はEVLP全体で37°Cに維持されます( 表2を参照)。「偽加熱」グループ(温度上昇のないウォーターバス熱調整など)は組み込んでいません。
    21. EVLPが終了するまで、流入PAカニューレの灌流液温度を37°Cに保ちます。
    22. 図1-2Bに示すように、回路に接続されたサンプリングポートの1つ(肺製剤の上流または下流)から、EVLPの1時間、2時間、3時間、4.5時間(各時点で1〜2 mL)、および6時間(10 mL)で灌流液のサンプルを収集します。サンプルをガス分析(CG4+カートリッジを使用したpH、PCO2、PO2の測定)にすぐに使用してください。さらなる生化学的測定のために、サンプルを遠心分離し(500 × g、4°Cで10分)、使用するまで透明な上清を-80°Cに保ちます。
    23. 6時間のEVLP後、動脈瘤クリップを気管に再度適用し(肺が完全に膨張したら)、ブルドッグクランプでPAカニューレをクランプします。
    24. 心肺ブロックの重量を量り、最終的な重量を求めます。
      注:EVLP中の体重の増加は、最終体重と初期体重の差として評価することも、上記の重量モジュールを使用してEVLP中に継続的に監視することもできます。
    25. 肺を注意深く解剖し、個々の葉を分離します。
    26. 液体窒素でスナップフリーズし、生化学分析のために-80°Cで保存するか、組織学的評価のためにパラホルムアルデヒド(PFA)で固定するなど、下流の用途のために組織を保存します。左肺を保持し、肺移植の準備をすることができます。

4. 統計

  1. 動物を特定の治療グループに割り当てます(対照対熱プレコンディショニング、各実験エンドポイントのn = 5 /グループ)。
    注:動物をどちらかのグループにランダムに割り当てることはありませんが、グループは毎日交互に行われます。プロトコル(熱対制御)は、実験中に灌流液の温度を厳密に知る必要があるため、盲検化された方法で実行することはできません。対照的に、生物学的および組織学的分析は盲検化方式で行われ、割り当てられた治療群は特定されません。
  2. データを分析します。
  3. SEM±手段として結果を表現します。
  4. コルモゴロフ-スミルノフ検定を使用してデータの正規分布を検証します。
  5. 時点実験では、二元配置分散分析を使用して時間とグループの割り当ての効果を評価し、続いて、1時間を基準として使用して、グループ効果のシダックの事後検定と時間効果のボンフェローニ補正を行います。0.05
  6. 組織学的分析では、10 のフィールド/セクションで血管周囲浮腫を定量化することにより、各サンプルの肺損傷スコアを (盲検法で) 決定します。
    1. 血管周囲浮腫(A)のある血管の相対数を使用します:0:なし。1:軽度(<25%);2:中程度(25〜50%);3:重度(>50%)。
    2. 血管周囲浮腫の厚さを、内血管径のパーセンテージとして計算します(0:浮腫なし、1:<25%、2:25-50%、3:>50%)。
    3. 調べた10のセクションのA + Bの合計を使用して、スコア31を計算します。
    4. ノンパラメトリックマンホイットニー検定(データの正規分布ではないため)を使用して統計的比較を実行し、有意性はp < 0.05に割り当てられます。

結果

肺動脈圧 (PAP)、計算された肺血管抵抗、静的肺コンプライアンス (SPC) やピーク気道内圧 (Pmax) などの換気パラメーターなど、肺の生理学的変数は、処置全体を通じて継続的に監視されます。さらに、ウェイトモジュールは、肺内の体液蓄積を間接的に測定することで、浮腫形成の評価を可能にします。制御肺(Ctrl)に対するサーマルプレコンディショニング(TP)の利点には、SPCの改善(図9A、初期SPC値に対する各時点でのSPCの比率として表される、n = 5/グループ)およびEVLP中の肺重量増加の減少(図9B、n = 5/グループ)が含まれます。データはSEM±平均値として表示されます。

灌流液は、さまざまなバイオマーカーについてアッセイできます。たとえば、熱プレコンディショニングは、EVLPの終わりに内皮細胞バイオマーカーであるフォン・ヴィレブランド(vWF)の放出が大幅に減少することに関連しています(図9C、n = 5 /グループ、SEM±ことを意味します)。

EVLP の終了時に得られる肺組織の形態学的分析には、組織学および免疫組織化学が含まれます。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色切片の例を 図9Dに示し、肺損傷スコアとして表される、熱プレコンディショニングに曝露された肺の組織学的損傷の減少を示しています(図9E、n = 5 /グループ)。スコアは、10 のフィールド/セクションで血管周囲浮腫を定量化することによって確立されました (プロトコル ステップ 4.6.1 および 4.6.2 を参照)。調査した10のセクションのA + Bの合計を使用して、スコア31を計算しました。

EVLP 終了時の肺組織の分子分析には、RNA またはタンパク質発現プロファイリングが含まれます。一例として、誘導性熱ショックタンパク質HSP70のタンパク質発現レベルをELISAによって測定して、熱プレコンディショニングに曝露された肺における熱ショック応答の発達を示すことができます(図9F、EVLPの異なる期間、各時点でn = 5 /グループ)。TP群におけるHSP70の発現は、3時間のEVLP後、つまりTP終了の90分後にピークに達し、その後EVLPの終了まで安定していました。データはSEM±平均値として表示されます。

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図1:EVLPプラットフォームの説明。(1) 灌流液用の二重壁リザーバー。 (2A) 灌流液循環用ローラーポンプ。 (2B) 灌流液サンプリング(生化学測定およびガス分析)用のローラーポンプ。 (3) サーモスタットウォーターバス。 (4) ガスタンクに接続された膜式ガス交換器(図示せず)。 (5) 左心房圧センサー。 (6) 加熱および密閉されたチャンバー。 (7) EVLP 人工呼吸器。 (8) 温度プローブと温度計。 (9) 心肺ブロックの接続プラットフォーム、その要素を 図2に詳述します。(注:PA圧力センサーは見えません)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:心肺ブロックの接続プラットフォーム。(1) 肺動脈への流入カニューレ。 (2) 左心房からの流出カニューレ。 (3) 気管カニューレの接続。 (4) ウェイトモジュール。 (5) 流入カニューレにしっかりと取り付けられた自社設計の温度プローブ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:信号トランスデューサ/アンプとアナログ/デジタルコンバータボックス。肺 動脈圧トランスデューサー/アンプ。 ポンプ速度フローコントローラー。 (C). 左心房圧トランスデューサー/アンプ。 (D).肺重量モジュール。 (E). アナログ/デジタルコンバーター。 (F). データの表示と記録のためのパソコン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:EVLP中の灌流液の温度維持。(1) サーモスタットウォーターバス。 (2) サーモスタットウォーターバスからの水が循環する二重壁のガラス容器を備えた灌流液リザーバー。 (3) サーモスタットウォーターバスに接続された加熱水容器内の加熱コイルチューブ。 (4) ウォーターバスからの温水循環のための二重壁ガラス容器を備えたオルガンチャンバー。(5) 電子体温計と自社設計の温度プローブは、流入カニューレにしっかりと取り付けられています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:熱プレコンディショニングの最適温度の特定。(A) さまざまな加熱温度を評価するためのEVLPプロトコル。EVLPの60分から90分まで、灌流液温度を指示された温度で上昇させました。EVLPの90分で、EVLP終了まで90分間温度を37°Cに戻し、さまざまな生理学的および分子的測定が行われました。 (B) 生理学的および分子的パラメータに対するさまざまな加熱温度の影響の結果の概要(緑は好ましい効果、赤は好ましくない影響、オレンジは混合効果を示します)。41.5°Cの加熱温度が最も保護効果を発揮しました。略語: EVLP = 生体外 肺灌流;TP = 熱プレコンディショニング。この図は、Ojanguren et al.21から修正されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:手術材料。(A) 心肺ブロックを抽出するための器具: 動脈瘤クリップ ホルダーおよび動脈瘤マイクロクリップ (ヤサルギル システム)、ブルドッグ クランプ、はさみ、マイクロハサミ、ゴムバンドに取り付けられたレトラクター。 (B) 肺動脈 (PA)、左心房 (LA)、および気管用の EVLP カニューレ。 (C) 肺の冷たい灌流液をフラッシュするための自家製の灌流システム。動物のPAのレベルと注射器の底の間の距離は20cmに設定されています。 (C) 自家製ホルダー。(図示せず:手術用顕微鏡、人工呼吸器、麻酔セットアップ)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:外科的準備の代表的な写真(A) 肺動脈の周りに事前に結ばれた結び目。 (B) 心臓の先端の周りにあらかじめ結び目を結びます。 (C) PA カニューレのブルドッグ クランプ (青い円) と気管の動脈瘤クリップ (赤い円)。略語:PA =肺動脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:フローチャート。 プロトコルのさまざまな段階を通過した進行を導くための主要なステップ。1 時間から 1.5 時間の EVLP の間の期間は、グループの割り当て (コントロールと熱プレコンディショニング) に従って治療プロトコルを示すために拡大されます。略語:CI =寒冷虚血;EVLP = 生体外 肺灌流;PA = 肺動脈;SPC = 静的肺コンプライアンス;TP = 熱プレコンディショニング;WI = 温虚血。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:損傷したラット肺における熱プレコンディショニングの効果の代表的な結果。 1時間の温虚血によって損傷した肺をEVLPシステムで6時間灌流しました。EVLPの60〜90分から、肺のグループを41.5°Cで熱プレコンディショニングにかけました(TPグループ)。肺の対照群は、EVLP 全体を通じて 37 °C に維持されました。 (A) 初期値の比率として表される静的肺コンプライアンス (SPC) は、対照 (Ctrl、n = 5) および TP 肺 (n = 5) で表されます。SPCはTP肺でよりよく保存されました。 (B) 対照 (n = 5) および TP 肺 (n = 5) における EVLP 中の肺の重量増加。TP群では浮腫形成が大幅に減少しました。 (C) 内皮細胞バイオマーカーフォン・ヴィレブランド因子の灌流液中の放出は、対照群(n = 5)と比較してTP群(n = 5)で抑制された。 (D) 対照(n = 5)およびTP肺(n = 5)におけるEVLPの末端における肺の肉眼的および顕微鏡的(ヘマトキシリン-エオシン染色)の外観。 (E) 肺損傷スコア (組織学的損傷の定量化) は、対照群 (n = 5) と比較して TP 群 (n = 5) で低かった。 (F) 対照群とTP群で1、2、3、4.5、および6時間のEVLP後に測定された肺組織抽出物中の誘導性熱ショックタンパク質HSP70のタンパク質レベル(各時点でn = 5 /グループ)は、TP群で顕著な熱ショック反応を示しました。TP群におけるHSP70の発現は、3時間のEVLP後(TP終了後90分)でピークに達し、その後EVLP終了まで安定していました。
すべてのグラフは、SEM±平均を示しています。時間経過実験 (A-C、F) では、二元配置分散分析を使用して統計比較を行い、続いてグループ効果のシダック検定と時間効果のボンフェローニ調整を行いました (時間 1 時間を基準とする)。肺損傷スコア (E) については、マンホイットニー検定を使用して統計的比較が行われました。* p < 0.05 (グループ間差)、† p < 0.05 vs 1 h EVLP。略語: Ctrl = control;EVLP = 生体外 肺灌流;HSP70 = 熱ショックタンパク質 70;SPC = 静的肺コンプライアンス;TP = 熱プレコンディショニング。Parapanov et al.23から修正。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:プロトコルで使用される溶液の組成。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 2: 灌流流量、流入温度 (肺動脈カニューレのレベル)、および換気の経時的な EVLP 設定。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表 3:トラブルシューティング。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足資料。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

再現性があり生理学的に関連するラット EVLP モデルの開発は、肺移植研究における重要な前進を表しています。ラットとヒトの肺の間には有意な種差があり (最近 1 でレビュー)、特にラット肺の脆弱性が高いにもかかわらず、ラット EVLP モデルは、高い再現性と低コストで薬理学的および非薬理学的介入を提供します。EVLP は、ドナーの肺機能を評価し、虚血再灌流損傷などの臨床的損傷シナリオをシミュレートし、移植前に治療介入を実施するための独自のプラットフォームを提供します 2,39,40。これに関連して、ラットEVLPモデルは、厳密に制御された条件下でハイスループットの機構調査を可能にします33。近年、いくつかのグループがラットEVLP技術の改良に貢献しています。Nelson et al. 基本的な手続き上のガイダンスを提供した39.循環死(DCD)シミュレーション41後の提供を模倣するように調整されたモジュール式EVLPセットアップを提案しました。Gouchoeらは、人工酸素担体42を使用して新しい灌流液製剤を調査し、Oliveiraらは、長期の寒冷虚血保存後の炎症に焦点を当てました38。この既存の知識に基づいて、私たちの現在のプロトコルは、温虚血によって損傷したラット肺移植片の再調整のための内因性保護メカニズムを活性化するように設計された、新しい非薬理学的戦略、すなわち熱プレコンディショニングを導入しています。DCD状態をシミュレートする損傷肺モデルは、雄のSprague-Dawleyラットで実施されました33。

このプロトコルの確立には、肺の生存率と再現性に重大な影響を与える技術的に要求の厳しいいくつかのステップに細心の注意を払う必要がありました。肺回収は、実質損傷を避けるために最小限の操作で実行する必要があります。あえぎによる肺うっ血や失血不良を防ぐためには、麻酔の深さが最も重要です。小さな塞形でも浮腫を引き起こす可能性があるため、カニューレ挿入および回路プライミング中の気泡を厳密に回避することが不可欠です43。一般的なプロトコルの課題に対する具体的なトラブルシューティングのアドバイスを表 3 に示します。換気と灌流の設定は安全な範囲内で調整できますが、圧外傷または容積外傷を防ぐために肺保護戦略を維持する必要があります44。灌流液の流量は、ブタやヒトなどの大型モデルでは 20% であるのに対し、ラットでは推定心拍出量の最大 40% まで増加させることができますが、慎重に滴定する必要があります45。私たちのプロトコルでは、より低い灌流液流量 (理論心拍出量の 7.5%) を使用して、肺動脈圧の急上昇と温虚血性損傷肺における早期肺水腫の発症を防ぎ、それによって長期にわたる準備を可能にします。一部の研究室では、炎症を軽減するために灌流中にコルチコステロイドを投与していますが46,47、その既知の抗炎症効果は、いくつかの実験結果を混乱させる可能性があるため、肺損傷と炎症過程を研究する能力を維持するためにモデルではコルチコステロイドを使用しません。

熱プレコンディショニングには、正確な温度制御が必要です。熱はリザーバーから肺までのチューブに沿って失われるため、灌流液温度は流入カニューレで監視し、ウォーターバスの設定は、調製内の目標を達成するために、所望の流入温度よりわずかに高く保たなければなりません。センサーは、精度を確保するために、マルチチャンネルPCE-T 1200デジタル温度計を使用して毎年校正されます。

私たちの発見は、従来の温熱療法の重要な制限にも対処しています。全身の熱適用は、不正確な温度調節、全身の副作用、および臓器特異性の欠如によって制約されます。EVLP は、制御された局所的な環境を提供することにより、これらの障壁を回避し、肺組織への熱ストレスの正確な伝達を可能にします29。この方法により、熱損傷を引き起こすことなく保護細胞応答を最適化するための 2 つの重要なパラメーターである熱応力の大きさと持続時間の両方を厳密に変調できます。さらに、当社のEVLPプラットフォームでは、分子分析、組織学的分析、機能分析など、複数のダウンストリーム評価が可能です。重要なことに、EVLP を受けた肺も移植できるため、in vivo で EVLP 移植後の機能を直接評価できます 29。したがって、このモデルは、分離臓器レベルと移植後レベルの両方での評価をサポートします。これに関連して、EVLP 中に 41.5 °C に一時的にさらされる熱プレコンディショニングの統合が有望な介入として浮上します。この方法は、熱ショック反応やその他のストレス適応経路を刺激することにより、薬理学的交絡因子を生み出さずに移植片の回復力を高めます。私たちの結果は、熱プレコンディショニングが肺移植片の生理機能を改善し、浮腫の形成と炎症メディエーターおよび細胞損傷のバイオマーカーの放出を減少させることを示しています(熱処理された肺のEVLP灌流液中のフォンヴィレブランド因子のレベルの低下によって例示されます)。形態学的分析は、構造的損傷を軽減し、組織の完全性を維持しながら、この介入の保護効果をさらに裏付けます。ほとんどの実験ラットEVLPデータはオスで生成されており、性別特異的な洞察が制限されています。2件の研究では、女性の転帰が異なることが報告されており、1件では再灌流障害が減少し、別の件では炎症が増加しました48,49。私たちの研究ではオスを使用しましたが、以前にメスを使用したブタEVLPモデルでTPの利点が観察され、29性別間の関連性が示唆されました。

私たちの方法の重要な制約と欠点を強調する必要があります。まず、肺が実際の望ましい温度で灌流されていることを保証するために、温度センサーをしっかりと適用して、肺を流入カニューレで監視する必要があります。第二に、温度変化は非常に短時間で得られることが必須であり、そのためには加熱には高速応答の温泉水浴を使用し、急速冷却のために水浴に氷を追加する必要があります。第三に、熱ストレスに対する生理学的反応は、使用される種によって異なる場合があり、ストレスのレベルと持続時間に大きく依存します。したがって、このプロトコルが異なる動物種またはヒトの肺に適用され、適用された熱ストレスの保護効果と潜在的な有害な影響の両方に関連する特定のエンドポイントを評価する場合に備えて、さまざまな加熱温度を使用してさまざまな期間パイロット実験を実行することが必須です。第四に、熱応答性遺伝子の速度論的発現により、熱プレコンディショニングの効果は、熱ストレス適用後の回復時間に依存します。このトピックに関する最近の出版物30 に示されているように、熱適用のこのような時間依存効果を評価するには、異なる熱ストレス後の持続時間 (つまり、異なる EVLP の持続時間) を使用した実験が必要です。

全体として、私たちの現在の研究は、限界ドナー肺の質を改善するための実行可能な戦略として熱プレコンディショニングを組み込んだ、詳細で再現性のあるラットEVLPプロトコルを確立しています。このプロトコルはスケーラブルで、より大きな動物またはヒトのEVLPシステムに適応できるため、その翻訳関連性が強化されます。このモデルは、方法論的厳密さと生理学的忠実度の両方を提供することにより、虚血再灌流損傷を軽減し、移植後の肺移植の転帰を改善することを目的とした非薬理学的介入を模索するための新たな道を開きます。

開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

スイス国立科学財団(Nr 310030_212252)からTKとLLへの助成金によって支援されています)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
<ストロング>ジェネラル装備
動脈瘤クリップ B. ブラウンFE762K
空気/表面ビード熱センサーTESエレクトリカルエレクトロニック社/Distrelec AGTP01/176-67-162
鈍いリトラクターファインサイエンスツール18200-09
ブルドッグ・セラフィンファインサイエンスツール18051-50
凝視圧縮 プロメディカル25404
麻酔用接続キットヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3076
綿棒適用SA6001109
解剖ハサミB. ブラウン BC165R
ネズミ用のフェイシャルマスクテムセガPFM0006
ヘパリン 5000 U/mLB. ブラウン3522430
麻酔のための誘導チャンバーヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置50-0116
虹彩解離鉗子の完全湾曲アスクラップ OC022R
イソフルランプロヴェットAG2222
イソフルラン蒸気19.3ロサッチャー医療CV30-310 O2/Air
iSTAT4カートリッジアクソン研究所 AG03P85-25
ケタゾール100(100 mg/mL)E. グローブ AG 博士QN01AX03
リスター、ハサミ B. ブラウンBC876R
マイクロシザーズ、カーブドブラント/ブラントAesculap FM011R
マイクロアドソン鉗子ファインサイエンスツール11018-12
マイクロモスキート止血器ファインサイエンスツール13011-12
顕微鏡OPMI MDUツァイス267067
NaCl 0.9% B. ブラウン534534
針 23 G x 25 mmBD マイクロランス4300800
針 25 G x 25 mmBD マイクロランス3300400
パーファデックス(保存液)Xvivo パーフュージョンAB19811
パーフュージョン注射器 60ml ルアーロックBDプラスチック300865
ラソールAesculap GT-421
スケールメットラー・トレドPB602-L
シルク縫合 4-0B. ブラウンF1134035
シルク縫合 5-0B. ブラウンF1134027
スティーン(灌流液)Xvivo パーフュージョンAB19004
手術用手袋アンセル93-843
注射器1mL、オムニフィックス-FB. ブラウン9161406V
テープルコフィックス02136-00
温度計TESエレクトリカルエレクトロニック社1303
フォーモル を含む管;バイオシステムズ・スイスAG87-0960-00-10113
人工呼吸器(EVLP)(エスピルプロトコルに従って潮流量を設定する)フレキシベントFX3
人工呼吸器(肺の調達)およびnbsp;(設定の潮流量は7.69*(体重(kg))^1.04)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置683
WEITLANER リトラクターB. ブラウンBV073R
キシラゾール(1 mg/mL)E. グローブ AG 博士QN05CM92
ヤサルギル申請者B. ブラウンFE502T
IPL-2 EVLPシステム
正圧用のアダプターヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3635
AME 14 - SC0062 ポンプチューブ(タイゴン)3ストップカラー付き、12セットパックヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0126
AME 24 - SC0072 ポンプチューブ(タイゴン)3ストップカラー付き、12セットパックヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0155
孤立灌流肺サイズ2(IPL-2)タイプ829/2の基本ユニットヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-2266
ファイバーオキシケーション装置D150の接続キットヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3765
EBM浮腫バランスモジュール(EBM)とセンサーヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-4626
ファイバーオキシジェネータータイプD150、5個入りパックヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3762
OPテーブルサイズ5用の大動脈または気管カニューレをクランプするホルダーヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3855
酸素装置用のホルダーヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3061
HSE重量測定システムヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-4604
HSE-BDAS Windows 2000、XP、Windows 7向けの基本データ取得ソフトウェアヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-1712
HSE-USBデータ取得ハードウェア、Windows 10または11向けのスタンドアロンUSBボックスヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3330
ISM 827/230 Vローラーポンプレグロアナログ、4チャンネル、0.003-35 ml/min(2台)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0114
左心房カニューレ(DD 4.0 mm)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0712
ミニフロースルー酸素電極(1/16インチフィッティング付き)(オプション)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-4189
ホルダーに装着したファイバーオキシケータータイプD150の取り付けキットヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3759
ワンウェイストップコックタイプ9500(PA用、ロサンゼルス用1つ)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0097
OPPMプラグシス酸素分圧モジュールタイプ697 (任意)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0210
Plugsys 基本システムケースタイプ 603ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0045
pO220ml の20パッケージはゼロ溶液;(任意)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3812
圧力トランスデューサー P75 タイプ379/HSE、範囲は-75から+75 mm Hg(PA、LA)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0020
肺動脈カニューレ(外径2.0mm、頭部直径2.5mm)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0711
バッファー溶液用のリザーバー(ジャケット付き)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3496
SCP プラグシスサーボコントローラー 灌流タイプ704用ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-2806
pO2またはpCO2ミニセンサー用のシールドケース (任意)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-4196
単一のO2またはCO2センサー用の小型マウントプレート。(任意)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3000
TAM-A プラグシストランスデューサーアンプモジュールタイプ705/1(PA用、LA用1つ)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0065
サーモスタット循環器E 103(3L)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0125
3ウェイストップコックタイプ9560 R(PA用とLA用1つ)ヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-0096
ジャッキバッファーリザーバー用のチューブセットとフルードライン遮断バルブヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3456
換気カニューレ(気管)外径2.0mm、L14mmヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置73-3384
Computer Softwares
HSE-BDAS Windows 2000、XP、Windows 7向けの基本データ取得ソフトウェアヒューゴ・ザックス・エレクトロニク - ハーバード装置V2.0
Excelマイクロソフト2502、Microsoft 365
フレキシウェアサイレック8
GraphPad プリズムグラフパッド・ソフトウェア株式会社10.0.1
スプラグ・ドーリーのネズミとnbsp;シャルルリバー研究所(フランス・サンジェルマン・ニュエル)およびnbsp;

参考文献

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移植前の損傷した肺移植片のリハビリテーションのための Ex-vivo 肺灌流中の熱プレコンディショニング
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