方法論記事

in vitro キメラ抗原受容体T細胞スクリーニングのための患者由来の3次元腫瘍オルガノイドモデル

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DOI：

10.3791/69113

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2025年12月30日

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

この記事について

サマリー

本プロトコルは、患者由来の腫瘍オルガノイドとキメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞を用いて、CAR-T細胞の固形腫瘍細胞に対する特異的細胞傷害活性を評価する in vitro 共培養モデルを確立します。

要約

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は血液悪性腫瘍において臨床的には期待的な効果を達成していますが、固形腫瘍に対するCAR-T細胞療法はまださらなる開発が必要です。患者由来の腫瘍オルガノイドは、患者の異質性を保持する in vitro 疾患モデルであり、化学療法や標的薬剤の有効性と安全性の検証に用いられています。この方法は、腫瘍オルガノイドとCAR-T細胞を共培養する in vitro 有効性試験モデルを記述します。患者の大腸がんサンプルは、基底膜マトリックス内の三次元(3D)構造を持つ腫瘍オルガノイドに構成されます。腫瘍オルガノイドは安定的に成長し、連続的に通過可能です。成熟した腫瘍オルガノイドは洗浄と遠心分離によってマトリックスから分離され、CAR-T細胞は異なるエフェクター対標的(E:T)比で添加されて免疫オルガノイド共培養系を形成します。6〜24時間後、明視野イメージングでオルガノイドの形態や細胞間構造が観察されます。この実験はさらに共培養系における死細胞染色を行い、オルガノイドの生存可能性を反映し、CAR-T細胞が腫瘍オルガノイドに与える細胞毒性の評価に役立てます。この実験はCAR-T細胞と3D腫瘍オルガノイド間の相互作用を効果的に観察でき、その結果を用いてCAR-T細胞の腫瘍殺菌活性を評価することができます。

概要

キメラ抗原受容体T(CAR-T)細胞療法は、血液悪性腫瘍の治療において顕著な臨床的成功を示しています。1.しかし、腫瘍の異質性や抗原喪失、腫瘍内の物理的・化学的障壁、免疫抑制性腫瘍微小環境など、いくつかの大きな障害により固形腫瘍への応用は限定的です。これらの課題が、固形腫瘍環境におけるCAR-T細胞療法の効果が限定的であることに寄与しています。

CAR-T細胞の有効性のin vitro評価は、前臨床開発において重要なステップです。最も一般的に使われているモデルは腫瘍細胞株であり、特定の腫瘍関連抗原を発現させるか、ルシフェラーゼ4,5のようなレポーター遺伝子を運ぶように改造されることがあります。そのため、従来の細胞株ベースのアッセイの結果は臨床結果を予測できないことが多いです。患者由来腫瘍モデルは、固形腫瘍の文脈でCAR-Tの機能をより正確に評価するための有望な代替手段を提供します。

いくつかの研究がPDTOをCAR-T細胞評価に利用し始めていますが、3D腫瘍構造の保存と免疫細胞-腫瘍細胞の効率的な相互作用を効果的にバランスさせる標準化され、堅牢かつアクセスしやすい共培養プロトコルの確立には依然として課題が残っています。患者由来腫瘍オルガノイド(PDTO)は、患者の腫瘍組織や細胞から生成される三次元(3D)生外疾患モデルです。PDTOは大腸がん、乳がん、膵臓がん、肺がんなど幅広い腫瘍タイプに対して成功裏に確立されています。これらの構造は、元の腫瘍6の組織学的構造、分子プロファイル、機能的異質性を保持しています。原発腫瘍細胞や患者由来異種移植(PDX)とともに、PDTOは患者特異的な疾患特徴をモデル化する貴重なプラットフォームを提供します7。従来の腫瘍細胞株や一次培養と比べて、PDTOは生体内腫瘍環境をより正確に再現し、複雑な細胞組成と構造構造を示します8。また、ゲノムの安定性を維持し、遺伝子発現パターンを長時間にわたって保持することで、治療反応のより正確な評価を可能にします 9,10。PDTOは腫瘍生物学、薬物スクリーニング、精密医療の研究で成功裏に利用されており、新規CAR標的の同定、CAR設計最適化、細胞毒性評価など免疫療法検査における有用性がますます高まっています。.オルガノイド培養の一般的な制約は、3D構造維持のためにマトリゲル(以下、基底膜マトリックス[BMM])などの細胞外マトリックス(ECM)成分に依存していることであり、これが共培養アッセイにおける免疫細胞浸潤を妨げることがあります。共培養における一貫性と最適な細胞相互作用を確保するため、通常は一定サイズ範囲(例:直径100〜200μm)内のオルガノイドが選ばれます。

本プロトコルは、大腸がん由来のPDTOを用いたCAR-T細胞毒性を評価する共培養プラットフォームを説明しています。患者の腫瘍サンプルは酵素解離され、BMMで培養されて3Dオルガノイドを生成します。成熟・増殖されたオルガノイドは単離され、蛍光標識されます。これらはマルチウェルプレートにシードされ、CAR-T細胞と異なるエフェクター対ターゲット(E:T)比で共培養されます。このアプローチの重要な特徴は、共培養前にBMMからPDTOを意図的に除去することで、CAR-T細胞が腫瘍オルガノイドに直接妨げられることなくアクセスしつつ、懸浮中の3D完全性を維持することです。24時間後、明視野顕微鏡により進行性のPDTO崩壊が明らかになり、3D形態の障害、腫瘍細胞の縮小、生存能力の喪失が特徴です。生細胞イメージングおよび蛍光顕微鏡は、蛍光標識されたCAR-T細胞と腫瘍標的との相互作用をさらに可視化します。定量的な細胞死アッセイは細胞毒性の評価に用いられます。このオルガノイドベースの免疫共培養は、CAR-T細胞 の抗腫瘍有効性を体外で評価するための堅牢かつ患者特異的なプラットフォームを提供し、治療の最適化と臨床翻訳の支援を可能にします。

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プロトコル

大腸がん患者由来のオルガノイドが使用されました。治療経験のない原発性大腸腺癌(CRC)患者から腫瘍組織断片を採取しました。すべての組織は深圳前海石口自由貿易区病院で標準診断手順中に採取した内視鏡生検標本から取得されました。すべてのドナー組織は、機関病理医による組織病理学的検査によりCRCと確認されました。このプロトコルは機関のガイドラインに従っています。すべての患者から書面によるインフォームド・コンセントを取得しました。この研究は深圳前海石口自由貿易区病院倫理委員会(2024KY-009-01K)によって承認されました。

1. PDTO文化

  1. 組織調製
    1. 組織学的に確定した原発性大腸腺癌(CRC)患者の大腸内視鏡生検で得られた腫瘍組織断片を無菌の50mLチューブに挿入します。
    2. ハンクスバランス塩溶液(HBSS)、1%牛血清アルブミン(BSA)、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、50 μg/mLゲンタミシン、5 μg/mLアンホテリシンB、および10 μMのロー関連キナーゼ阻害剤(Y-27632)からなる冷却組織洗浄液30 mLを加えます。
    3. チューブを氷の上に置き、5分間優しく揺らして組織を洗います。
    4. ステップ1.1.3を繰り返します。新しいティッシュウォッシュ液でさらに2回。
  2. 組織消化
    1. 壊死組織や脂肪組織を切除し、腫瘍を組織断片に切り分けます。
    2. 消化培地8mL(DMEM培地、コラーゲナーゼIV500 U/mL、コラーゲナーゼII1.5 mg/mL、ヒアルロニダーゼ20 μg/mL、20 μg/mL ディスパーゼII型、10 μM Y-27632、1%胎児用牛血清)を37°Cまで温めます。
    3. 断片を消化バッファーに移し、37°Cの水浴で培養します。酵素の浸透を助けるために、5分ごとに手で優しく10秒ほどチューブを回します。
      注意:組織ブロックの大きさに応じて消化緩衝液の容積を調整してください。一般的に、内視鏡生検の大きさには8〜10 mLで十分です。
    4. 15分後に顕微鏡で観察して解離の状態を確認してください。組織の断片が残っている場合は、最大30分まで消化を続けてください。
    5. クラスターが見えたら、10mLピペットを使って機械的に解離するために優しく(5〜10回)ピペットを移します。遠心分離機で350× g で5分間加熱します。
    6. 上澄液を廃棄;ペレットを10mLの洗浄液に再懸浮させ、350× g で遠心分離機で5分間処理します。洗いを2回繰り返します。
      注:PDTOは通常、培養から3〜5日以内にコンパクトな球状構造を形成し始めます。オルガノイドは強固な増殖を示し、10日目から14日目までに実験に適したサイズ(直径約100〜200μm)に達しました。排出は7〜10日ごとに行われ、健康な成長を維持し、過剰合流や中枢壊死を防ぐために行われました。一般的に、1回の生検ごとに8〜10 mLの消化バッファー(2 mm³断片)を使用し、最終作動濃度1×のTrypLE Expressを保ちます。

2. PDTOの構築

  1. 行列埋め込み
    1. 200μLのBMM(4°Cで予備冷却済み)をきれいなチューブに入れ、冷却済みピペットチップで細胞ペレットを少なくとも10〜15回上下にピペットし、懸濁液が均一になり、塊が目立たない状態になるまで続けます。
    2. 24ウェルプレートの各ウェルに約30μLの液滴を分散します。37°Cで10分間培養して固化させます。
    3. オルガノイド培養培地500 μL(Advanced DMEM/F12 medium、50 μg/mL R-スポンジン1、10 μg/mL ノギン、500 μg/mL EGF、100x HEPES、100x グルタマックス、500x ノルモシン、500x ゲンタミシン/アンフォテリシンB、50x N2、100x B27、500 mM n-アセチルシステイン、1 M ナイアシンアミド、5 mM Alk 4/5/7阻害剤、30 M p38阻害剤、100 μM ガストリンを添加します。 および1ウェルあたり100μMのプロスタグランジンE2。
      注意:1滴あたり約30μLのBMMを使用してください。細胞密度に応じて調整します。
  2. 培養維持
    1. 37°Cで5%のCO2でオルガノイドを培養;3日ごとに培地を変えてください。
    2. オルガノイド形成を毎日監視してください。3日目には小さな球状体が出ることを期待してください。
    3. 6日目から10日目の間にオルガノイドの確立が成功していると評価します。形成時間(3日から14日の範囲)は組織の生存能力と茎の強さに依存します。

3. PDTOの通過

  1. 分解
    1. 遠心分離機を4°Cまで予冷します。 培地を取り出し、氷で冷えたHBSSを1mL加え、ピペットを優しく3〜5回かけてBMMを破壊します。
      注:よく成長したオルガノイドは肉眼で小さな白い点として観察できます。
    2. 懸濁液を無菌の15mLチューブに移し、350×gで遠心分離機で5分間浸します。
  2. 酵素解離
    1. 上澄液を捨て、TrypLEを1mL追加します。37°Cの水浴に2分間浸します。
    2. TrypLEを中和するためにHBSSを2mL追加します。遠心分離機で350×g で5分間。
    3. 上清液を取り除き、HBSS2mLに再懸濁します。再び350 ×g で遠心分離機で5分間処理しました。
  3. 再埋め込み
    1. 新鮮なBMMを1:3〜1:6の比率でペレットに加えます(オルガノイドペレット:BMM、v/v);優しく再停止してください。各液滴には約30μLの最終体積が含まれています。新しい24ウェルプレートに液滴を配置します。37°Cで10分間培養します。
    2. 1ウェルあたり培地500μLを加え、37°Cで5%CO2で培養します。
    3. 井戸を毎日検査し、約48時間以内に3D再組立てを観察します。
    4. 3〜5回の経過後、健康なオルガノイドを選んで下流のアッセイや冷凍保存を行います。

4. CAR-T細胞とPDTOの共培養

  1. 共培養培地の調製
    1. CAR-T生存能力をサポートするために、10 ng/L IL-2および0.05 mM βメルカプトエタノールを基底オルガノイド培養培地に補足します。
      注意:ベースメディアはPDTOの3D構造と実用性をサポートします。
  2. PDTOの準備
    1. 成熟PDTOを含むBMM液滴(例:4〜6日目)は、無菌細胞スクレーパーまたはピペットチップを用いて培養プレートから除去します。
    2. BMM/PDTOの混合物を15mLの円錐形チューブに移します。
    3. チューブに5〜10mLの氷で冷えたHBBSまたはティッシュウォッシュ液(ステップ1.1.2で説明されている通り)を加えます。BMMからオルガノイドを5〜10回優しく反転させて外します。
    4. 混合物を氷の上に5分間置きます。BMMは液体化し、解離したPDTOは懸浮状態のままです。
    5. BMMを含む上清液を慎重に吸引し、PDTOペレットはそのままにします。ペレットを乱さないようにしてください。
    6. BMMを完全に除去するために、ステップ4.2.3から4.2.5までさらに2回繰り返します。
    7. 最終洗浄後、PDTO含有上清液と遠心分離機を300× g で4°Cで5分間採取します。
    8. 上清液を吸引し、PDTOペレットをオルガノイド培養培地または共培養培地1〜2 mLに再懸濁させます。
    9. (カウントは任意)単一セルサスペンションを準備しろ。
      1. 正確なカウントが必要な場合は、再懸濁オルガノイドを新しいチューブに移し、予備加熱したTrypLEエクスプレスを37°Cで3〜5分間インキュベーションし、その後優しくピペッティングして単細胞懸濁液にします。細胞計数(例:ヘモサイトメーターや自動細胞計)を進めてください。
        注意:この工程はオルガノイドを解離し、再メッティング前のカウント目的のみです。
    10. サイズ選択と標準化:共培養のためのオルガノイドサイズを一貫させるために、再懸濁されたPDTO(ステップ4.2.8以降)を50mL円錐管の上に置いた70μmの細胞ストレーナーを通して通します。この工程では、大きなオルガノイド集合体やゴミを除去し、均一な共培養に適した標準化されたサイズの割合を示します。
    11. 標準化されたオルガノイド懸液を300× g で4°Cで5分間遠心分離します。
    12. 上清液を吸引し、標準化されたPDTOを適切な量の予温共培養培地に再懸濁します。
    13. 標準化されたPDTOの数を数える(例:顕微鏡下のヘモサイトメーターで、フィールドあたりのオルガノイド数を数える)。
      注:カウントは細胞数ではなくオルガノイド数に基づいています。
    14. 標準化されたPDTOを目標数のウェル数で望むマルチウェルプレート(例:96ウェルU型底板)にシードします。
    15. CAR-Tセルを所望のエフェクター対ターゲット(E:T)比でウェルに追加します。
  3. PDTOのラベリング
    1. 遠心分離機を4°Cまで予冷します。 媒介音を吸う;滴を取り除くためにHBSSを1mL追加してください。
    2. 15mLの遠心分離機チューブに移し、HBSSを4mL追加し、優しくピペットします。遠心分離機で350 g で5分間加熱×
    3. 上澄液を捨て、HBSSを5mL加えて優しくピペットします。再び350 × g で遠心分離機で5分間加熱しました。
    4. Hoechst 33342の作業用溶液を準備してください。
    5. 1 mLのHoechst 33342溶液(最終濃度5 μg/mL)に再懸浮ペレットを設置します。染料の浸透が均一になるように、逆さまに3〜5回優しく混ざり合います。光から守るために、チューブをアルミホイルで包んでください。37°Cで10分間培養します。染色後は、余分な染料を落とすためにHBSSで2回洗います。
  4. PDTOのメッキ
    1. ゲル液滴対ウェル比率1:5でオルガノイド密度を推定します。共培養培地で約1 ×10 3 3 オルガノイド/mLで再懸浮します。
    2. 96ウェルプレートに1ウェルあたり100μLを加え、各条件に少なくとも三重を含めること。
      注意:この段階では細胞数を数えないでください。オルガノイドはそのまま残っています。
  5. CAR-Tの共文化
    注:本プロトコルはPDTOを用いたCAR-T細胞の共培養および有効性評価に焦点を当てています。本研究で使用されたCAR-T細胞の生成および特性評価は第8節で説明されています。
    1. CAR-T細胞をログ相で採取します。トリパンブルーで染色して有効性を確認し>95%。
    2. 遠心分離機セルを350 × g で5分間加熱;共培養培地での再懸濁。
    3. 濃度を4×106/mL、2×106/mL、1 ×10 6/mLに調整してください。
    4. 実験設計に従い、井戸あたり100μLのCAR-Tサスペンションを追加します。ウェル制御のために共培養培地100μLを加えます。
    5. プレートを37°C、CO25 %で6〜24時間培養します。

5. 死細胞染色

  1. SYTOXグリーン染色
    1. 1×10個5 細胞ごとに、100μLのSYTOX Green(1000x)を1mLのアッセイバッファーに希釈して、100μLのNuclear Green染色液を準備します。
    2. 共培養6時間および24時間のタイミングでは、1ウェルあたり100μLのSYTOXグリーン染色液を追加します。暗闇で37°Cで20分間孵化します。

6. 画像取得

  1. 上清液を吸引し、DMEM/F12を100μL追加します。
  2. 顕微鏡(例:共焦点)を用いて明視野および蛍光画像を撮影する:
    Hoechst 33342(PDTOs):励起(Ex)/放出(Em)= 350 nm/461 nm
    mCherry(CAR-T):Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOXグリーン(死細胞):Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. 1井戸あたり少なくとも3枚の画像を撮影し、中央フィールドに焦点を当てます。

7. データ分析

  1. Launch ImageJ(バージョン1.54、NIH、https://imagej.nih.gov/ij/);SYTOXグリーンチャンネル画像をインポートしてください。閾値を手動で設定して蛍光信号と背景を区別します(画像> >しきい値を調整)。
  2. 「 分析>測定 」機能を使って積分密度を計算します。適切な統計解析ソフトウェア(例:GraphPad Prism)で.csvデータをエクスポートし、その後の統計解析を行います。
  3. 閾値を設定して蛍光信号と背景信号を分離します。
  4. フィールド全体を選択してください。 Analyze > Measure を実行して蛍光信号強度の合計を計算します。
  5. データをエクスポートし、24時間で治療済みと対照群を比較するための統計解析を行います。

8. CAR-T細胞の生成と特性評価

  1. CAR構造設計
    注:本研究で使用されたCAR-T細胞は、大腸がんで頻繁に過剰発現する抗原であるB7-H3(CD276遺伝子によってコード)を標的としています14。CAR構成要素は以下から構成されます:
    細胞外ドメイン:B7-H3クローン376.96に対するモノクローナル抗体から得られる単鎖可変断片(scFv)。
    ヒンジおよび膜貫通ドメイン:CD8αヒンジおよび膜貫通ドメイン。
    共刺激領域:ヒトCD28。
    シグナル伝達ドメイン:ヒトCD3ζ。
  2. CAR-T細胞生成
    1. 分離:Ficoll-Paque密度勾配遠心分離を用いて、健康なドナーバフィー被毛から末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
    2. 活性化:プレート結合抗CD3/CD28抗体を用いて、T細胞培地で48時間活性化し、IL-7 10 ng/mLおよびIL-15 5 ng/mLを補足します。T細胞培地は、RPMI 1640とClick's Mediaを等量(それぞれ250 mL)混合し、胎児用牛血清(FBS)、GlutaMAXを1回、ペニシリン・ストレプトマイシン(Pen/Strep)1%を補足して調製します。
    3. トランスダクション:前述のレトロネクチン被覆プレートを用いて、レトロウイルス上清液で活性化したT細胞を誘導します。
    4. 拡張:トランスダクション後3日目に、IL-7およびIL-15を含む完全なヒトT細胞培地でT細胞を収穫・培養し、その後さらに7〜9日間、特性解析および機能分析を行います。
  3. CAR-T細胞の特徴付け
    1. CAR発現:再組換えB7-H3-Fcタンパク質を用いたフローサイトメトリーでCAR発現を評価し、その後ヒトFc14に対して蛍光標識された二次抗体を投与します。典型的なトランスダクション効率(CAR+セル)は80%から90%の範囲です。
    2. 表現型:CD3、CD4、CD8、CD4、CD8、CD45RA、CCR7などに対する抗体を用いたフローサイトメトリーでT細胞のサブセット(例:CD4+、CD8+など)を特徴付ける14。
    3. 機能検証(任意の事前共培養):共培養実験の前に、B7-H3陽性およびB7-H3陰性標的細胞株と共培養し、サイトカイン放出(例:ELISAによるIFN-γ)や細胞毒性(例:フローサイトメトリー15を用いる)を測定することで、CAR-T細胞を機能的に検証します。
  4. 共培養準備(PDTOアッセイ)
    1. CAR-T細胞はログフェーズ増殖期間中(通常は活性化後10〜14日目の間に)共培養に使用します。使用前に、細胞をHBSSで2回洗浄し、IL-7/IL-15を除去し、ステップ4.1で説明した共培養培地に再懸濁させます。
    2. トリパンブルー染色で生存率が>95%であることを確認しましょう。
    3. 視覚チェックポイント:3日目から5日目に小さな球状クラスター(50-100μm)、10日目から14日目に成熟球体(100-200μm)を確認します。

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結果

大腸がんオルガノイドは内視鏡生検サンプルから成功裏に得られ(図1)、病理診断によって腫瘍の同定が確認されました(図2)。BMMで培養された腫瘍断片は24時間以内に3D構造を形成し始めました。第一世代オルガノイド(P0)は7日目から14日目の間に通過しました。オルガノイドは球状、嚢状、円形など多様な形態を示しました(図2A)。

蛍光イメージングシステムを用いてPDTOとCAR-T細胞間の相互作用を24時間の共培養期間にわたってモニタリングしました。腫瘍オルガノイドはHoechst 33342で標識され、CAR-T細胞はmCherryを発現しました。蛍光顕微鏡検査により、CAR-T細胞は6時間後にウェルの底部に均等に分布していることが示されました。24時間までに、CAR-T細胞は腫瘍オルガノイドの周囲に集まり始めました(

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ディスカッション

本記事では、明視野イメージングと蛍光染色を組み合わせて、CAR-T細胞がPDTOsに与える細胞毒性の評価方法を提示し、オルガノイドの生存可能性を評価します。この二重モダリティアプローチにより、3Dモデルシステム上で腫瘍細胞死の堅牢な可視化が可能となり、CAR-T細胞毒性の半定量的評価を提供します。

このプロトコルの重要な要素は培地です。CAR-T細胞と腫瘍オルガノイドは異なる栄養要求を持つため、CAR-T細胞とオルガノイド培養培地の適合性が最初に評価されました。CAR-T細胞は、標準T細胞培地よりもオルガノイド培養培地で生存率と増殖能力をより効果的に維持しました(補足図1)。対照的に、オルガノイドはT細胞培地内で急速に生存能力と構造的完全性を失いました。したがって、オルガノイド培地を共培養基として選び、IL-2とβ-メルカプトエタノールを補足してT細胞活性化を促進しました。これらの付加は一般的にT細胞の増殖と機能向上に用いられます。

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開示事項

著者たちは利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発計画(2022YFC2304400、2022YFC2304401)、南山医療保健システムの科学技術プロジェクト(NSZD2024046、NS2024105)、深圳医療研究基金(D2401023)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15mLチューブセイニング3030100
24ウェルプレートコーニング3524
50mLチューブセイニング3030000
96ウェルプレートコーニング3599
高度なDMEM/F12ギブコC11330500BT
アルク4/5/7阻害剤MCEHY-10432 
B27ギブコ17504044
バイオセーフティキャビネット(クラスII)サーモ・フィッシャー該当なし
牛血清アルブミンシグマ・オルドリッチA9056
細胞培養皿バイオファイルTCD010060
遠心分離機エッペンドルフ5810R
クリックズ・ミディアム富士映画9195
CO2インキュベーター山田IP610
コラーゲンIIソーラービオC8150
コラーゲナーゼIVシグマ・オルドリッチC9407
共焦点レーザー顕微鏡ツァイスLSM900
低温保存液ゼノアクCELLBANKERTM2
消化バッファー社内で調製された試薬該当なし原稿に記載された構成
デジタルシェーカーミウラブHS-25
拡散タイプIIシグマ・オルドリッチD4693
DMEMギブコC11995500BT
ダイナビーズ ヒトTアクチベーター CD3/CD28サーモ・フィッシャー11131D
EGFペプロテックAF-100-15-500UG
胎児用牛血清ギブコ1631389
ガストリンGLPBIOGA20228
ゲンタミシン/アンホテリチンBギブコR0151
グルタマックスギブコ35050061
ハンクスのバランスソルト溶液ギブコC14175500BT
ヘペスギブコ15630080
ホエスト 33342 ビヨタイムC1027
ヒアルロニダーゼソーラービオH8030
IL-15ペプロテック200-15-10UG
IL-2ノボプロテインCK24-10
IL-7ペプロテック200-07-10UG
イメージJNIH(オープンソース)https://imagej.nih.gov/ij/
逆 蛍光顕微鏡MshotMF52-N
マトリゲルコーニング356231
N2ギブコ17502048
n-アセチルシステインシグマ・オルドリッチA7250-5G
ナイアシンアミドシグマ・オルドリッチN0636-100G
ノギンペプロテック120-10C-20
ノルモシンインビボジェンアント-NR-1
オルガノイド培養培地社内で調製された試薬該当なし原稿に記載された構成
P38阻害剤MCEHY-10295 
ペニシリン・ストレプトミーギブコ15140122
プロスタグランジンE2MCEHY-101952 
ロー関連キナーゼ阻害剤 幹細胞72304
RPMI 1640ハイクローンSH30809.01B
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参考文献

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