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方法論記事

In vivo レーザー共焦点イメージングによる皮下結合組織における鍼治療誘発性ダイナミクスのリアルタイムモニタリング

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DOI:

10.3791/69173

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2025年10月10日

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, Jianghan University, 2School of Medicine, Jianghan University, 3Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、生きたラットの血管拡張やコラーゲンリモデリングなどの鍼治療誘発性形態学的ダイナミクスを追跡するためのリアルタイム方法として、 in vivo レーザー共焦点イメージングを確立しました。フルオレセインナトリウム標識を使用して、このアプローチは即時および遅延組織反応の両方を捉え、鍼治療や灸などの理学療法を定量的に評価するための新しいツールを提供します。

要約

鍼治療効果のリアルタイム動的モニタリングは、その生物学的メカニズムを解明するために重要ですが、従来の組織学的方法では、生きた微小環境における一時的な反応を捉えることができません。ここでは、 in vivo レーザー共焦点イメージングに基づく方法論的枠組みを確立し、鍼治療介入後の局所組織の形態学的変化を高解像度でリアルタイムに観察できるようにしました。ラットにフルオレセインナトリウムを静脈内注射した後、鍼治療中に微小循環および細胞外マトリックス(コラーゲン線維配列など)の動的変化が追跡されました。その結果、この方法では、鍼治療によって誘発される即時(血管拡張など)と遅延(炎症反応など)の組織反応を、空間分解能0.5μm、時間分解能3.5fpsで明確に区別できることが実証されました。その後の定量分析により、形態学的パラメータの客観的な測定が可能になりました。この研究で説明されているこのプロトコルは、鍼治療メカニズムの in vivo 研究のための視覚化ツールを提供し、他の物理的刺激 (灸など) の効果を評価するための技術参考資料として機能します。

概要

鍼治療は、伝統医学の基礎として、複雑な組織レベルの反応を通じて治療効果を発揮します 1,2,3,4。しかし、メカニズムの洞察は、静的なスナップショットをキャプチャするが、生組織における形態学的適応(血管調節、細胞外マトリックスリモデリングなど)のリアルタイムダイナミクスを解決できない従来の組織学によって制限されたままです5。生体内顕微鏡は動的なイメージングの可能性を提供しますが、鍼治療研究、特に物理的刺激に対する時空間反応を定量化するための応用はほとんどありません 6,7。対照的に、この共焦点イメージングアプローチは、深部組織(筋肉層やツボST 36 / GB 34など)における赤血球の移動速度やコラーゲン配列の変化率などの構造的および動的パラメーターの定量的抽出を可能にし、空間分解能、体積イメージング、および長期追跡における従来の生体内顕微鏡の限界を克服します8。

レーザー共焦点イメージングは、細胞分解能9,10,11,12,13でin vivo視覚化のための強力なツールとして登場しました。しかし、既存の研究は主に表層組織 (皮膚や角膜など) に焦点を当てており、深部鍼治療の標的に対処したり、定量的形態学的分析を統合したりする研究はほとんどありません。重要なことに、私たちの知る限り、鍼治療の操作と生組織の動態変化を相関させるための標準化された方法論は存在しません。

ここでは、鍼治療による形態学的イベントをリアルタイムで追跡するための共焦点イメージングベースの方法論的プラットフォームを確立することで、このギャップを埋めます。造影剤としてフルオレセインナトリウム(1%濃度、0.1mL/体重100gで静脈内投与)を用いて、鍼治療刺激中の即時血管拡張から遅延炎症カスケードまで、深さ400μmまでの450μm×視野における微小循環およびマトリックス変化の高解像度モニタリング(空間分解能0.5μm/時間分解能3.5fps)を実現します。このアプローチにより、コラーゲン線維再調整の 3D 再構成とパラメーター定量化がさらに可能になり、エンドポイント組織学の限界が克服されます。

このプロトコルを実装するための実際的な考慮事項は、(i)推奨されるハードウェアには、≥0.5μmの分解能と≥3fpsの取得速度の共焦点システムが含まれること、(ii)典型的な制限には、90秒を超える連続イメージングおよび呼吸または組織の動きに対する感度を含む、および(iii)高密度または散乱組織では深さ浸透が低下する可能性があります。私たちの知る限り、この研究は鍼治療誘発組織再編成の最初の動的アトラスを提供するだけでなく、生体システムにおける理学療法 (灸など) を評価するための前例も示します。一過性の生理学的反応を定量化可能な指標に変換することにより、神経調節療法のメカニズム研究に新しいパラダイムを提供します。

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プロトコル

すべての手順は、中国中医科学院鍼灸研究所の動物倫理委員会によって承認されました (No. D2023-01-29-01)。8匹の雄スプレイグドーリー(SD)ラット(8週齢、200-220 g)をBiotechnology Co., Ltd.(ライセンス番号。SCXK (Jing) 2020-0001)。動物は、制御された条件下で滅菌された隔離囲いに入れられました:12時間の明暗サイクル、21±±2°Cの温度、標準的な食料ペレットと水への自由なアクセス。すべての実験は、施設のガイドラインと実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠しています。

メモ:主な手順をハイライトしたフローチャートを 図1に示します。

1. 動物およびトレーサーの調製:フルオレセインナトリウム(FS)

  1. 1%フルオレセインナトリウム(FS)染色液を調製するには、0.1 gのFSを10 mLの滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)に溶解します。その後の使用のために、溶液を室温(RT)で保存してください。
  2. イソフルラン導入(誘導:5%イソフルラン、維持:2.5%イソフルラン)によってSDラットを麻酔します。電動バリカンを使用して頭蓋領域(頭を除く)から毛を取り除き、脱毛クリームを5分間塗ります。ぬるま湯ですすいで、残ったクリームや髪を取り除きます。
    注意: 定量的画像分析を損なう可能性のある皮膚損傷を防ぐために、操作中はクリッパーブレードを皮膚表面と平行に保ちます。動物の低体温症が実験結果に影響を与えるのを避けるために、すすぎには温水を厳密に使用する必要があります。

2. FSの注入

  1. ネズミを確保します。
    1. 脱毛ラットに10%ウレタン(1 g / 10 mL、生理食塩水)を1.0 g / kgの用量で腹腔内注射することにより麻酔します。
    2. 完全な麻酔が完了したら、動物を仰臥位で手術台に固定します。鉗子を使用して後足につま先を軽くつまみ、離脱反射がないことを観察します。湿った綿の先端で角膜に軽く触れて角膜反射の喪失を確認します。
    3. 処置を進める前に、持続的な無反応と安定した呼吸数を確認してください。麻酔中は、37°Cの加熱パッドで動物の体温を維持します。
      注: イメージング ウィンドウの再配置を損なう不随意運動を防ぐために、完全な麻酔を確認する必要があります。
  2. 体重100gあたり0.1mLの用量で尾静脈を介して1%FS溶液を静脈内投与します。
    1. 27 Gの針を取り付けた1 mLのシリンジを使用して尾静脈注射を行います。尻尾をぬるま湯でやさしく拭いて血管拡張を促進し、その後70%エタノールで消毒します。
    2. 針を静脈の縦軸に沿って浅い角度(≤15°)で斜めに挿入します。溶液を0.1〜0.2 mL/分の速度でゆっくりと注入します。
    3. 技術的な抵抗のない流れ、血管周囲浮腫がないことを確認し、瞳孔、耳介、足の黄色の変色によって注射が成功したことを確認します。
      注:偶発的な動脈内注射は厳密に避けなければなりません。

3. in vivo プローブ共焦点レーザー内視鏡検査(pCLE)のセットアップ

  1. pCLEシステムを作動させ、走査プローブコネクタと遠位先端の両方の清浄度を確認します。
  2. 生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して、プローブの遠位先端(スキャン先端とも呼ばれます)を洗浄し、レンズ組織で穏やかに乾かします。
  3. レーザープローブをターゲット観察部位(太ももの内側など)に配置します。調整可能なクランプを使用して共焦点イメージングプローブを固定し、圧縮アーティファクトのない組織表面との安定した接触を確保し、調整ノブを締めて固定します。
  4. プローブをpCLEシステムに接続し、取得パラメータ(視野[FOV]、ストレージディレクトリなど)を設定します。この実験で使用した具体的なパラメータは次のとおりです。深さ: 18 μm;レーザー:219 mW;明るさ:76%;速度:1920×540;ゲイン: 2400;ズーム:1×(464 μm);フィルター:LP 515;ルックアップテーブル:グレースキャン。
    注:イメージングパラメータ(スキャン深度/レーザー出力)は、組織構造の明確な視覚化が達成されるまで、繰り返し最適化されました。一貫した強度は、縦方向の画像比較可能性にとって重要です。プローブと組織の界面に37°Cの生理食塩水滴を添加すると、最初の反復で観察されたシグナル損失が排除されました。この研究で使用されたレーザー出力は、 in vivo 共焦点イメージングにおける光毒性の一般的に受け入れられているしきい値を下回っています。

4. pCLEによる組織構造のイメージングと取得

  1. プローブを皮膚表面に配置し、データ収集を開始して組織構造を視覚化します。
    1. プローブを鉛筆で握る方法で持ちます。ターゲット領域(視野内に血管系または線維性結合組織がある領域など)に操作し、遠位先端をイメージングゾーンに直接配置してから、プローブアームを介して安定させます。
  2. まず、生理学的条件下で 1 分間ベースラインの組織構造を取得し、続いて鍼治療介入中に 5 分間記録します。介入後に取得を終了します。データファイルは、手順3.3〜3.4で指定したディレクトリに自動的に保存されます。
    注:ファイルはレイヤースタック(.tiff)と個々のフレーム(.tiff)として保存されます。

5.鍼治療介入

注: イメージング ステップでの取得は、介入中に実行されます。

  1. 1寸(中国の長さ測定単位は約13 mm)の使い捨てステンレス鋼針を、プローブで観察された組織に隣接するツボに挿入します。1本のリード線をステンレス鋼の針に接続し、もう1本の参照電極をラットの尻尾に固定します。
  2. 次のパラメーターを使用して電気鍼治療 (EA) 刺激を適用します: 1 mA 強度、高密度分散波 (2/15 Hz)、5 分間。
    注:画像の安定性を損なうEA誘発性皮膚振戦を防ぐために、針挿入部位とプローブの間に十分な距離(>3 mm)を維持してください。

6. 画像解析

  1. 取得した画像スタックをImageJで開きます。空間キャリブレーションをマイクロメートルに変換し、プラグイン互換性のために画像形式を 8 ビットに変換します (画像>タイプ > 8 ビット)。
    メモ: デフォルトの画像寸法はインチ単位です(システム固有の設定)。
  2. 微小循環:単一毛細管セグメント、マトリックス構造:コラーゲン繊維領域の関心領域(ROI)を定義します。縦断的な一貫性のために、シーケンシャル画像間で同一のROIを維持します。
  3. 微小循環分析
    1. 観察が必要な赤血球を含む領域を選択し、画像をトリミングして他の干渉領域を削除します(長方形>画像>クロップ)。 閾値ツール を使用して、赤血球(RBC)のみをセグメント化します(画像>しきい値の調整ツール>)。
    2. MTrack2プラグインをロードします。RBCサイズ(この実験では10〜42ピクセル)に基づいて適切なトラッキングパラメータを設定して、干渉を排除し、正確なRBCトラッキングを保証します(プラグイン>トラッキング>MTrack2)。
  4. マトリックス構造解析
    1. Directionalityプラグインをロードし、フーリエ成分モードを選択し、0°から180°の方向にわたるコラーゲン繊維の分布比率の統計分析を実行します(Analyze > Directionality)。

7. データのファイナライズ

  1. [Group]_[Date].extension という命名規則を使用して、分析したデータを TIFF/XSL 形式でエクスポートします。すべての生ファイルと処理済みファイルを指定された安全なサーバーにバックアップします。統計分析のために定量的な出力を要約スプレッドシートに記録します。

8. 安全と廃棄物管理

  1. 個人用保護具 (PPE): ウレタン、イソフルラン、またはフルオレセイン ナトリウムを取り扱うときは、ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグルを着用してください。
  2. 麻酔薬の取り扱い: 吸入曝露を最小限に抑えるために、ドラフト内でウレタンまたはイソフルランを含む処置を実行します。
  3. 鋭利物の注意事項: すべての針と鋭利な物体は、指定された耐穿刺性鋭利物容器に直ちに廃棄してください。
  4. 電気鍼治療 (EA) の安全性: EA 機器の電気的絶縁を確認し、漏れ電流や短絡を防ぐためにリード接続を固定します。
  5. 廃棄物処理: イソフルランボトルは、施設のガイドラインに従って医療廃棄物として廃棄します。染料で汚染された物質(綿棒、ティッシュなど)廃棄物は、密閉された有害廃棄物容器に廃棄してください。鋭利物は、認定された鋭利物処理ボックスに収集します。
    注: すべての手順は、施設の安全および環境衛生規制に準拠する必要があります。

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結果

このプロトコルは、微小循環および細胞外マトリックス構造に対する鍼治療の効果をリアルタイムで動的に評価するための pCLE の有用性を実証します。尾静脈を介してフルオレセインナトリウムを静脈内投与した後、局所毛細血管内の赤血球速度の変化とコラーゲン線維配列の再編成を観察することによって変化を評価しました。

鍼治療後5分の代表的な結果は、赤血球の動きの加速(P < 0.05、t検定)(図2A)とコラーゲンの規則正しい束状構造への再配置(図2B、C)を明らかにしました。鍼治療による局所血行動態の加速と間質性浸透圧シフトにより、線維束の分離が引き起こされ、イメージングで明るくなった領域が増加し、線維間空間が広がるとして現れました。また、鍼治療後の毛細血管透過性の高まりが局所的なフルオレセイン漏出に寄与す...

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ディスカッション

結果で実証されているように、この研究で確立された in vivo 共焦点イメージング プロトコルにより、標準的な市販の機器と日常的な蛍光標識を使用して、鍼治療介入中の微小循環および細胞外マトリックス動態の同時定量分析が可能になります。このプロトコルの成功は、フルオレセインナトリウム注射の正確なタイミング、持続的な微小血管造影の確保14、および縦方向のコラーゲン線維追跡に不可欠な厳密な動物固定化という 2 つの重要なステップに依存しています。

技術的な課題に対処するために、的を絞った最適化が実装されました:プローブと組織の界面に37°Cの生理食塩水液滴を追加すると、電気鍼治療部位とプローブの間の距離を>3mmに保ちながら、最初の反復で観察された信号損失が排除され、振動アーティファクトが減少しました。これらの改良により、データの再現性が大幅に向上しました。

このプロトコルは0.5μmの分解能でリアル...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2024YFA1209900、2024YFA1209903、2024YFA1209904) の資金提供を受けました。中国国家自然科学基金(82050006)の特別基金。湖北省TCM医学管理局のTCM研究プロジェクト(ZY2025Z015);江漢大学研究費 (2024JCYJ13)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1寸鍼Hwato、蘇州、中国該当なし13 mm / 0.25 mm
10%フルオレセインナトリウムGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd、中国H45021477
動物麻酔機RWD、深セン、中国R620IEの
体温モニターRWD、深セン、中国69026
電気鍼治療器具Hwato、蘇州、中国SDZ-III型
脱毛クリームVeet, フランス
イメージJ米国国立衛生研究所https://imagej.nih.gov/ij/
生体内プローブ共焦点レーザー内視鏡検査Optiscan, オーストラリアビューnVivoB30直径:4mmのハンドヘルドリジッドプローブ、曲げに強く、長期間にわたって構造的完全性を維持します。長さ: ≥46mm.スキャンモード:ズームスキャン機能。
イソフルランRWD、深セン、中国
R510-22-16
ウレタンSigma-Aldrich, アメリカ94300

参考文献

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