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方法論記事

CD8+CD103+トレッグは、マウスにおけるCD4+ T細胞介在炎症の抑制と眼表面の完全性保護を通じてドライアイ病を軽減します

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DOI：

10.3791/69110

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2025年11月21日

 , 
1Department of Ophthalmology, Jinan Second People's Hospital

この記事について

サマリー

ここでは、CD8+CD103+調節性T細胞の導入を免疫療法介入として示すプロトコルを提示し、病原性CD4+ T細胞応答の包括的調節を通じて乾燥性ストレス誘発性ドライアイ疾患を改善することを示します。

要約

CD8+CD103+調節T細胞は、自己免疫疾患において治療の可能性が示された専門的な免疫抑制集団を表します。しかし、眼表面炎症における役割はまだ解明されていません。本プロトコルは、乾燥ストレスにさらされたマウスからCD8+CD103+ T細胞を単離し、実験的ドライアイ疾患における養子移植による治療効果を評価する体系的なアプローチを説明しています。この手法には、CD8+CD103+ T細胞精製のための磁気活性化細胞選別、標準化された乾燥ストレス誘導、涙液生成測定、角膜関壁透過性試験、炎症メディエーターの分子解析を含む包括的な機能評価が含まれます。代表的な結果は、CD8+CD103+ T細胞療法が涙液生成を有意に回復させ、結膜のゴブレット細胞群を保持し、角膜上皮のバリアの完全性を維持したことを示しています。治療によりマトリックスメタロプロテイナーゼの発現が大幅に抑制され、アポトーシス細胞死が減少し、サイトカインプロファイルを炎症促進から組織保護パターンへと調整しました。このプロトコルは、眼組織におけるCD4+ T細胞の浸潤を効果的に減少させると同時に、病原性IL-17AおよびIFN-γ産生を抑制し、保護的なIL-13レベルを高めました。このアプローチは、眼表面疾患におけるCD8+CD103+ T細胞媒介免疫調節の研究に向けた堅牢な実験的枠組みを提供し、ドライアイ疾患管理のための新規細胞ベースの治療法開発の基礎的手法を確立します。

概要

ドライアイ病(DED)は、世界的に深刻な健康問題として広く普及し、日常生活を妨げる眼表面疾患であり、世界人口の10〜30%に影響を及ぼし、患者の生活の質、仕事の生産性、心理的健康に大きな影響を与えています(1,2,3)。DEDの病態生理は、涙膜の不安定性、眼表面の炎症、神経感覚異常の複雑な相互作用を含み、これらが組織損傷と機能障害の悪循環を永続させます。分子レベルでは、涙の高浸透圧は中心的な病原性メカニズムとして機能し、ストレス応答経路を活性化し、炎症誘発因子の放出を誘導し、最終的に眼表面微小環境の繊細な恒常性バランスを損なう連鎖的な炎症イベントを引き起こします5,6,7。

DEDの免疫学的状況は適応免疫応答が支配的であり、CD4+ T細胞介在免疫は眼表面の劣化と慢性炎症の持続に重要な役割を果たします8。CD8+ T細胞は、眼組織内の正常な恒常性免疫細胞集団の重要な構成要素であり、生理的条件下で免疫監視と組織の完全性を維持します9。画期的な研究により、乾燥ストレス(DS)が抗原提示細胞を活性化し、CD4+ T細胞を病原性表現型に誘導することが示されました。これにより、T細胞欠損のヌードマウスに移植されると自己免疫性の涙性角結膜炎(KCS)を自律的に誘導し、ヒトDED10,11の主要特徴を再現します。

CD4+ T細胞応答の調節異常がDED病因に中心的役割を果たしていることから、病原性T細胞免疫の調節を標的とした治療戦略が、この疾患の管理において有望なアプローチとして浮上しています。この文脈で、CD8+調節T細胞(Treg)、特にCD8+CD103+サブセットは、強力な免疫抑制能力と多様な自己免疫および炎症疾患における組織保護機能により大きな注目を集めています。これらの特殊な調節集団は、サイトカイン媒介による抑制、直接的な細胞間接触阻害、エフェクターリンパ球機能の代謝調節など、複数の機構を通じて免疫応答を調節します(12,13,14)。インテグリンαEβ7(CD103)は重要なホーミング受容体として機能し、上皮内リンパ球の粘膜組織間の位置調整を促進し、CD8+CD103+ Tregが炎症部位で局所的な免疫調節効果を発揮できるようにします15。

CD8+CD103+ Tregが自己免疫粘膜疾患16、17、18のさまざまな疾患における有害な免疫反応の緩和に有意な治療的可能性を持つという証拠が増えています。これらの細胞は独特の輸送パターンを示し、粘膜部位に優先的に蓄積し、組織破壊的な免疫応答を効果的に打ち消しつつ、治癒と恒常性を促進します。最近の研究では、CD8+CD103+ T細胞が眼表面免疫に果たす役割が明らかになり始めており、DS曝露後の頸部リンパ節での数値増殖や結膜組織への移動能力(19,20,21,22)が示されています。しかし、これらの興味深い観察にもかかわらず、CD8+CD103+ T細胞がドライアイ病因に与える具体的な機能的寄与や、CD4+ T細胞介在性眼表面損傷の調節における治療的可能性については、いまだに完全には解明されていません。

CD8+CD103+ Tregsの採用移管は、人工涙液、抗炎症薬、免疫抑制薬などの従来のDED治療法に対し、症状的な症状だけでなく病原性免疫機構を標的とする明確な進歩を示しています(23)。免疫機能を広く抑制する全身免疫抑制療法とは異なり、CD8+CD103+Tregベースの介入は、病原性CD4+ T細胞応答の標的調節を行いつつ、保護免疫を維持します。このアプローチは、間葉系幹細胞の応用やCD4+CD25+ Treg移植などの既存の細胞療法を補完し、CD103を媒介するホーミング機構を通じて粘膜組織特異性を高める25。

CD8+CD103+ T細胞がドライアイの病因にどのように影響するかという重要な知識のギャップは、この衰弱性疾患に対する標的型免疫治療介入の開発において大きな障壁となっています。さらに、眼表面炎症における調節T細胞群とエフェクターT細胞群の複雑な相互作用は、新たな治療標的を特定し治療戦略を最適化するために体系的な調査を必要とします。本研究は、確立されたドライアイ疾患マウスモデルにおいて、CD8+CD103+ T細胞媒介によるCD4+ T細胞駆動病原プロセスの調節を包括的に特徴づけることを目的としています。中核的な方法論的革新は、CD8+CD103+調節細胞の逐次分離、その後の採用移転および機能的、組織学的、分子的指標の包括的な評価を通じて治療効果の確立と基礎的なメカニズムの解明です。最終的な目的は、眼表面の免疫応答の理解を深め、ヒトにおけるDED管理のための治療法の可能性を発見することでした。

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プロトコル

動物を用いたすべての実験手順は、ARVOの眼科・視覚研究における動物利用に関する声明に厳格に従って実施され、済南第二人民病院の実験動物倫理委員会の承認を得ています。動物の苦しみを最小限に抑え、使用される動物の数を減らすために、3Rs原則(置き換え、削減、精製)に則り、あらゆる努力がなされました。

1. 動物の準備と実験設計

  1. 承認された実験動物施設(株コード:027)から、特定の病原体なし健康状態を持つ雌のC57BL/6マウスを取得してください。
  2. 管理された環境で飼育動物を飼い、12時間の明暗サイクル(06:00から18:00の照明)、温度22±2°C、相対湿度50〜60%を環境モニタリングシステムで維持します。
  3. 実験手順の前に1週間、動物が慣れる期間を設けつつ、標準的な実験室の食事と水を自由に提供します。
  4. 32匹のマウスを4つの実験群(n=8群)にランダム化し、コンピュータ生成ランダム化を用います:非ストレス対照群(NS)、乾燥ストレス単独(DS)、乾燥ストレスと車両対照群(DS + VC)、乾燥ストレスとCD8+CD103+ T細胞処理(DS + CD8+CD103+)です。
    注意:動物のストレスの兆候(活動量の減少や体重減少が10%を超えるなど)を毎日監視してください。

2. 乾燥応力誘因

  1. 使用直前に0.5mgを0.2mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶かし、最終濃度2.5mg/mLを製造します。
  2. スコポラミンを0.5 mg/kgの用量(約0.04 mL/20 gマウス)で皮下投与し、1日4回、8:00、12:00、15:00、18:00に、27-Gの針を使い5日間連続で投与します。
  3. 可変速ファンを配置し、デジタル風速計の校正を用いてケージレベルで測定した標準化された速度15 m/sの連続的な空気ドラフトを発生させます。
  4. 活性シリカゲル(グレード40、6-12メッシュ)を含む乾燥剤チャンバーを使用し、環境条件をデジタル湿度計で継続的に監視し(精度±2%湿度)、周囲湿度を40%未満に保ちます。
  5. 精密な環境制御システムを用いて、曝露期間全体を通じて22 ± 1 °Cの温度を維持し、継続的なモニタリングを行います。
  6. 動物の脱水症状、体重減少(>15%は除外)、過度なグルーミングや活動量の減少などの苦痛行動の兆候がないか、1日2回観察してください。

3. CD8+CD103+ T細胞の単離と精製

  1. 承認された安楽死プロトコルに従い、以前にCO₂窒息による乾燥ストレスにさらされ、その後子宮頸部脱臼を起こしたドナーマウスを犠牲にします。
  2. 生物安全キャビネット内の無菌器具を用いて、無菌条件下で脾臓および表層頸部リンパ節を採取し、組織を冷たいRPMI-1640培地に10%胎児用牛血清を補足しました。
  3. 無菌シリンジプランジャーを用いて70μmの細胞ストレーナーを通じて組織を機械的に破壊し、2%FBSおよび1mMのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を含むPBSで細胞を2回洗浄することで、単細胞懸濁液を準備します。
  4. 製造元の指示に従い、抗CD8抗体結合磁気マイクロビーズを用いた磁気活性細胞選別を用いてCD8+ T細胞を分離します。
  5. トリパンブルー排除アッセイ(0.4%溶液)を用いて細胞生存率を評価し、自動細胞カウンターを用いて生存可能および非生存細胞を数え、95%を超える調剤のみ実施します。
  6. 抗CD103-APC抗体を1:100希釈で暗闇で30分間、暗闇で30分間希釈してCD103+発現を濃縮します。
  7. LSカラムを用いた抗アロフィコシアニン(anti-APC)マイクロビーズを用いた二次磁気分離を行い、製造元のプロトコルに従いCD8+CD103+二重陽性細胞を得ます。
  8. フローサイトメトリーを用いて、アリコートを抗CD8-FITC抗体および抗CD103-APC抗体で染色し、CD8+CD103+二重陽性細胞の集団を>90%確保してから進行します。

4. 採用転送プロトコル

  1. CD8+CD103+ T細胞懸浮液を、滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水で5分遠心分離し、適切な容量で再懸浮させ×50×gで細胞を分離して準備します。
  2. 乾燥ストレス開始日から-2、0、+2日に、無菌PBS200μLに10×6細胞を腹腔内に注射し、各注射前に穏やかな混合を心がけます。
  3. 同一の注射スケジュールと技術を用いて、実験の一貫性を維持するために車両群に同等量の無菌PBSを投与します。
  4. 細胞準備は氷上に保管し、最適な生存率と機能を維持するために、分離後2時間以内に移植を完了させてください。
  5. 注射部位を左下腹部と右下腹部の間で回転させて局所炎症を最小限に抑え、注射後24時間にわたり動物の有害反応を監視します。

5. 機能評価手順

  1. 涙の発生測定
    1. 涙の生成の概日リズムの変化を考慮し、午後8時に一貫して測定を行いましょう。
    2. 自然な涙発生機構の妨げを避けるため、麻酔なしで適切な拘束具を用いて優しく拘束してください。
    3. フェノール赤色含浸綿糸を下結膜窩に細かい鉗子で正確に15秒挿入します。
    4. 標準化された蛍光灯条件下で、精密なデジタルノギス(精度±0.01mm)を用いて濡れたねじ長を即座に測定してください。
  2. 角膜障壁機能評価26
    1. トレーサー塗布中に2%のイソフルラン吸入で短時間麻酔し、正確な注入を確実にします。
    2. 50 mg/mLのオレゴングリーンデキストラン溶液を、正置換チップ付きの精密マイクロピペットを用いて中央角膜表面に0.5 μLのオレゴングリーンデキストラン溶液を注入します。
    3. 1分間の培養後、余分なトレーサーを除去するために、角膜を無菌生理食塩水で5回徹底的に洗い流し、表面蛍光を完全に除去します。
    4. 蛍光顕微鏡を用いて、蛍光顕微鏡で角膜を即座に撮影し、蛍光素は蛍光素のイソチオシアネート(FITC)フィルターセット(励起490 nm、放出525 nm)と標準化された露出パラメータを用いてください。
    5. ImageJソフトウェアを用いて、一貫した関心領域選択と背景減算プロトコルで蛍光強度を定量化します。
      1. 画像を8ビットグレースケールに変換し、角膜の中央直径3mmをカバーする標準化された円形関心領域(ROI)を定義します。
      2. 平均グレー値を測定し、隣接する非角膜領域から測定した背景蛍光を差し引き、結果を補正総蛍光(CTF)として表します。計算は以下の通りです:CTF = 積分密度 - (ROI面積 × 平均背景蛍光)22。

6. 組織学的処理と解析

  1. 安楽死直後に眼や周囲の構造物を除去し、4%パラホルムアルデヒドで24時間固定するか、凍結切片の場合は最適切断温度(OCT)化合物に埋め込み、矢状切片の適切な向きを確保します。
  2. 標準化された解剖学的ランドマーク(視神経を基準点として)を用いて、すべての標本で一貫した切断面を確保するために、連続的な矢状面切片(凍結時は6μm、パラフィン用5μm)を準備します。
  3. 適切な正陰対照を用いて、標準化されたプロトコルを用いて周期酸シフ(PAS)染色を用いてゴブレット細胞の定量を行います。
  4. 一次抗体(抗MMP-3(1:200)、抗MMP-9(1:100)、抗活性化カスパーゼ-3(1:300)、抗活性化カスパーゼ8(1:200)、抗CD4(1:100)を用いて免疫蛍光染色を行い、4°Cで一晩潜伏します。
  5. 系統的サンプリング法を用いて結膜長1ミリメートルあたりのゴブレットセルを定量化し、各セクションごとに5つの重なりのない高出力場で細胞をカウントし、結果を平均化します。

7. 分子分析

  1. 検証済み抽出プロトコルを用いて、結合した結膜および角膜組織から総RNAを抽出します。
  2. cDNA合成と定量的リアルタイムPCR28
    1. 総RNA1μg、オリゴdTプライマー(50μM)、ランダムヘキマープライマー(100μM)、逆転写酵素、反応バッファー、ヌクレアーゼフリー水を含む逆転写反応混合物を最終体積20μLで準備します。
    2. サーマルサイクラーで反応混合物を37°Cで15分間インキュベートし、第一鎖cDNA合成を可能にします。
    3. 逆転写酵素を85°Cで5秒加熱し、その後4°Cまで冷却し、cDNAを-20°Cで保存して使用します。
    4. その後のPCR反応でテンプレートとして使用するため、ヌクレアーゼフリー水で希釈したcDNAを1:10合成しました。
    5. 希釈したcDNAテンプレート1μL、順方向および逆プライマー(それぞれ最終濃度0.2μM)、SYBRグリーンマスターミックス、ヌクレアーゼフリー水を含むリアルタイムPCR反応混合物(最終体積20μL)を準備します。
    6. 3倍のロードサンプルを96ウェルの光学反応プレートに積み込み、各プライマーペアにはテンプレートなしコントロールも含まれます。
    7. 熱サイクラーには以下の条件でプログラムします:初期変性は95°Cで10分間、その後変性40サイクル(95°Cで15秒)、アニーリング(60°Cで30秒)、伸縮(72°Cで30秒)を行います。
    8. 増幅直後に解離曲線段階を含めると、95°Cで15秒、60°Cで1分、その後0.3°C/sで徐々に温度を95°Cまで上昇させて単一生成物の増幅を検証します。
    9. 計測ソフトを用いて増幅曲線とサイクル閾値(Ct)値を解析し、すべてのプライマーペアで90〜110%の増幅効率を確保します。
    10. 標的遺伝子発現(IL-17A、IFN-γ、IL-13、MMP-3、MMP-9)をハウスキーピング遺伝子GAPDHに2-ΔΔCt 法を用いて正規化します。
    11. すべてのターゲットおよび参照遺伝子については 表1 に指定されたプライマー配列を使用します。
  3. 適切な標準曲線と品質管理を備えた市販のELISAキットを用いて、組織抽出物中のサイトカインタンパク質レベルを定量化します。

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結果

このプロトコルの成功裏の実装により、CD8+CD103+ T細胞介在免疫調節を通じて乾燥性ストレス誘発性眼表面病理の包括的な改善が実現します。陽性の結果は、涙液生成の有意な回復を示し、非ストレス対照群と比較して通常60〜80%の回復を達成していますが、車両処理動物は持続的な涙分泌欠損を示します(図1A)。

治療が成功した場合、結膜のゴブレット細胞群はストレスを受けていない対照群に近づき、PAS染色および細胞の定量的列挙によって結膜長1ミリメートルあたりの密度が正規化されます(図1B,C)。最適な結果は、粘膜構造の包括的な保存を示し、特徴的な形態と強いPAS陽性染色を示す明確に見えるゴブレット細胞を示します。角膜バリアの完全性評価では、...

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ディスカッション

本研究は、CD8+CD103+調節T細胞が、CD4+ T細胞介有の病原性応答を包括的に調節することで、ストレス誘発性ドライアイ疾患を乾燥させる強力な治療薬であることを確立します。この発見は、CD8+CD103+ T細胞の導入移送が、涙液生成の機能的回復、粘膜構造の保存、上皮バリア機能の維持、炎症組織損傷の抑制を含む多面的な眼表面保護を達成することを明らかにしています。

本研究は、CD8+CD103+ TregがCD4+ T細胞誘発病因において抑制的な役割を果たすことを示し、眼表面に影響を及ぼすストレスに対する適応免疫応答における調節階層の理解を支持しています31。CD8+CD103+ T細胞療法が局所結膜のCD4+ T細胞浸潤およびドレーンリンパ節における全身CD4+ T細胞の増殖を効果的に減少させることの証明は、これらの調節細胞が複数の補完的な機構を通じて機能していることを示唆しています。以前の研究では、CD8+CD103+ TregをマウスのCD4+ T細胞と共に...

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開示事項

著者たちは、この原稿で記述されている作品に不適切に影響を与える可能性のある、財政的またはその他の利益相反はないと宣言しています。

謝辞

私たちは、実験期間を通じて最適な住居環境を維持した済南第二人民病院の実験室スタッフおよび動物ケア施設のスタッフによる技術支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗CD103-APC抗体バイオレジェンドクローン 2E7フローサイトメトリーと細胞選別
抗CD8磁気マイクロビーズミルテニ・バイオテック-磁気セル分離
角膜オレゴングリーンデキストランインビトロジェンD7172分子量:70,000
ELISAキットのIFN-γ;eバイオサイエンスBMS606サイトカイン定量
ELISAキット IL-13eバイオサイエンスBMS6015サイトカイン定量
ELISAキット IL-17AeバイオサイエンスBMS6001サイトカイン定量
イメージJ国立衛生研究所バージョン 1.53k
フェノール赤綿糸ゾーンクイック、横田-涙の発生測定
スコポラミン臭化水化物メロネファーマMB5860ムスカリン系抗抗薬

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