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方法論記事

In vivo レーザー共焦点イメージングによる皮下結合組織における鍼治療誘発性ダイナミクスのリアルタイムモニタリング

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DOI:

10.3791/69173

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2025年10月10日

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究は、生きたラットの血管拡張やコラーゲンリモデリングなどの鍼治療誘発性形態学的ダイナミクスを追跡するためのリアルタイム方法として、 in vivo レーザー共焦点イメージングを確立しました。フルオレセインナトリウム標識を使用して、このアプローチは即時および遅延組織反応の両方を捉え、鍼治療や灸などの理学療法を定量的に評価するための新しいツールを提供します。

要約

鍼治療効果のリアルタイム動的モニタリングは、その生物学的メカニズムを解明するために重要ですが、従来の組織学的方法では、生きた微小環境における一時的な反応を捉えることができません。ここでは、 in vivo レーザー共焦点イメージングに基づく方法論的枠組みを確立し、鍼治療介入後の局所組織の形態学的変化を高解像度でリアルタイムに観察できるようにしました。ラットにフルオレセインナトリウムを静脈内注射した後、鍼治療中に微小循環および細胞外マトリックス(コラーゲン線維配列など)の動的変化が追跡されました。その結果、この方法では、鍼治療によって誘発される即時(血管拡張など)と遅延(炎症反応など)の組織反応を、空間分解能0.5μm、時間分解能3.5fpsで明確に区別できることが実証されました。その後の定量分析により、形態学的パラメータの客観的な測定が可能になりました。この研究で説明されているこのプロトコルは、鍼治療メカニズムの in vivo 研究のための視覚化ツールを提供し、他の物理的刺激 (灸など) の効果を評価するための技術参考資料として機能します。

概要

鍼治療は、伝統医学の基礎として、複雑な組織レベルの反応を通じて治療効果を発揮します 1,2,3,4。しかし、メカニズムの洞察は、静的なスナップショットをキャプチャするが、生組織における形態学的適応(血管調節、細胞外マトリックスリモデリングなど)のリアルタイムダイナミクスを解決できない従来の組織学によって制限されたままです5。生体内顕微鏡は動的なイメージングの可能性を提供しますが、鍼治療研究、特に物理的刺激に対する時空間反応を定量化するための応用はほとんどありません 6,7。対照的に、この共焦点イメージングアプローチは、深部組織(筋肉層やツボST 36 / GB 34など)における赤血球の移動速度やコラーゲン配列の変化率などの構造的および動的パラメーターの定量的抽出を可能にし、空間分解能、体積イメージング、および長期追跡における従来の生体内顕微鏡の限界を克服します8。

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プロトコル

すべての手順は、中国中医科学院鍼灸研究所の動物倫理委員会によって承認されました (No. D2023-01-29-01)。8匹の雄スプレイグドーリー(SD)ラット(8週齢、200-220 g)をBiotechnology Co., Ltd.(ライセンス番号。SCXK (Jing) 2020-0001)。動物は、制御された条件下で滅菌された隔離囲いに入れられました:12時間の明暗サイクル、21±±2°Cの温度、標準的な食料ペレットと水への自由なアクセス。すべての実験は、施設のガイドラインと実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠しています。

メモ:主な手順をハイライトしたフローチャートを 図1に示します。

1. 動物およびトレーサーの調製:フルオレセインナトリウム(FS)

  1. 1%フルオレセインナトリウム(FS)染色液を調製するには、0.1 gのFSを10 mLの滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)に溶解します。その後の使用のために、溶液を室温(RT)で保存してください。
  2. イソフルラン導入(誘導:5%イソフルラン、維持:2.5%イソフルラン)によってSDラットを麻酔します。電動バリカンを使用して頭蓋領域(頭を除く)から毛を取り除き、脱毛クリームを5分間塗ります....

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結果

このプロトコルは、微小循環および細胞外マトリックス構造に対する鍼治療の効果をリアルタイムで動的に評価するための pCLE の有用性を実証します。尾静脈を介してフルオレセインナトリウムを静脈内投与した後、局所毛細血管内の赤血球速度の変化とコラーゲン線維配列の再編成を観察することによって変化を評価しました。

鍼治療後5分の代表的な結果は、赤血球の動きの加速(P < 0.05、t検定)(図2A)とコラーゲンの規則正しい束状構造への再配置(図2B、C)を明らかにしました。鍼治療による局所血行動態の加速と間質性浸透圧シフトにより、線維束の分離が引き起こされ、イメージングで明るくなった領域が増加し、線維間空間が広がるとして現れました。また、鍼治療後の毛細血管透過性の高まりが局所的なフルオレセイン漏出に寄与す.......

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ディスカッション

結果で実証されているように、この研究で確立された in vivo 共焦点イメージング プロトコルにより、標準的な市販の機器と日常的な蛍光標識を使用して、鍼治療介入中の微小循環および細胞外マトリックス動態の同時定量分析が可能になります。このプロトコルの成功は、フルオレセインナトリウム注射の正確なタイミング、持続的な微小血管造影の確保14、および縦方向のコラーゲン線維追跡に不可欠な厳密な動物固定化という 2 つの重要なステップに依存しています。

技術的な課題に対処するために、的を絞った最適化が実装されました:プローブと組織の界面に37°Cの生理食塩水液滴を追加すると、電気鍼治療部位とプローブの間の距離を>3mmに保ちながら、最初の反復で観察された信号損失が排除され、振動アーティファクトが減少しました。これらの改良により、データの再現性が大幅に向上しました。

このプロトコルは0.5μmの分解能でリアル.......

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (2024YFA1209900、2024YFA1209903、2024YFA1209904) の資金提供を受けました。中国国家自然科学基金(82050006)の特別基金。湖北省TCM医学管理局のTCM研究プロジェクト(ZY2025Z015);江漢大学研究費 (2024JCYJ13)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1寸鍼Hwato、蘇州、中国該当なし13 mm / 0.25 mm
10%フルオレセインナトリウムGuangxi Wuzhou Pharmaceutical Co Ltd、中国H45021477
動物麻酔機RWD、深セン、中国R620IEの
体温モニターRWD、深セン、中国69026
電気鍼治療器具Hwato、蘇州、中国SDZ-III型
脱毛クリームVeet, フランス
イメージJ米国国立衛生研究所https://imagej.nih.gov/ij/
生体内プローブ共焦点レーザー内視鏡検査Optiscan, オーストラリアビューnVivoB30直径:4mmのハンドヘルドリジッドプローブ、曲げに強く、長期間にわたって構造的完全性を維持します。長さ: ≥46mm.スキャンモード:ズームスキャン機能。
イソフルランRWD、深セン、中国
R510-22-16
ウレタンSigma-Aldrich, アメリカ94300

参考文献

  1. Mo, Y., et al. Acupuncture as adjunctive treatment for linezolid-induced peripheral neuropathy: a case series report. Front Neurol. 21 (15), 1388544(2024).
  2. Roynard, P., Frank, L., Xie, H., Fowler, M. Acupuncture for small animal neuro....

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再版と許可

タグ

鍼治療のダイナミクス生体内イメージング微小循環の変化コラーゲン線維の配列細胞外マトリックス血管拡張反応定量的形態学