レンチウイルスベクターを用いた10 kbを超えるトランス遺伝子を持つキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の効率的な産生

Philipp  C. Rommel; Nils W. Engel; Bruce L. Levine; Carl H. June

doi:10.3791/69121

方法論記事

レンチウイルスベクターを用いた10 kbを超えるトランス遺伝子を持つキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の効率的な産生

DOI：

10.3791/69121

⸱

2026年1月23日

Philipp C. Rommel¹^,² , Nils W. Engel¹ , Bruce L. Levine¹^,² , Carl H. June¹^,²^,³

¹Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, ³Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

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ここでは、レンチウイルスベクターを用いて10 kbを超える大型トランスジェーンを持つキメラ抗原受容体(CAR)T細胞を生成するための最適化されたワークフローを提示します。

要約

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複数の受容体をキメラ抗原受容体(CAR)T細胞に工学的に組み込むことは、抗原陰性の再発を防ぎ、オンターゲット/オフ腫瘍の毒性を減らす強力な戦略として浮上しています。しかし、レンチウイルスのトランスジーンサイズが増加するとウイルスのタイターやT細胞のトランスダクション率が大幅に低下するため、多受容体CAR T細胞の製造は依然として困難です。現在の生産ワークフローでは、低収量生産から導入されたT細胞を濃縮するために細胞選別に依存することが多いです。しかし、セル選別技術はCAR Tセルの絶対数を増やすことはなく、すでに複雑な製造プロセスにさらなる複雑さを加えます。その結果、これらの制限は多受容体CAR T細胞の臨床翻訳を妨げ、次世代免疫療法の開発を妨げています。

ここでは、大型レンチウイルストランスジーンを持つCAR T細胞を生成するために最適化された詳細な段階的な生産ワークフローを提示します。このワークフローを用いて、トランスジェーンサイズの範囲でサイズ依存的なトランスダクション効率の増加を示し、特に10.1 kbレンチウイルスベクターで最大14.8倍の強化が顕著に観察されました。重要なのは、ワークフローが堅牢なT細胞拡張をサポートし、細胞のソートを不要にしていることです。レンチウイルス遺伝子移転における現在のサイズ制限を克服することで、このワークフローは多受容体CAR T細胞の効率的な生成を可能にし、先進的な免疫療法の開発を促進します。

概要

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キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は免疫療法の分野に革命をもたらしました。しかし、驚異的な成功にもかかわらず、腫瘍微小環境(TME)による免疫抑制、抗原陰性腫瘍の再発、オンターゲット/オフ腫瘍毒性など、重大な課題は依然として存在します^1,2。デュアルCAR、CARとTCRの結合構造体、またはサイトカインスイッチ受容体など、複数の合成受容体を用いたCAR T細胞の設計は、これらの障害を克服^{する可能性があります。}血液がんでは、エフェクターT細胞にデュアルCARを装備することで、CD19やCD20⁵など2つの異なる抗原を同時に標的化できるため、腫瘍抗原の逃走リスクを低減します。固形腫瘍では、合成Notch(シンノッチ)受容体回路を導入することで、オンターゲット/オフ腫瘍の毒性を軽減できます。これにより論理ゲートCAR発現が可能になり、標的精度が向上します。6,7,8,9,10,11,12,13 .しかし、複数の受容体を持つCAR T細胞の産生は、トランス遺伝子サイズの増加が原因で依然として困難です。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型由来の自己不活化第3世代レンチウイルスベクターは、研究および臨床規模におけるCAR T細胞生産の現在のゴールドスタンダードです¹⁴。CAR T細胞を生成するために、レンチウイルスベクターはカスタマイズされたCAR発現カセットと、長い末端リピート(LTR)配列で設計され、T細胞ゲノムへの統合を媒介します。現在のレンチウイルスベクターの最大有効包装容量(EPC)は約9.2キロベース(kb)LTR-to-LTR(LTR)であり、これはHIV-1のネイティブゲノムサイズに相当します。レンチウイルス価はベ^{クター長の増加}に伴い半対数的に減少するため、複数受容体を持つ大型トランスジーンの工学はレンチウイルス産生率を劇的に低下させ、最終的にはCAR T細胞の製造を妨げます^。磁気活性化または蛍光活性化細胞選別(MACSまたはFACS)などの細胞選別技術は、低収量生産からCAR T細胞を濃縮するために用いられますが、これらの方法はCAR T細胞の絶対数を増やすことはなく、すでに複雑な製造工程にさらなる複雑さを加えます。その結果、大型レンチウイルストランスジーンを持つCAR T細胞の製造上の課題は、前臨床研究と臨床応用の両面で依然として大きな障壁となっています。

最近、単一ベクターsynNotch(svsNotch)システム¹⁷のような大型レンチウイルストランスジーンを持つエフェクターT細胞に最適化されたCAR T細胞生成ワークフローを確立しました。ここでは、その広範な普及を促進するためのステップバイステップのプロトコルで方法論を詳述します。概念実証として、5.7 kbから9.2 kbおよび10.1 kbの範囲のレンチウイルストランスジーンサイズで、サイズ依存的なトランスダクション効率の向上を示しました。全体として、この最適化されたワークフローによりトランスデューション速度は最大14.8倍に向上し、細胞選別の必要性をなくし、10 kbを超えるトランスゲインサイズのエフェクターT細胞の効率的な生成が可能となりました。

プロトコル

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ヒトT細胞はペンシルベニア大学ヒト免疫学コアを通じて調達されており、同センターは良好な検査室実践の原則に基づき、MIATAおよびペンシルベニア大学の倫理ガイドラインに準拠した標準作業手順および/またはサンプルの受領、処理、凍結、分析プロトコルを確立しています。

注:レンチウイルスおよびCAR T細胞生成の最適化ワークフローの概要は図1に示されています。主要な最適化ステップと現在の標準ワークフローの比較は表1にまとめられています。すべての細胞培養は、37°Cで加湿インキュベーター内、5%_CO2 を用いたT細胞培地(TCM)を用いて維持されました。TCMはRPMI-1640に10%熱不活化胎児用牛血清(FBS)、10 mM HEPESバッファー、2 mM L-アラニル-L-グルタミン(材料表参照)、100 U/mLペニシリン、100 U/mLストレプトマイシンを補完したものでした。

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図1:大型トランスジーンを用いたレンチウイルスおよびCAR T細胞産生の最適化ワークフロー。レンチウイルス産生(上)とCAR T細胞生成(下)の概略図で、ウイルス価とトランスダクション効率を高める重要なステップと最適化を示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

		標準ワークフロー	最適化されたワークフロー
ウイルス	ウイルスエンベロープ	VSV-G	コカルG型
	トランスフェクション	L2000	L3000¹
	LV収穫	24 h² + 48 h²	30-36^{時間 3}
T細胞	船	T25フラスコ	96ウェル平底板
	表面積/体積比	可変	5.12 cm²/mL⁴
	アジュバント	全くありません	SF108⁵
1 μg DNAに対して¹3 μL L3000、培地変化なし
106,800 x gで²回遠心分離し、2.5時間、丸底管
12,300 x gで3回^遠心分離、一晩、円錐形の底管
⁴トランスダクション後の追加の培地補充
⁵55 μg/mL

表1:標準ワークフローと最適化ワークフローの比較。 強化されたワークフローの主要な最適化は、現在の標準ワークフローと比較して行われます。この表はロンメルらの許可を得て改変しています。¹⁷。

1. レンチウイルスの産生

HEK293T細胞の維持
1. HEK293T細胞が均等に分布し、塊がなく、50〜70%の合流率(典型的な収率:T150フラスコあたり1.0〜1.5個×10個⁷ 個)であることを確認しましょう。
2. 上清液を吸引し、細胞が動かないようにフラスコの上部に室温(RT)PBS20mlを加え、細胞の上を優しく渦巻きながら洗い液を吸引します。
3. 0.05%トリプシン-EDTAを3mL加え、フラスコを左右に傾けながらRTで15〜30秒間培養します。細胞分離を監視しろ。
4. 7mLの冷TCMを加え、フラスコの底に細胞を再懸浮させて単細胞懸濁液を作り、50mLのチューブに移します。フラスコを10〜20mLの冷たい中液で洗い、同じチューブに洗濯液を加えます。
5. 細胞を遠心分離(300 × g、5分、4 °C)、上清液を吸引し、10 mLのTCMに再懸濁し、細胞数を数えます。
6. T150フラスコHEK293T細胞を3個、1個フラスコに10個×⁶ 個の細胞を2日ごと(例:月曜・水曜)に配皮し、または1×10個^6細胞を 1フラスコごとに配皮し、3日ごとに配皮(例:金曜にプレートし週末に配線)で37°Cに温めた30mLのTCMを用います。
レンチウイルス産生のためのHEK293T細胞のトランスフェクション
注意:2日後に一貫して70〜80%の合流率が得られる種まき密度を調べるための小規模なパイロット実験を行いましょう。トランスフェクション時HEK293T細胞のコンフルエンシーが80%を超えないようにしてください(議論参照)。トランスフェクションは、還元血清最小限必須培地および市販のリポフェクション試薬(L3000およびP3000、 材料表参照)を用いて最適化されました。
1. 上記のトリプHEK293T化で細胞を採取し、37°Cに予温された30mLのTCMをT150フラスコあたり4個×10個^6個の細胞をプレートします。
2. 2日後に、培養物が均等に分布し、70〜80%が合流していることを確認しましょう。
3. 50mLの還元血清最小限生培地を加熱し、レンチウイルスプラスミドを解凍し、優しく混ぜて素早くスピンします。パルスボルテックスリポフェクション試薬を使い、素早く回転させてRTに置いておく。
4. DNAマスターミックスを準備する。各フラスコごとに、以下の順に組み合わせます:還元血清最小必須培地2 mL、レンチウイルス包装プラスミド39 μg(pTRP Gag-Pol 18 μg、pTRP RSV-Rev 18 μg、pTRP Cocal-G 3 μg)、トランスファープラスミド15 μg、P3000試薬108 μL(P3000/μg DNA2 μL )。必要に応じて拡大し、ピペッティング損失を考慮して最終量を少なくとも10%増やしてください。パルスボルテックス、クイックスピン、RTに保管。
5. L3000マスターミックスを準備します。各フラスコごとに、以下の順に組み合わせます:1.84 mLの還元血清最小必須培地と162 μLのL3000(3 μL L3000/μg DNA)。必要に応じて拡大し、ピペッティング損失を考慮して最終量を少なくとも10%増やしてください。パルスボルテックスを起こし、クイックスピンしてRTで5分間孵化します。
6. 5分後に、フラスコごとにL3000マスターミックス2mLを対応するDNAマスターミックスに加え、おおよそ1:2の希釈を得ます。チューブの側面に触れずに、チューブの底からゆっくりとL3000ミックスを加えます。ピペッティングで十分に混ぜ、RTで15分間培養します。
7. その間に、各培養液から6mLの上清液を慎重に取り出し、各フラスコにラベルを付けHEK293T。
8. 15分後、フラスコを上側に傾けて各培養液をトランスフェクトし、細胞の動揺を防ぐためにフラスコの上部の上清に4mLのトランスフェクションミックスをゆっくりと放出します。ゆっくりピペットで上下に2回回し、フラスコを元の位置に戻し、優しく回してからインキュベーターに戻し、時間を記録します。
  注意:レンチウイルスの収穫まで培養はそのままにしてください。製造元の推奨では、L3000トランスフェクションミックスを含むHEK293T上清液をトランスフェクション¹⁸後に新鮮な培養培地に置き換えることが推奨されていたのに対し、このステップを省略することでより高いレンチウイルス価¹⁷が保存されます。
レンチウイルス上清液の採取、濃縮、凍結
注意:レンチウイルス上清液は分解を防ぐため、すべての処理工程で氷または4°Cの温度で保管してください。
注意:レンチウイルス媒介者は感染性物質に分類されます。適切なバイオセーフティ対策を遵守し、個人用保護具(例:二重手袋、使い捨て白衣)の使用が含まれます。すべての作業面は10%の漂白剤で除染し、その後70%のエタノールで消毒します。機関のバイオセーフティガイドラインに従い、バイオハザード廃棄物として処分する前に、汚染された消耗品および液体廃棄物を10%漂白剤で消毒してください。
1. 超遠心分離機の機器(バケツ、円錐形チューブ、円錐アダプター)を10%の漂白剤で洗浄し、その後水ですすいでください。短時間の自然乾燥後、70%エタノールをスプレーし、組織培養フードの下で自然乾燥させます。
2. 挿入ローターを含んだ超遠心機を4°Cまで予冷却します。
3. レンチウイルス上清液は、トランスフェクション後30〜36時間後に50mLチューブに移して採取します。上清液は遠心分離(500 × g、5分、4 °C)で清算し、0.45 μmの孔隙フィルターでろ過し、氷で保存します。
4. バケツに円錐アダプターを挿入し、ろ過した上清液を円錐形の超遠心分離機管に移し、バケツに詰めます。冷たいTCMで対向するバケツのバランスを取り、重量差を0.1g未満に保ちます。
5. 上清液を12,300 × g 、4°Cで一晩超遠心分離で濃縮します。
6. 翌朝、バケツを慎重に取り出して氷の上に保管してください。
7. 冷凍用のドライアイスとラベル付きのクライオビアルを用意し、アルリクオット(冷凍保存)を用意してください。
8. 組織培養フードの下で、各バケツを開けて、鉗子で中の超遠心分離機チューブを取り出します。各チューブごとに、次のように進めます。
9. 上澄液をチューブ底部から0.5インチまで慎重に吸引し、残りの液体を6ウェルプレートにデカントします。チューブを軽く叩いて残留液を少し取り除きます。
10. 冷TCMを300μL加え、30秒ほど優しく再懸濁させ、懸濁液をクライオビアルに移します。
11. チューブを200μLの冷たいTCMで洗い、同じクライオビアに入れます。
12. レンチウイルス滴答弁用に60μLを優しく混ぜてアリコートし(ステップ1.4参照)、CAR T細胞生成用に100μLのアリコート数個、残りの体を余った量として追加1本のチューブを用意します。すぐにアリコートをドライアイスでスナップ冷凍します。長期保存のためにアリコートを-80°Cに移してください。
一次T細胞を用いた濃縮レンチウイルスの滴定
注:約1×10⁵ T細胞はレンチウイルス1回あたりの希釈量で必要です。例えば、6種類のレンチウイルスで8回の希釈剤が必要×それぞれ68×11×10が必要です⁵ = 4.8 × 10⁶ T細胞。ピペッティング損失を考慮した追加の細胞も準備しておくべきです。T細胞は抗CD3抗体および抗CD28抗体でコーティングされた磁気活性化ビーズを用いて刺激されます(材料表参照)。
1. T細胞活性化(0日目)
  1. 前提条件:精製されたヒトCD4⁺ およびCD8⁺ T細胞をTCMで準備状態に保つこと。
  2. CD4⁺ とCD8⁺ T細胞を数え、1:1の比率で組み合わせます。
  3. 活性化ビーズを洗浄する手順は以下の通りです:チューブに1mLのTCMを加え、ボルテックスでビーズを再懸浮させ、必要な量を移してビーズとT細胞の比率を3対1にします。チューブを磁気スタンドに入れ、ビーズがチューブの壁に沿ってペレット状に形成されるようにします。30秒後に上清液を慎重に吸引し、磁気スタンドからチューブを取り出し、ビーズを1mLのTCMに再懸浮させます。洗濯をさらに2回繰り返します。
  4. 活性化ビーズをT細胞に加え、TCMを37°Cに預温した状態で最終濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。
  5. よく混ぜて、サスペンションを試薬リザーバーに移します。マルチチャネルピペットを用いた96ウェル平底プレートのプレートセルを、1ウェルあたり100μLのTCMを充填します。ビーズが沈着しないように1〜2分ごとによく混ぜてください。
2. T細胞転生(1日目)
  注:大きなトランスジーンを持つレンチウイルス(例:9 kb LTR-to-LTR)については、1:2の連続希釈(希釈なし、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32)を用いて6つの条件を準備します。トランスジーンが小さいレンチウイルス(例:7 kb LTR-to-LTR)では、1:4の連続希釈を持つ8つの条件が必要です。残ったウェルを未トランスデューション(UTD)対照群として使用してください。
  1. 各濃縮レンチウイルスをそれぞれ60μLずつRTで解凍し、氷で保存します。
  2. 96ウェルの丸底プレートで希釈系列を準備します:上段に60μLのレンチウイルスを加え、下の各段に30μLのコールドTCMを加え、上段から2段目に30μL移し混ぜ(1:2希釈)、2段目から30μLを移して混ぜます(1:4希釈)。合計6つの条件(希釈なし、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32)が準備されるまで続けます。すぐにトランスダクションに使用してください。
  3. ビーズ刺激後23〜26時間の間に、マルチチャネルピペットを用いて希釈プレートから1ウェルあたり25μLのレンチウイルスをT細胞に伝達します。UTDコントロールウェルに25μLのTCMを加えます。
3. T細胞栄養(3日目)
  1. マルチチャネルピペットを使って、各ウェルに37°Cまで予温されたTCM125μLを優しく加えます。
4. T細胞脱出とフローサイトメトリー解析(5日目)
  1. 各状態ごとに1.5 mLのスクリューキャップチューブを3セット準備し、蓋を外します。3セットのうち2セットをマグネットスタンドに入れます。
  2. 各井戸を再懸垂し、セルを最初のチューブセットに移してビーズがチューブ壁に沿ってペレット状に形成できるようにします。30秒後、上清液を慎重に2セット目のチューブに移します。30秒待って(ビーズは見えなくなるはずです)、その後上清液を3セット目のチューブに移し、氷で保存します。
  3. 適切なトランスダクションマーカー(例:抗CD19 CARまたは抗HER2シンノッチ)を染色し、抗体(材料表参照)を用いて、フローサイトメトリーによるマーカー発現を解析します。
  4. ウイルス体積とトランスダクション率の直線的な範囲にほぼ対応する、30%未満の疾患を特定します。
  5. レンチウイルス価を以下の式で計算します:
    抗体価(TU/mL)=(初期T細胞数×細胞数×希釈率)/ウイルス体積(mL)
    例えば、レンチウイルスストックの希釈率が1:32で20%のCAR発現の場合:
    (100,000細胞 × 0.2 × 32) / (0.025 mL) = 2.56 × 10⁷ TU/mL

2. CAR Tセルの製造

注:CAR T細胞の生産開始量は、1グループあたり1〜5×10個^の6T 細胞です。UTD対照群の細胞数を50%増やしてください。このグループは後続実験でトランスダクションレベルの正規化にも使用されます。拡大期間中に人口が5〜6倍増すると予想されます。T細胞のトランスダクションは、ブロック共重合体を増強剤として用いて最適化され(材料表参照)、96ウェル平底プレート¹⁷における表面対体積比の特定培養が行われました。

100 mg/mLの強化剤ストック溶液の調製
1. 共重合体強化剤5gをプラスチックボトルに加え、次に45mLの超純水を加えます。RTで一晩かき混ぜます。
2. 溶液を目盛りシリンダーに移し、超純水で50mLに体積を調整します。
3. 溶液を0.22μmの孔隙ろ過フィルターでろ過し、4°Cで保存します。
T細胞活性化(0日目)
1. 前提条件:精製されたヒトCD4⁺ およびCD8⁺ T細胞をTCMで準備状態に保つこと。
2. CD4⁺ とCD8⁺ T細胞を数え、1:1の比率で組み合わせます。
3. ウォッシュ活性化ビーズは以下の通りに作ります。
  1. 1mLのTCMをチューブに加え、ビーズをボルテックスで再懸浮させ、ビーズとT細胞の比率を3対1にするために必要な量を移します。チューブを磁気スタンドに入れ、ビーズがチューブの壁に沿ってペレット状に形成されるようにします。
  2. 30秒後に上清液を慎重に吸引し、磁気スタンドからチューブを取り出し、ビーズを1mLのTCMに再懸浮させます。洗濯をさらに2回繰り返します。
4. 活性化ビーズをT細胞に加え、TCMを37°Cに預熱した状態で最終濃度を1×10⁶ cells/mLに調整します。
5. よく混ぜて、サスペンションを試薬リザーバーに移します。マルチチャネルピペットを用いて、96ウェルの平底プレートで50μLのTCMを1ウェルに供給します。ビーズが沈着しないように1〜2分ごとによく混ぜてください。
T細胞転生(1日目)
注意:レンチウイルス量は前回の減量結果に基づいて選択し、最終的なトランスダクションレベルがグループ間で比較可能であること(通常20%から30%の範囲)を確保してください。複数のレンチウイルス統合を避けるために、最大トランスダクションレベルを30%≤保持してください。大型トランスジーンを持つレンチウイルスは、一般的に希釈されていないウイルスか1:4〜1:8の希釈が必要です。レンチウイルスの残留物を避けるためにグループサイズを調整してください。凍結・融解サイクルごとにレンチウイルスの滴価が減少するためです。準備後すぐにレンチウイルスのマスターミックスを使いましょう。
1. 必要な濃縮レンチウイルスをRTで解凍し、氷で保存します。
2. 例えば、100 μLの強化剤(100 mg/mLのストック)と4.9 mLのTCMを混合して、2 mg/mLの強化剤作動用ストックを冷たく調製します。
3. 滴定結果に基づいてレンチウイルスマスターミックスを準備し、エンハンサーを最終濃度275 μg/mLに加えます。ピペッティングの損失を考慮して、最終体積を少なくとも10%増やしてください。例えば、100井戸で1:16の希釈を達成する場合:
  総体積:100ウェル×12.5 μLのレンチウイルス×110% = 1,375 μL
  1:16希釈:1,375 μL / 16 = 85.9 μL レンチウイルス
  エンハンサー:189 μL(最終275 μg/mL)
  最終マスターミックス:TCM 1,100 μL + レンチウイルス 85.9 μL + エンハンサー 189 μL = 1,375 μL
4. ビーズ刺激後23〜26時間以内に、多チャネルピペットを用いてレンチウイルスマスターミックスのウェルごとに12.5μLのT細胞を伝達し、最終的な増強剤濃度を55 μg/mLにします。UTDコントロールウェルに12.5μLのTCMを加えます。
T細胞栄養(3日目)
1. マルチチャネルピペットを使って、各ウェルに37°Cまで予温されたTCM125μLを優しく加えます。
T細胞の脱出(5日目)
注意:各培養ごとに無菌貯蔵槽と50 mLチューブ3セットを準備してください。細胞が8 ×^{10 5} cells/mL未満に希釈されないように、総洗浄体積はT細胞培養体積の≤20%に制限してください。
1. 各培養液をマルチチャネルピペットで無菌貯蔵槽に集め、元のプレートをTCMで洗浄し、洗浄液を貯蔵タンクに加えます。各細胞懸濁液を最初の50mLチューブセットに移します。
2. チューブを磁気スタンドに入れて、ビーズがチューブの壁に沿ってペレット状に形成できるようにします。30秒後、上清液を慎重に2セット目のチューブに移し、磁気スタンドに入れます。30秒待って(ビーズは見えなくなるはずです)、その後上清液を3セット目のチューブに移し、インキュベーターに保存します。
3. 各培養液を数え、TCMを37°Cに預熱して8×10⁵ Cell/mLに正規化します。最終体積に応じて適切な培養容器にプレートを施します(表2参照)。
4. T細胞を1日間休ませてから、7日目から毎日の授乳を始めます(次のステップ参照)。
T細胞への摂食(7日目以降は毎日)
注:T細胞は約24〜36時間ごとに倍増し、安静前に5〜7倍の集団増加を経験します。電気インピーダンスベースのセルカウンター(材料表参照)を用いてTセル体積を監視し、凍結保存の最適な時刻を特定します。
1. 各培養液をプールし、よく混ぜて細胞数を数えます。
2. 各培養液を37°Cに預熱したTCMで8 ×^{10 5} cells/mLに正規化し、適切な培養容器に再プレートします(表2)。
3. 平均細胞体積が320μm^³を下回るまで拡張を続け、その後冷凍保存ステップに進みます。
フローサイトメトリーを用いたT細胞転換の検証
注:T細胞のトランスダクションは、5日目から凍結保存日までの任意の時点で評価可能です。発現レベルは拡大過程で低下するため、早期測定によりフローサイトメトリー解析時に陰性と陽の分画が明確に分離されます。
1. 各培養から2個×^5T 細胞を10個採取します。
2. 適切なトランスダクションマーカー(例:抗CD19 CARや抗HER2シンノッチ)を抗体で染色し(材料表参照)、フローサイトメトリーによるマーカー発現解析
T細胞凍結保存(通常は10日目から12日目の間に)
注:クライオリザーブはT細胞を安静状態の直前または後に増殖させ、解凍中の生存率を向上させました。平均体積320μm^³ は凍結保存のカットオフとして機能します。細胞体積が300μm^³を下回ると、T細胞は分裂を停止し、総数が減少し始めます。すべてのグループが冷凍保存時点で同等の体積を持つようにしてください。これにより、グループによっては追加の1日の培養が必要になることもあります。適切な冷凍容器(例:アルコールフリーセル冷凍容器、 材料表参照)を用いて、1分間-1°Cの一定速度でセルを凍結します。
1. 各培養液を適切なチューブ(例:500 mL)にまとめ、細胞数を数えてインキュベーターに保存します。
2. セルの総数と希望するアリコート数を計算します。
3. 遠心分離機セル(300 × g、10分、4 °C)で上清液を吸引し、各培養液を50%無血清媒体、40%熱不活化FBS、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む冷凍培地に再懸濁し、2×10⁷ cell/mLで浸液します( 材料表参照)。
4. 細胞をクリオバイアル(250μLから1mL、1バイアルあたり5〜20個×10個⁶ 細胞に相当)に分割します。クライオビアルをセル冷凍容器に入れ、-80°Cで一晩保存します。
5. クライオビアルを液体窒素に移して長期保存してください。
T細胞の解凍
注意:各T細胞群について、解凍後に凍結培地でDMSOを希釈するために、37°Cまで予温された50mLのTCMを1本準備してください。盛り付けのために追加のTCMを温めてください。
1. クライオビアルは37°Cの水浴や温かい水の下で素早く解凍します。
2. 液体が見えたらすぐに組織培養フードに移り、予備温めたTCM500μLを加え、優しく混ぜてから細胞を50mLのTCM入った準備チューブに移します。
3. クライオビアルを500μLのTCMで洗い、同じチューブにウォッシュを加えます。
4. 細胞をRTで10分間培養します。
5. 遠心分離機セル(室温300× g、10分)で上清液を吸引し、細胞を4 ×^{10 6} cells/mLで再懸濁させます。
6. 適切な培養容器に細胞をプレート状に配置します(表2)。
7. 細胞はインキュベーターで一晩休ませてから、下流の実験に進めてください。

船	最小体積	最大体積
96井戸	0.1 mL/ウェル*	0.25 mL/ウェル
48井戸	0.2 mL/ウェル	1 mL/ウェル
24井戸	0.5 mL/ウェル	2 mL/ウェル
12井戸	1 mL/ウェル	4 mL/ウェル
6-ウェル	2 mL/ウェル	6 mL/ウェル
T25(水平)	3 mL	8 mL
T75(水平)	8 mL	20 mL
T150(水平)	20 mL	60 mL
* 培養体積を一時的に50 μL/ウェルに減らし、T細胞の伝達を促進する

表2:CAR T細胞増殖のための推奨培養培地体積。 T細胞増殖中の一般的に使用される容器フォーマットにおける最小および最大培養培地量。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最適化されたワークフロー(図1)による幅広いトランス遺伝子サイズでの強化を示すため、3つのレンチウイルスベクターサイズを選択しました:5.7 kb(CD19 CAR)、9.2 kb(HER2-MSLN svsNotch)、および10.1 kb(HER2-MSLN-CBG svsNotch)(図2A)。レンチウイルスは標準または最適化された条件下で作製されました(図2B:stdとoptおよび表1)。

最小の5.7 kbベクターでは、1回の生産バッチでT細胞のトランスダクションが中程度に改善されたのみが観察されました(図2B:上、希釈されていないウイルス使用時の73%対88%)。一貫してレンチウイルスの濃度は約1.5倍のわずかな増加にとどまりました(図2C:上、10⁸ TU/mL 2.86 × 10⁸ TU/mL 対 4.35 × 10⁸ TU/mL)。対照的に、9.2 kbベクターは性能が大幅に向上し、最大T細胞のトランスダクション率はバッチによって約5.4倍または3.8倍増加しました(図2B:中央では希釈されていないウイルス使用時の8.3%/16.6%対45.1%/63.1%)、機能的滴価も約3.3倍向上しました(図2C:中央;3.1 × 10⁶ TU/mL 対 10.1 × 10⁶ TU/mL)。最も強い効果は10.1 kbベクターで見られ、トランスダクション率が約12.4倍または9.8倍に増加しました(図2B:下の1.4%/1.5% 対希釈なしウイルス使用時の17.3%/14.7%)、機能的滴価は約10倍に改善しました(図2C:下の10⁶ TU/mL 0.24 × 10⁶ TU/mL 対 2.41 × 10⁶ TU/mL)。

次に、健康なドナーのT細胞を標準または最適化条件下で生成したレンチウイルスベクターで、対応するワークフローを用いて導入しました(図3および表1)。トランスデュクション効率を比較するために、各ワークフローで同量のレンチウイルスを使用し、複数の統合イベントを防ぐためにウイルス用量を30%以下に維持するように調整しました。標準条件および標準レンチウイルス産生を用いたT細胞と比較して、5.7 kbベクターで平均5.1倍、9.2 kbベクターで13.3倍、10.1 kbベクターで14.8倍のトランスダクション増加が見られました(図3Aおよび補足表1)。最適化されたワークフローで生成された選択されたT細胞培養は、さらに拡張され、静止状態に到達しました(図3B,C)。集団の倍増はT細胞ドナーによって5.3から6.7の範囲でした(図3B)。日々のT細胞容測定では細胞の破片は最小限で、増殖中に毒性の兆候は見られませんでした。凍結保存前に、トランスダクション率はCAR/synNotch受容体の発現染色またはmTag-BFP2¹⁹蛍光の測定によって評価されました(図3Cおよび補足図1)。5.7 kbベクター(黒;1:512レンチウイルス希釈)でトランスダクション率は31.2%、9.2 kbベクター(赤;1:16 レンチウイルス希釈)で29.8%、10.1 kbベクター(青;1:4レンチウイルス希釈)で20.2%でした。生成されたsvsNotch T細胞およびCAR T細胞の性能を検証する追加の機能データは、我々の補随研究¹⁷で示されています。重要なのは、最適化プロトコルで作られたエフェクターT細胞は、標準ワークフローで生成されたものと比べて集団倍増やT細胞表現型に差が見られなかったことである¹⁷。

figure-results-1
図2:標準かつ最適化されたワークフローに従うレンチウイルスの生産。 (A) 対応するトランス遺伝子サイズを持つレンチウイルスベクターの概観¹⁷.トップ:CD19に対するCARは、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーターによって発現され、総トランスジーンサイズは約5.7 kbです。中央および下部:HER2シンノッチ受容体は、2A自己切断ペプチド(P2A)を介して、EF1αプロモーターを介して青色蛍光リポータータンパク質(BFP2)(中央)またはクリックビートルグリーンルシフェラーゼ(CBG)(下部)と共発現しています。メソテリン(MSLN)標的型CAR(MSLN CAR)の発現は、GAL4特異的最小サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(GAL4-CMV)によって制御されます。総トランスゲインサイズは、HER2-MSLN svsNotch(中央)で約9.2 kb、下部のHER2-MSLN-CBG svsNotchで約10.1 kbです。SIN = 自己不活性化ベクター;LTR = 長い末端繰り返し配列。(B)標準(std)および最適化(opt)条件下で生成されたレンチウイルスの連続希釈によるT細胞のトランスダクション(A)ベクターを用いた。1ベクターごとに2つの独立した生成(円形と三角形)を持ち、それぞれ2回ずつ、1回のバッチで2つの異なるT細胞ドナーがいます。トランスダクション率はT細胞ドナー間で平均化されました。(C) 標準(標準、開円)および最適化(OPT、閉円)ウイルス産生の機能滴価(B)に示されている。データは、2つの独立したレンチウイルス産生から生成され、それぞれ2回のバッチで、1回のバッチに2人の異なるT細胞ドナーを用いました。すべての誤差バーは平均標準差±を示しています。統計的有意性は両尾対t検定を用いて算出されました。*p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.この図はロンメルらの許可を得て改変しています。¹⁷。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-2
図3:標準かつ最適化されたワークフローによるCAR Tセルの生産。 (A) 最適化(OPT)ワークフローによるT細胞トランスダクション率のフォールド増加(標準(std)ワークフローと比較して(表S1参照)。データは、異なるドナーを用いた2〜3つの独立したT細胞増殖と、2つの独立したレンチウイルス産生から得られました。(B) 最適化されたワークフローを用いて生成されるT細胞増殖の集団倍増。各ベクターに対して、異なる正常ドナー(ND)からの2つの独立したT細胞増殖を示し、それぞれ別々のレンチウイルス産生を用います。(C) 拡張したエフェクターT細胞におけるCAR、BFP2、シンノッチ受容体の発現を示すフローサイトメトリープロット(7日目(10.1 kb)または10日目(5.7 kbおよび9.2 kb)を対象としています(補 足図1参照)。すべての誤差バーは平均 ± SDを示しています。統計的有意性は両尾対t検定を用いて算出されました。*p < 0.03, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.この図はロンメルらの許可を得て改変しています。¹⁷。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:図3Cに関連するCAR、synNotch受容体、BFP2の発現を評価するためのゲーティング戦略。拡大T細胞培養におけるCAR、synNotch、BFP2発現を決定するために用いられたゲーティング戦略を示す代表的なフローサイトメトリープロット。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表1: 図3Aに関連する個々のT細胞増殖間のトランスダクション率。 標準かつ最適化されたワークフローで生成されるT細胞増殖のトランスダクション率。この表はロンメルらの許可を得て改変しています。¹⁷。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、svsNotch T細胞のような大きなレンチウイルストランスジーンを持つCAR T細胞の最適化された生産ワークフローを段階的に紹介します。このワークフローにより細胞の選別が不要となり、大型レンチウイルストランスジーンを持つエフェクターT細胞の効率的な生成が可能になります。このワークフローを用いて、レンチウイルストランスジーン9〜10 kb、最大トランスダクション率60〜70%(9 kb)または15〜20%(10 kb)を持つエフェクターT細胞を日常的に作製します。

ウイルス価やトランスダクション率の低下を解消する際には、いくつかの重要な要素を考慮する必要があります。まず、HEK293Tセルの品質についてです。細胞HEK293T一定のスケジュールで通過し、50〜70%の合流率を超えて成長させないことが重要です。私たちの経験では、以前は過剰成長していたHEK293T細胞から生成されたレンチウイルスベクターは、形態的に回復したように見えても抗体価が低下します。私たちは30番パス以降のHEK293T細胞を用いて高抗体価ウイルスベクターを日常的に作製しており、適切に維持されれば高いパッセージ数が許容されることを示しています。細胞の質に加え、トランスフェクション時のHEK293T細胞の合流も重要な要素です。高いコンフルエンシー(90-100%)でHEK293T細胞をトランスフェクションした際にレンチウイルス価が低下することが観察されています。

第二に、このプロトコルで指定されたタイミング、濃度、体積を厳格に守ることが不可欠であり、多くのステップは過去の研究で徹底的に最適化されています¹⁷。例えば、共重合体強化剤( 材料表参照)は、検出可能な毒性を伴いながらトランスダクション率を最大化するように調整されています。高濃度はさらにトランスダクションを増加させる一方で、毒性を引き起こしT細胞の増殖を減少させます。同様に、推奨される30〜36時間のウィンドウ(例:24時間または48時間)外でレンチウイルス上清液を採取した場合、対応する時間経過実験¹⁷では抗体価が低下しました。これに対し、CD4対CD8の比率を1:1に厳密に守る必要はなく、CD4/CD8分布が変動するバルクT細胞を用いた場合にトランスダクション効率に有意な差は観察されていません。しかし、この比率からの逸脱は拡大の期間や人口倍増の回数に影響を与える可能性があります。そのため、実験間の一貫性を確保するために、通常はCD4対CD8の比率を1:1に保っています。

今後の最適化は、特殊な培地製剤やカスタマイズされたサイトカインレジメンなど、さらに大きなレンチウイルストランスジーンを用いたT細胞転換の改善戦略に焦点を当てる可能性があります。このワークフローを自然キラー細胞やマクロファージなど他の免疫細胞タイプに拡張することで、治療応用が広がる可能性があります。重要なのは、このワークフローの臨床翻訳がレンチウイルス修飾細胞治療製品の製造コスト削減にも寄与する可能性があることです。

本書で提示される包括的なステップバイステッププロトコルは、大型レンチウイルストランスジーンを持つCAR T細胞の製造に関する実践的な参考資料を提供し、固体がんおよび血液がんに対する新規CAR T細胞の開発の基礎を築きます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.C.R.はKite Pharmaにライセンスされた特許および特許出願の発明者であり、これらのライセンスからライセンス収益を受け取ります。B.L.L.はノバルティス生物医学研究所およびカイトファーマにライセンスされた特許および/または特許出願の発明者であり、これらのライセンスからライセンス収益を受け取っています。B.L.L.はTmunity TherapeuticsとCapstan Therapeuticsの科学的創設者です。B.L.L.は、Avectas、Capstan Therapeutics、Cellula Therapeutics、Immuneel Therapeutics、Immusoft、In8bio、Ori Biotech、Oxford Biomedica、Quell Therapeutics、ThermoFisher Pharma Services、UTC Therapeuticsの科学諮問委員会のメンバーです。 B.L.L.は過去12か月間にアストラゼネカ、バイオメリュー、カイト・ギレアド、ルートヴィヒがん研究所のコンサルタントを務めました。C.H.J.は、ノバルティス・インスティテュート・オブ・バイオメディカル・リサーチ、カイトファーマ、キャプスタン・セラピューティクス、ディスパッチ・バイオセサピューティクス、ブルーホエール・バイオにライセンスされた特許および/または特許出願の発明者です。C.H.J.はAC Immune、BluesphereBio、BlueWhale Bio、Cabaletta、Cartography、Cellares、Celldex、Decheng、Qihan Biotech、Shinobi Therapeutics、Verismo、Vittoria Bio、WIRB-Copernicusの科学諮問委員会のメンバーです。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ジューン研究所の全メンバー、そしてヨハネス・C・M・ファン・デル・ルー、ディヴァンシュ・シュクラ、ジェームズ・L・ライリーの皆様にご協力いただき、感謝申し上げます。さらに、ペンシルベニア大学ペレルマン医科大学ヒト免疫学コアのマックス・エルダバス、エミレイ・マドックス、タニシュク・シンハ、ジアイ・シュウ氏に、精製されたヒトT細胞を提供していただき感謝いたします。最後に、フローサイトメーター機器の維持管理に感謝申し上げます。P.C.R.は国立がん研究所(助成金番号5T32CA009140)の支援を受けていました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
抗体 - 抗CD19 CAR	サイトアート	200101	Anti-CD19 CAR(イディオタイプ)、AF647共役、1:100
抗体 - 抗HER2シンノッチ	R&Dシステムズ	FAB95471G	抗トラスツズマブ(イディオタイプ)、AF488共役、1:80
ブリーチ	クロロックス	殺菌漂白剤
セル冷凍容器	生体解剖	FTS30	アルコールフリー
遠心分離機(大型)	サーモ・サイエンティフィック	レジェンドXTR
遠心分離機(ミニ)	フィッシャー・サイエンティフィック	スプラウト・プラス
遠心分離機(小型)	エッペンドルフ	5425
カウルターカウンター	ベックマン・カウルター	マルチサイズ4	細胞数と細胞体積を決定する電気インピーダンスベースのセルカウンター
クライオチューブ	サーモ・サイエンティフィック	375418
ジメチルスルホキシド(DMSO)	細胞シグナル伝達技術	12611P
DPBS(カルシウム、マグネシウムなし)	ギブコ	14190-136
ダイナビーズ(CD3/CD28)	ギブコ	40203D	T細胞刺激に用いられる活性化ビーズ
エタノール	デコン・ラボラトリーズ	200プルーフ
FBS(熱不活性化)	アヴァントル(VWR)	97068-091
フローサイトメーター	BD	LSRFortessa(647177)
冷凍庫(-80度、C)	パナソニック	MDFU76VA-PA
冷凍庫(液体窒素)	MVE HEco	1500-190
冷蔵庫(4 & deg;C)	フィッシャー・サイエンティフィック	等速
手袋(ニトリル)	ハリヤード	55082
グルタMAXサプリメント	ギブコ	35050-061	L-アラニル-L-グルタミン
HEPES(1 M)	ギブコ	15630-080
氷(乾式)	N.A.	N.A.
氷(湿った)	N.A.	N.A.
アイスバケツ	フィッシャー・サイエンティフィック	07-210-108
白衣(使い捨て)	カプラー	PVS112WH-MD
レンチバイラル包装プラスミド	独自仕様	N.A.	pTRP ガグ-ポル、pTRP RSV-レヴ、pTRP コカル-G
レンチバイラルトランスファープラスミド	独自仕様	N.A.	例:pTRPE svsNotch
リポフェクタミン3000型トランスフェクション試薬	インビトロジェン	L3000015	市販リポフェクション試薬;リポフェクタミン3000(L3000)およびその強化試薬(P3000)を含みます
マグネットスタンド(大型)	幹細胞	イージー9月 18103年	5 mL/15 mLの場合
マグネットスタンド(小型)	インビトロジェン	ダイナマグ-2 12321D	1.5mLチューブの場合
磁気攪拌棒	フィッシャー・サイエンティフィック	14-513-82	スターターバーキット
磁気攪拌プラットフォーム	サーモ・サイエンティフィック	S88857100
測定シリンダー(100 mL)	VWR	76019-316
MQ水	メルク	Q-POD	ウルトラプエ水;Millipak 40エクスプレスファイナルフィルター、0.22マイクロン(MPGP04001)を使用しています。
マルチチャネルピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	コメントを参照してください	30-300とマイクロ;L: FBE1200300;5-50とマイクロ;L: FBE1200050
Opti-MEM(L-グルタミン、フェノールレッドを含む)	ギブコ	31985-070	DNAトランスフェクションに使用される還元血清最小限必須培地
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL、10,000 & micro;g/mL)	ギブコ	15140-122
ピペット	フィッシャーブランド	コメントを参照してください	50 mL:13-678-11F;25 mL:13-678-11;10 mL:13-678-11E;5 mL:13-678-11D
ピペット(吸引式)	ファルコン	357558	2 mL
ピペット	ギルソン	ピペットマン P10/P20/P200/P1000
ピペットコントローラー	ヒルシュマン	ピペトゥスZ314951
ピペットの先端	トーマス・サイエンティフィック	コメントを参照してください	1000 & micro;L: 1159M42;200 & マイクロ;L: 1159M40;20 & マイクロ;L: 1159M43;10 & micro;L: 1159M41
プラスチック製保存ボトル(500 mL)	コーニング	430282
試薬貯留層	セルトリート	3054-2007
RPMI-1640(L-グルタミン、フェノールレッドを含む)	ギブコ	11875-085
スケール	オハウス	開拓者	最低精度は0.1gが必要です
ステリフリップフィルター(0.45 & micro;m)	ミリポール	SE1M003M00
シンペロンF108(SF108)	シグマ・オルドリッチ	07579-250G-F	T細胞トランスダクションを促進するために用いられるブロック共重合体
組織培養フラスコ - T150	コーニング	430825
組織培養フラスコ - T25	コーニング	430639
組織培養フラスコ - T75	コーニング	430641U
組織培養フード	サーモ・サイエンティフィック	1300シリーズA2
組織培養インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	ヘラセル150i
組織培養プレート - 6ウェル	コーニング	3516
組織培養プレート - 96ウェル平底	ファルコン	353072
組織培養プレート - 96ウェルの丸底	ファルコン	353077
トリプシン-EDTA(0.05%)	ギブコ	25300-054
チューブ - 1.5mlのスクリューキャップ	サーステット	72692005
チューブ - 15 mL	ファルコン	352099
チューブ - 5 mL	MSP	62-1028-2
チューブ - 500 mL	コーニング	431123
チューブ - 50ml	ファルコン	352098
超遠心分離機	ベックマン・カウルター	オプティマ XPN-100
バケット付きの超遠心分離機ローター	ベックマン・カウルター	SW 32 Ti
超遠心分離機チューブアダプター(円錐管用)	セトン・サイエンティフィック	4230
超遠心分離機管(円錐形)	セトン・サイエンティフィック	5067
渦	フィッシャー・サイエンティフィック	02215414
水浴(37度および度数;C)	フィッシャー・サイエンティフィック	アイソテンプ210	水の代わりにLab Amorビーズ(Gibco)と一緒に使用します
X-VIVO-15	ロンザ	04-418Q	T細胞凍結に使用される血清フリー培地

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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レンチウイルスベクターを用いた10 kbを超えるトランス遺伝子を持つキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の効率的な産生

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