肺線維症の再現可能かつ低侵襲マウスモデルのための洗練されたエアロゾルを用いた気管内ブレオマイシン投与法

サマリー

ここでは、気管 を通じて 投与されたエアロゾル化されたブレオマイシンを用いてマウスの肺線維症をモデル化するプロトコルを紹介します。この最適化された方法は、手術的切開を行わずに均一で定量的かつ正確な投与を可能にし、ブレオマイシン誘発性線維症の再現性と信頼性を高めています。

要約

肺線維症は、肺実質内に線維化性瘢痕組織が進行的に沈着し、深刻なガス交換障害を引き起こすことが特徴です。この疾患は、特発性肺線維症をはじめとする慢性間質性肺疾患のスペクトルの基礎であり、この疾患は非常に悪い予後を伴う疾患です。効果的な治療法が不足している中で、堅牢なマウスモデルは、基礎となる病理メカニズムの解明や新規抗線維化介入の評価に不可欠です。ブレオマイシン誘発性肺線維症は、最も広く利用されている実験モデルとして依然として存在しています。マウスにおける一般的な投与経路には、静脈内および腹腔内注射、侵襲的開閉気管挿入、非侵襲性気管滴液滴があります。しかし、侵襲的な手術は二次的な組織損傷を引き起こすことが多く、モデルの再現性や安定性を損なう可能性があります。逆に、非侵襲的な気管滴滴は通常、肺葉全体にブレオマイシンの分布が不均一になり、窒息のリスクを伴い再現性が低下し、技術的な課題が増します。これらの制約に対処するため、より運用が簡単で低侵襲、再現性が高く、動物の苦痛を大幅に軽減することで倫理的に優れている洗練されたエアロゾルを用いた気管内投与法が開発されました。小動物の喉頭鏡を用いて声門の環を直接観察し、マウスの気管直径よりも明らかに細い特殊なエアロゾル針を気管に挿入します。ブレオマイシン溶液は精密に制御された圧力で投与され、微細なエアロゾルを生成します。これにより、病原体の肺実質全体に均一かつ効率的な分布が保証されます。さらに、適切な気管支に針を当てることで、左肺や右肺を選択的に狙うことができます。この最適化モデルの用量反応関係は、肺機能の変化、組織病理学的症状、肺ヒドロキシプロリン含有量の体系的なモニタリングによって広く特徴付けられています。この洗練された実験プロトコルは、実験室での標準化を促進し、最終的には新規抗線維症治療薬の開発と前臨床検証を加速させることが期待されています。

概要

肺線維症(PF)は、進行性の肺実質損傷と異常な修復を特徴とする致死性疾患の一群であり、特発性肺線維症(IPF)が30%〜40%を占めます。患者の診断年齢は65歳、そのうち80%以上が60歳以上で60歳以上です。²。世界的な高齢化が進む中、IPFの発生率は年々増加しており、世界のIPF発生率は年間3〜9人/10万人にのぼります。アメリカ合衆国の65歳以上の研究によると、この年齢層の発症率は年間93.7/100,000人に急増しました。^3.4。

肺線維症の最初の歴史的に開発されたモデルはブレオマイシン誘発モデルであり、学術界でよく用いられています。最も優れた特徴付けと現在最も広く使われている動物モデル^{は5であり}、肺の炎症、上皮損傷、線維芽細胞増殖、過剰な細胞外マトリックス(ECM)沈着など、IPFやその他の線維化性ILDの特徴を再現しています^。.さらに、ブレオマイシン投与の用量と頻度によって、急性肺線維症と慢性肺線維症の両方をモデル化できます。ブレオマイシン曝露後5〜7日以内に肺が急性炎症期に入り、その後7日目頃から線維化期が続くと報告されています。21日目までに、顕著な線維化性再構築が観察され、モデルは初期の炎症反応と後期の線維化病変の両方を時間的に定義された方法で再現可能となります(図1A)。これにより、初期損傷から線維化段階までの疾患全過程の研究が可能となり、薬剤開発およびすべての段階でのメカニズム研究に非常に重要です^8,9。

ブレオマイシンのモデリング経路は多様で、局所または全身的に投与可能で、気管内経路、鼻経路、静脈内経路、腹腔内経路などが含まれます。最も一般的に使われるのは気管内注射です。欠点は、マウスに切開ができ、モデル化されたマウスの生存率に影響を与える^{ことです。}その後、マウス¹¹において気管挿管および点滴注射に留置針を使用することが可能になる改良がなされました。しかし、注射器で押し出される薬剤は肺内でブロックとしてしか分布できず、これにより各肺葉にブレオマイシンが不均一に分布し、局所的な過剰密度を生み、マウスモデルの安定性に影響を及ぼすことがあります。さらに、チャンバーネブライザーカートリッジがブレオマイシンの投与に使用されましたが、各マウスに吸入されたブレオマイシンエアロゾルの量は正確に定量化できず、単回誘導時間は長い¹²です。そのため、肺線維症の再現可能かつ低侵襲マウスモデル向けに、精製されたエアロゾルを用いた気管内ブレオマイシン投与法が開発されています。ブレオマイシンはエアロゾル化されており、肺内で均一な分散と沈着を可能にし、肺疾患の病理をよりよく再現します。この方法の登場により、肺線維症を完全に治癒できる薬剤の研究が加速することが期待されています。

プロトコル

すべての動物処置は、施設動物ケア・利用委員会(IACUC)が承認した機関ガイドラインのもとで実施されました。実験全体を通じて適切な動物福祉措置が実施されました。実験対象は、生後6〜8週齢の雄C57BLまたは6匹マウスで、体重約25gでした。 材料表 には、本研究で使用されるすべての動物、試薬、機器およびそれらの商業的供給源が一覧化されています。

1. 動物の選択と順応

1. すべてのマウスは、12時間の明暗サイクルで病原体のない特定の環境で飼育 し、自由 に餌や水を得られます。
2. マウスを施設に5〜7日間慣らしてからエアロゾルモデルを開始します。

2. ブレオマイシン溶液の調製

注意:ブレオマイシンは細胞毒性抗腫瘍薬です。適切なPPEを着用し、認証済みのバイオセーフティキャビネット内ですべての手順を行ってください。

1. 滅菌1 mLシリンジを使い、滅菌0.9%塩化ナトリウム3 mLを抽出し、15 Uの塩酸ブレオマイシン入りバイアルに注入します。
2. 粉末が完全に溶けるまで優しく回して5 U/mLのストック溶液を作ります。
3. ストック溶液を無菌の1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに分割します。滅菌生理食塩水で希釈して、3.75 U/mLおよび2.5 U/mLの作業液を準備します。
   注:25gマウスの場合、これらの濃度はそれぞれ7.5 U/kgおよび5 U/kgの投与量に相当します。マウスの重さが変わる場合は濃度を調整してください。
4. 作業中の溶液は4°Cで最大1週間、または-80°Cで最大1ヶ月保存します。使用前に解凍して室温にしてください。

3. エアロゾルを用いた気管内ブレオマイシン投与

1. 麻酔の調製と投与
   1. 麻酔作動液を、0.1gのペントバルビタールナトリウム粉末を10mLの無菌生理用生理食塩水に溶かして準備します。0.22μmのPES膜フィルターを用いてろ過します。溶液は4°Cの光の遮られた環境で保存し、準備から3日以内に使用してください。
   2. 1mLの注射器と26ゲージの針を用いて腹腔内注射でペントバルビタールナトリウム溶液を、体重60mg/kgの投与量で投与します。麻酔の深さや持続時間が不十分な場合は、担当獣医師の指導のもと、動物の反応に応じて投与量を調整してください。
   3. 注射後数分後に、足の指をしっかりつまみ、撤退反射がないことを確認することで麻酔深度を評価し、その後の処置に進みます。
2. エアロゾル供給装置の準備
   1. エアロゾル投与装置を準備し、ネブライジング針、ネブライジング注射器、投与柱がすべて揃い無菌であることを確認します(図1B)。
   2. エアロゾル投与注射器を無菌生理食塩水に浸します。ゆっくりと液体を吸引し、8秒間休止します。液体を素早く排出してください。これを3回繰り返して、システムを満たしてフラッシュします。
   3. 最終排出後に生理食塩水を注射器に補充してください。エアロゾライジング針を取り付け、接合部に生理食塩水が満たされていることを確認します。
   4. 組み立てた針を生理食塩水に浸し、吸引・停止・排出のサイクルをさらに3回繰り返して気泡を除去します。
      注意:準備確認のために、暗い背景に生理食塩水を排出してください。急速に排出された生理食塩水が暗い背景に扇形の霧を形成するようにしてください。
3. 気管内エアロゾル投与法
   1. エアロゾル針にブレオマイシン作動液を3回吸い、8秒の間隔を置いて排出します。
   2. 50μLピラーの上に25μLのドージングピラーを挿入して体積を校正します。必要な量(50 μL)を吸引します。余分な液体は排出してください。
      注:この投与方式により、人為的ミスを最小限に抑え、一貫した供給が保証されます。
   3. 麻酔をかけたマウスを挿管プラットフォームに置き、上切歯をフックし、四肢を固定するためにテープで固定します(図1C)。
      注意:リズミカルな胸の動きを確認してください。動物が活動的であれば、追加の麻酔投与を行います。
   4. 曲がった鉗子を使って舌を優しく引き抜いてください。小動物の喉頭鏡を挿入して声門を露出させます(図1D)。
   5. エアロゾライジング針を声門に垂直に挿入します。ブレオマイシンエアロゾルを迅速に投与します(図1E)。
      注意:針の先端を目標の肺に向けて角度をつけて、ターゲットを絞って投与してください。外傷を防ぐために、あまり深く挿入しすぎないようにしましょう。ネブライザー針の先端は、マウスの気管の分岐点(最初の分岐点)に近づけつつも触れない位置に置くことで、最良のモデリング効果を得ることができます。もし先端を気管の中央だけに挿入すると、エアロゾルは気管壁に当たるだけで大きな水滴を形成し、それが咳き出されたり飲み込まれたりします。先端が気管分岐部に近すぎると、気管損傷のリスクがあります。

4. 術後の回復

1. 体温を保つために温めパッドの上にマウスを置きます。マウスが麻酔から回復するまで(通常1〜2時間)継続的に観察してください。
2. 指をつまんで反射を確認し、ネズミが生きているか確認してください。
3. 体重、活動量、身だしなみ、呼吸器の兆候など、21日間の毎日の臨床モニタリングを行います。
4. 以下の条件のいずれかが満たされた場合、動物を安楽死させる:(i) >治療前のベースラインと比べて体重が20%減少、または≥15%の減少に他の臨床的苦痛の兆候を伴う;(ii) 安静時の持続的な重度の呼吸困難(苦労または腹呼吸、顕著な頻呼吸または徐呼吸、鼻の膨らみ、口を開けた呼吸)、四肢のチアノーシスの有無を問わず;(iii) 食事や水が得られない、著しい無気力、または衰えた状態(取り扱いに反応がない、または正直反射の喪失);または(iv)重度の脱水、低体温症、または担当獣医師が判断した回復不能な悪化の兆候。これらの人道的な終点に達したら、動物を過剰投与のペントバルビタール(≥150 mg/kg、独立投与)で安楽死させ、その後に二次的な物理的治療(例:子宮頸部脱臼)を行い、死を確実にし、痛みや苦痛を最小限に抑えます。

5. 末期肺機能の測定および組織採取

1. 21日目には、同じ麻酔溶液を90 mg/kgの単位でマウスに麻酔し、深麻酔を誘発し呼吸を抑制します。
2. 足の指をつまんで完全麻酔を確認してください。皮膚を切って気管を露出させ、筋肉を分離します。
3. 気管に小さな面取り切開を入れ、挿管針を挿入します。外科的結紮で固定してください。
4. マウスをコンピューター制御の小動物肺機械人工呼吸器に移します。人工呼吸を開始し、自然呼吸をしないようにしてください。人工呼吸器システムを使って肺機能パラメータを測定してください。
5. 5〜10mLの無菌生理食塩水で右心室灌流を行い、肺が白く見えるまで行います。
6. 肺全体を切り離してください。左肺を中性緩衝ホルマリンで24時間固定してください。
7. 固定された肺組織をパラフィンに埋め込み、切片し、COL1A1およびα-SMAに対してH&E染色、マッソン染色、免疫組織化学的染色を行います。
8. 右肺をビーズ付きの2mL均質化チューブに入れます。ヒドロキシプロリンキットのプロトコルに従って水を加えてください。均質化してアッセイを進めてください。

結果

本研究では、ブレオマイシンを用いてマウスに肺線維症を誘発するエアロゾルベースの気管支内投与法を提案しました。予備実験では、緑色染料をエアロゾル化して異なるマウスの肺に投与しました。造影剤は肺全体に斑点分布パターンを示し、エアロゾルを用いた気管支内投与により病原剤がすべての肺葉に均一に分散したことを示しています(図1F)。 図1F に示された緑色インクの投与は、その後のブレオマイシン投与と同じ手順で行われました。

主実験では、マウスに5 U/kgまたは7.5 U/kg体重のエアロゾル化ブレオマイシンを投与するか、偽の比較として通常の生理食塩水を投与しました。21日目には、動物が安楽死(機関承認のプロトコルに従い)、その後、前述の肺機能検査および肺組織採取が行われました(図1A)。肺線維症の評価におけるゴールドスタンダードとされる組織病理学的...

ディスカッション

本研究はマウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の最適化された非侵襲的気管内霧化モデルを提案しました。小動物の喉頭鏡を使って声門を特定し、マウスの気道に小さな霧化針を挿入しました。手動で圧力をかけて薬剤を肺炎に霧状化し、非侵襲的注射で使用される保持針による不快感や窒息を軽減しました^13,14。さらに、これらのエアロゾルはマウスのどの肺葉にも均一に斑点状に分布します。このモデルは3Rの原理と実験的安定性のバランスを取っており、マウスに追加の害を与えず、ブレオマイシンの用量と肺の分布を正確に制御することで、肺線維症における前臨床薬開発のより信頼性の高いツール^{を提供します。}

このモデルの利点は、気管手術の複雑さを回避しつつ、エアロゾル化ブレオマイシンを迅速かつ正確に再現性のある投与できる点にあります。この方法は運用の変動性を減らし、ストレスや外傷を最小限に抑...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 & μ;Mポリエーテルスルホン注射器フィルター	細胞科学	CSTPE3320
1mL使い捨て注射器	BD	300481
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ	サービスバイオ	EP-150-M
2.0 mL強化溶解チューブ	サービスバイオ	HT-200-M
4 & deg;C実験室用冷蔵庫	美玲	BCD-402WPCX
50 mL円錐形遠心分離機チューブ	サービスバイオ	EP-5001-J
-80 & deg;C超低温冷凍庫	ハイアルバイオメディカル	DW-86L828J
絶対エタノール	シノファーム化学試薬株式会社	100092683
酸性分化解	サービスバイオ	G1039
小動物挿管用のエアゾールマイクロスプレー	上海玉炎インスツルメンツ有限公司	燕-30012
基本的な外科用器具セット	上海玉炎インスツルメンツ有限公司	YAN-21A3
ブレオマイシン塩酸塩溶液	漢徽製薬株式会社	H20055883
ブルーイング試薬	サービスバイオ	G1040
コンピューター制御の小動物肺機械用人工呼吸器	EMKAバイオテック北京有限公司	FX-2
電気絶縁テープ	3歳	1500
嗜酸Y染色溶液	珠海巴索バイオテック有限公司	BA4022
緑色のマーキングインク	パイロット	チクリン
ヘマトキシリン染色溶液	サービスバイオ	G1004
ヒドロキシプロリン定量分析キット	アブカム	AB222941
層流フード	HDL	DL-CJ-1N
小動物処置用の喉頭鏡	深圳ビリード生物学技術株式会社	DXSHJ0
光顕微鏡	ニコン	E100
低毒性の脱ワックス溶液	サービスバイオ	G1128
マッソンのトリクロム染色キット	珠海巴索バイオテック有限公司	BA4079B
吸収検出機能を備えたマイクロプレートリーダー	アジレント	シナジーH1
中性緩衝ホルマリン	サービスバイオ	G1101-3ML
ニュートラル取り付け媒体	シノファーム化学試薬株式会社	10004160
組換えウサギモノクローナル抗COL1A1抗体	華比オ	HA722517
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	5424R
RNaseフリーの水	ジェネラルビオール	TYJC002
小動物気管挿管プラットフォーム	上海玉炎インスツルメンツ有限公司	CG-02M
滅菌0.9%塩化ナトリウム溶液	中国大塚製薬株式会社	H12020024
組織ホモジナイザー	サービスバイオ	KZ-III
キシレン	シノファーム化学試薬株式会社	10023418
ジルコニア粉砕ビーズ	サービスバイオ	G0203