方法論記事

顕微鏡アプローチのための ショウジョウバエ の間接飛行筋の解剖

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DOI：

10.3791/69185

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2025年11月7日

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1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

この記事について

サマリー

ショウジョウバエは、筋形成の基本的なメカニズムを理解するための強力なモデルです。胸部半切片の解剖と調製のためのこのプロトコルは、蛹と成虫の両方の段階からの間接飛行筋の顕微鏡分析を可能にします。このプロトコルは、細胞形態、タンパク質局在化、筋肉構造、および筋形成の他の複数の側面の共焦点イメージングを可能にします。

要約

ショ ウジョウバエ の間接飛行筋 (IFM) は、筋形成の基本原理を探るための強力な遺伝モデルです。収縮メカニズムと多くのサルコメア成分は、ハエから脊椎動物まで保存されており、転写調節やRNAプロセシングから、筋肉の発達を指示および微調整する代謝やメカノバイオロジーに至るまでの細胞プロセスの研究を可能にします。これらの細胞経路の多くはヒトのミオパチーで変化しており、IFM 研究は筋肉疾患の分子病因に関する関連する洞察を提供します。特に、ハエは、筋芽細胞の仕様から筋原線維の形成、成熟、維持に至るまで、IFM筋形成の全プロセスにわたって筋線維とサルコメアの形態と機能を分析するための顕微鏡検査に適しています。ここでは、顕微鏡アプローチのための蛹および成体の時点でのD .メラノガスターIFM の解剖のためのプロトコルが提示されます。図解されたプロトコルは、後期蛹および成体の IFM の半胸郭清、および初期蛹 IFM のオープンブック解剖のために提供されています。固定、染色、サンプルの取り付け手順と一般的な解剖アーティファクトについて説明し、IFM解剖とさまざまな固定試薬との適合性を示す代表的なデータが記載されています。これらのプロトコルは、蛹形成 (APF) の 26 時間後、72 時間の APF、および成人の IFM における RNA 結合タンパク質生存運動ニューロン (Smn) の低形 SmnE33 対立遺伝子の研究に適用され、脊髄運動萎縮症 (SMA) モデルへの新しい洞察を提供し、このプロトコルの一般的な有用性を示しています。この詳細なプロトコルにより、IFM モデル システムへのアクセスと、筋形成の原理を調査するための高品質の顕微鏡データの取得が容易になります。

概要

動物には、歩行を可能にすることから、発話を促進すること、道具を握ることまで、さまざまな動きを制御する何百もの筋肉があります。このような幅広い機能をサポートするために、筋肉はサイズ、付着、収縮能力、代謝、遺伝子発現が異なります1。筋肉生物学の分野における主な焦点は、これらの構造的および機能的差異が発達中にどのように発生し、筋肉疾患でどのように変化するかを理解することです2。筋肉の収縮は、M ライン3 に固定された双極ミオシン含有太いフィラメントと交差する Z ディスクに固定されたアクチン含有細いフィラメントで構築されたサルコメアによって促進されます。サルコメアは端から端まで筋原線維に組織化されており、横紋筋のこの規則的な配置は、顕微鏡下で交互の明暗帯として現れ4、サルコメアの組み立てと組織の変化を監視するための実用的な視覚的方法を提供します。顕微鏡検査は、遺伝学および生化学的アプローチと組み合わせて、転写調節、RNAプロセシング、代謝、機械形質導入5,6,7などの細胞プロセスに関する重要な洞察を提供し、筋肉の発達と機能を指示および微調整しています。これらの細胞プロセスの多くは、ヒトのミオパチーや神経筋障害で破壊されており8,9、筋肉疾患の病因についての洞察を得るために筋肉の発達を理解することの重要性を強調しています。遺伝子工学の進歩により、個々の細胞の操作とタンパク質の内因性標識10,11が可能になり、画像取得と解像度12,13の技術的進歩が相まって、筋肉研究における顕微鏡の継続的な重要性が保証されています。したがって、筋肉の解剖とサンプル調製のための明確で簡単に実装できるプロトコルを備えたモデルシステムは、筋肉分野で価値があります。

D. melanogaster の間接飛行筋 (IFM) は、筋形成の基本原理を研究するための強力で十分に特徴付けられたモデルです8。IFMは、幼虫の筋肉テンプレート上に形成される半胸部あたり6つの背側縦筋(DLM)と、蛹の発育中にde novoで構築される7つの背腹筋線維(DVM)で構成されています14。正中線付近でアクセスできるため、多くのIFM研究は、胸部15の長さ全体にまたがる成虫のハエの最大の筋肉であるDLMに焦点を当てています。蛹化の開始時に、IFM筋芽細胞は翼ディスクヒンジのニッチから胸部に移動し、そこで融合して合胞体筋管を形成します16。27°Cで約24時間APFに腱が付着した後、IFM筋線維は細胞質と細胞骨格を徐々に組織化し、コンパクトになり、30〜32時間APFで筋原線維形成を開始します17。新しいサルコメアが筋原線維に追加され、筋線維が成長して胸部を埋めるまで約 48 時間 APF になります。次に、IFMは、転写とスプライシングの両方の変化と一致する成熟プロセスを経て、成体の代謝特性と収縮特性の獲得、およびストレッチ活性化を促進します18。成虫のハエは、27°Cで90時間から100時間のAPF、および25°Cで約100時間のAPF(メスは約98時間APF、オスは約102時間APF)で蛹ケースから閉じます19。IFMは、汎用性が高く、関連性の高いモデルシステムです。それらは筋形成のすべての段階で監視することができ、形態学的および機能的にハエの他の筋線維タイプとは異なり、アクセス可能な遺伝的ツールと操作アプローチの幅広い品揃えの恩恵を受けます8,20。収縮メカニズム、基本的なサルコメアの形態、および多くの構造成分は、ハエから脊椎動物5まで保存されており、ハエからヒトへの筋原性原理の翻訳を可能にします。実際、筋強直性ジストロフィー、脊髄運動萎縮症(SMA)、筋原線維ミオパチー、放線症などの神経筋疾患のハエモデルは、病因学的および治療的洞察を提供してきました21,22。特に、ハエは、筋芽細胞の仕様から筋原線維形成、サルコメアの成熟と維持に至るまで、筋形成全体にわたる筋線維とサルコメアの形態を分析するための顕微鏡検査に適しています。

ショウジョウバエIFMは、40年以上にわたって顕微鏡用途に使用されており、筋肉の成長と発達の理解に大きく貢献しています8。この間、IFM解剖プロトコルは技術の進歩に伴い継続的に適応され、一部の人にとって最適で、他のイメージング技術には最適ではないさまざまなレベルの詳細で提示される幅広いプロトコルにつながっています。たとえば、電子顕微鏡用に開発されたプロトコルには、強力な固定条件、極薄切片、および重金属3,23,24,25による造影剤染色が含まれますが、光学顕微鏡には最適ではありません。生化学的アッセイまたは分子分析で使用するために胸部からIFMを迅速に解剖するために開発されたプロトコル26,27は、組織のコンテキストを失い、筋原線維構造を破壊する可能性があるため、顕微鏡アプローチには最適ではありません。解剖アプローチは、幼虫の筋肉または成虫の腹筋の分析のために開発されましたが20,28、しかし、無傷のIFMの分離には最適ではありません。ライブイメージングアプローチは、イメージングプロセス29,30中にIFM組織を生かし続けるために、低侵襲解剖または特殊な培地のいずれかを必要とし、免疫組織化学のために筋肉を温存するために必要な固定ステップを伴わない。IFM組織のパラフィン包埋または凍結切片には複数のプロトコルが存在し、組織化学または抗体染色27,31,32と互換性がありますが、これらのアプローチは通常、筋肉の超微細構造を変化させ、一次抗体による特定の抗原の認識を制限する可能性のある凍結および組織脱水を伴います。IFMを直接固定するプロトコルは、筋肉の形態を維持し、抗原コンフォメーションの変化を制限し、多くの免疫組織化学実験に望ましい24。しかしながら、これらのプロトコルは、特定のアプリケーション、例えば、蛍光、クライオ電子顕微鏡、または超解像顕微鏡による単一筋原線維分析を可能にするIFMを解離するプロトコルにも対象としている20,33,34。他の例としては、胸部32,35から無傷のIFM線維を解剖するプロトコル、または無傷の文脈で筋線維とサルコメアの両方の分析を可能にする全マウントまたは半胸郭製剤20,32,36を生成するプロトコルが挙げられる。新規ユーザーにとって、多数の既存のプロトコルを整理するのは難しい場合がありますが、その大部分はテキストベースです。研修生と学部生の研究者は、標準的な免疫組織化学アプリケーションに適用される詳細なIFM解剖プロトコルの恩恵を受けるでしょう。

この記事には、免疫組織化学顕微鏡アプローチのための蛹および成虫期の D. melanogaster IFM の解剖と調製のための一連のプロトコルが含まれています。このアプローチは、IFM筋形成全体を通じてRNA結合タンパク質Bruno137およびRbfox138の発生機能を追跡する最近の出版物で使用されています。このプロトコルには、胸部が正中線に沿って二等分され、筋線維構造が損なわれないようにする成虫および後期蛹(48時間から96時間APF)IFMのIFM半胸郭清を通じて潜在的なユーザーをガイドするための詳細なイラストとステップバイステップの画像が含まれています。さらに、このプロトコルは、胸部の腹側部分を本を開くようにスリットして持ち上げて、背側表皮に付着した無傷のIFMを露出させる初期の蛹(8時間から48時間のAPF)段階の開いた本の解剖を対象としています。プロトコルのさらなるステップには、固定、染色、およびサンプルのマウントが含まれており、代表的なデータは、このアプローチが免疫組織化学および蛍光顕微鏡用の組織を準備するための多様な固定方法と互換性があることを示しています。新しいユーザーが一般的な解剖アーティファクトを特定するのに役立つ代表的な例が提供されています。このプロトコルは、脊髄運動萎縮症(SMA)21,39のハエモデルとして使用される生存運動ニューロン(Smn)の低形対立遺伝子であるSmnE33の発生IFM表現型を、26時間APF、72時間APF、および成人IFMで分析するために適用されます。ここで提示されたデータは、Smn の筋肉特異的機能についての洞察を提供し、筋肉の発達と筋肉疾患の病因を研究するためのこの解剖プロトコルの適用可能性を強調しています。

プロトコル

倫理的声明:
このプロトコルのすべての実験は、全代謝昆虫である ショウジョウバエ melanogasterを使用します。無脊椎動物はアメリカ合衆国の動物福祉規制の対象ではなく、その使用には倫理的承認を必要としません。すべての作業は、標準的な施設のバイオセーフティおよび実験室の安全ガイドラインに基づいて実施され、プロトコル番号 21940 (22-11) に基づいてミズーリ大学カンザスシティの施設バイオセーフティ委員会によって承認されました。

1.成人IFMの半胸郭清(図1)

  1. 生物学の先端を備えた2つのDumont#5鉗子、Dumont#3鉗子、Vannasスプリングハサミ、プラスチックピペット、ペイントブラシ、24ウェルプレート、糸くずの出ないワイプ、顕微鏡スライド、クライオスタットブレードなど、必要な消耗品を組み立てます( 材料 表を参照)。1x PBS、0.05%PBS-T、および固定溶液を調製します( 補足ファイル1を参照)。次の成人半胸郭清のフロー図の概要が利用可能です(補足図1)。
  2. 目的の遺伝子型と年齢の成虫を収集します(たとえば、新しく閉鎖された成人、1日の成体、または5日の成体)。CO2 または氷の上のサンプルハエを麻酔します。
    注:このプロトコルで使用されたハエは、温度と湿度が制御されたインキュベーターで12時間の日:12時間の夜サイクルで成長しました。 ショウジョウバエ は25°Cまたは27°Cで栽培するのが標準で、18°Cで栽培できるため、成長サイクルが10日から約20日まで延長されます。
  3. プラスチックピペットを使用して、実体解剖顕微鏡下の顕微鏡スライドに1x PBS40 を一滴移します。
  4. サンプルハエを、ペイントブラシまたは鉗子を使用して、小さなグループでPBSドロップに移します(図1A)。Vannasスプリングハサミを使用して、頭(図1B)、翼(図1C-D)、腹部(図1E)を取り除きます。脚を取り付けたままにします(図1F)。
  5. ブラシまたは鉗子を使用して、24ウェルプレートの1つのウェルで500 μLの固定溶液に胸部をそっと移します。章動器/ロッキングシェーカーに希望の時間(通常15〜60分)固定します。
    注:このプロトコルは、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノール、グリオキサール溶液などを含む複数の固定バッファーと互換性があります。固定条件の最適化の詳細については、代表的な結果と 補足ファイル1 を参照してください。固定剤は、施設の危険化学物質ガイドラインに従って、手袋と適切な個人用保護具 (PPE) を使用して取り扱う必要があります。
  6. 200 μLピペットで固定液を除去し、1 mLの0.05%PBS-Tを章動器/ロッキングシェーカーで室温で5分間洗浄します。
    注: 固定剤は、施設の危険化学物質ガイドラインに従って廃棄してください。ほとんどの抗原では、固定胸部を1 mLの0.05%PBS-Tに4°Cで最大2週間保存してから、切断および染色することができます。洗剤中での長時間のインキュベーションはサルコメアの構造を劣化させる可能性があるため、高濃度のTriton X-100は使用前にテストする必要があります。
  7. 200 μLピペットでバッファーを除去し、ブラシまたは鉗子を使用して胸腔を実体解剖顕微鏡下の顕微鏡スライド上の0.05%PBS-Tの滴に移します。
  8. 盾片を上に向けて胸部の向きを向け、一対のDumont#3鉗子の間で安定させます(図1G-H)。
  9. クライオスタットブレードを胸部を横切って切り欠き(図1H、J、L)、正中線に沿って1回の滑らかな下向きのストロークで切り落とし(図1I、J、L-N)、IFMを露出させる胸部半切片を生成します(図1K)。
    注:サルコメア構造を損傷するアーティファクトの伸びを避けるために、IFMを切断する前にキューティクルに「切り欠き」またはひびが入っていることが重要です。この動きはIFMを機械的に損傷し、筋原線維が擦り切れるため、ブレードを前後に「鋸で」切らないでください。バッファーが多すぎると、鉗子間の胸部が不安定になり、切断がより困難になります。別のアプローチには、切断を容易にするために両面テープで胸部を一度に 1 つずつ安定させることや、胸部の腹側から切断することが含まれます。
  10. 胸部の2つの半分をスライド上の位置に移動し、乾燥を避けるために緩衝材で覆われたままになりますが、将来の切断の邪魔にはなりません。すべての胸部が切断されるまで、手順1.8〜1.10を繰り返します。
  11. 鉗子を使用して、胸部半切片を顕微鏡スライドから24ウェルプレートの1ウェルで500 μLの0.05%PBS-Tに移し、ブロッキングと免疫染色を続行します(以下のセクション4を参照)。

2.後期蛹IFMの半胸郭離(~48時間から96時間APF)(図2、 図3)

  1. 目的の遺伝子型の蛹を蛹の発達の選択されたポイントまでの年齢を段階的にします(図2)。湿らせた絵筆を使用してオスまたはメスの白いプレ蛹(図2A、B)を収集し、60 mmの細胞培養皿で濡れたろ紙上でインキュベートします。蛹の病期分類と蛹ケースからの除去は、以前に説明されています20,26。
    注:蛹は、年齢を重ねるにつれて、頭の外転や蛹のケース、目、剛毛の色素沈着など、複数の形態学的変化を起こします19,41(図2C)。これらの形態学的特徴は、蛹の年齢を特定し(図2D-E)、正常に発達しない蛹を特定するための大まかなガイドとして使用できます(図2F)。ただし、正確な病期分類のタイムラインを確保するために、30分ごとまたは2時間ごとなど、狭い時間枠で白い蛹前を収集することをお勧めします。24時間から35時間のAPFに発生する細胞骨格構造と筋線維の長さの主要な変化を区別し、35時間、48時間、60時間、72時間、80時間、および90時間APF18,42でサルコメア構造の違いを区別するには、厳密に段階的な時間点が必要です。
  2. ペイントブラシ、生物学の先端付きのデュモン#5鉗子2本、ヴァンナススプリングハサミ、両面テープ、顕微鏡スライド、プラスチックピペット、24ウェルプレート、キムワイプ、クライオスタットブレードなど、必要な消耗品を組み立てます( 材料表を参照)。1x PBS、0.05%PBS-T、および固定溶液を調製します( 補足ファイル1を参照)。次の蛹半胸郭清のフロー図の概要が利用可能です(補足図2)。
  3. 目的の時点で、絵筆を使用して、蛹をろ紙から、実体解剖顕微鏡の下で顕微鏡スライドに貼り付けられた両面テープのストリップに10〜20倍の倍率で移します(図3A、B)。テープ上の蛹を同じ方向に向けて、腹側を下にして並べます。
  4. #5鉗子のペアを使用して、最初の蛹の蛹ケースの前面を開き、鰓蓋(頭の上の領域)をそっと取り除きます(図3C、D、I)。
  5. #5鉗子を慎重に使用して、蛹ケースに沿って翼のすぐ背側にスリットし、蛹ケースを1〜2mm刻みで蛹から剥がします。蛹ケースを両面テープに貼り付け、前方から後方に作業します(図3E-G 、I)。蛹自体を突くのを避け、蛹ケースと蛹を囲む基底膜/蛹嚢の間に鉗子の先端を挿入します。
  6. ケースを取り外した後、鉗子をすくい上げる動作を使用して下を持ち上げ(図3H、I)、蛹をケースから2番目の顕微鏡スライド(図3J、K)上の1x PBSの滴にそっと移して脱水症状を防ぎます。すべての蛹が蛹ケースから取り除かれるまで、手順2.4〜2.6(図3I)を繰り返します。
  7. Vannasスプリングハサミを使用して、解剖された蛹から腹部を取り除きます(図3L)。
    注:次のステップでは、固定剤による浸透性を高めるために腹部を除去します。胸部の損傷を避けるために、腹部を直接切断し、腹部の最大30%を胸部に付着させます。
  8. ブラシまたは鉗子を使用して、胸部(図3M)で蛹の頭を24ウェルプレートの1つのウェル内の500 μLの固定溶液にそっと移します。所望の時間(通常は15〜60分)固定し、ステップ1.5〜1.6で説明するように、1 mLの0.05%PBS-Tで洗浄します。
  9. 200 μLピペットでバッファーを除去し、ブラシまたは鉗子を使用して胸部を10倍の倍率でステレオ解剖顕微鏡下の顕微鏡スライド上の0.05%PBS-T滴に移します。
  10. 1つのサンプルを残りのサンプルから分離し、腹側を下にして向きを変え、一対のDumont#3鉗子の間で安定させます(図3N)。
  11. 基底膜とキューティクルが切り裂かれるまでクライオスタットブレードを胸部を横切ってスライドさせ、正中線に沿って1回の滑らかな下向きのストロークで切り落とし(図3O)、IFMを露出させる胸部半切片を生成します(図3P)。
    注意: この動きはIFMを機械的に損傷させ、筋原線維が擦り切れるため、ブレードを前後に「鋸で」切らないでください。バッファーが多すぎると、鉗子間の胸部が不安定になり、切断がより困難になります。蛹の胸は、頭を取り付けて左または右に向けた状態で切断できます。
  12. 胸部の2つの半分をスライド上の位置に移動し、乾燥を避けるために緩衝材で覆われたままになりますが、将来の切断の邪魔にはなりません。すべての胸部が切断されるまで、手順2.10〜2.12を繰り返します。
  13. 鉗子を使用して、胸部半切片を顕微鏡スライドから24ウェルプレートの1つのウェルで500 μLの0.05%PBS-Tに移し、ブロッキングと免疫染色を続行します(以下のステップ4を参照)。

3.初期の蛹IFMのオープンブック解剖(~15時間〜48時間APF)(図4)

  1. 上記のように、目的の遺伝子型と年齢の蛹を蛹の発達の選択されたポイント(図2)に段階化します(ステップ2.1)。
    注:オープンブック解剖の場合、蛹は8〜10匹以下のハエのグループで解剖する必要があります。
  2. ペイントブラシ、生物学の先端が付いた2つのDumont#5鉗子、Vannasスプリングハサミ、両面テープ、顕微鏡スライド、プラスチックピペット、黒いシリコン解剖皿、黒いガラス染色皿、防虫ピン、糸くずの出ないワイプなど、必要な消耗品を組み立てます( 材料表を参照)。1x PBS、0.05%PBS-T、および固定溶液を調製します( 補足ファイル1を参照)。次の蛹のオープンブック解剖のフロー図の概要が利用可能です(補足図3)。
  3. 目的の時点で、手順2.3〜2.6で説明したように、蛹ケースから蛹を取り除きます。蛹ケースから取り出した後、1x PBSで満たされた黒いシリコン解剖皿に蛹を移します(図4A)。
  4. すべての蛹が蛹ケースから解放されたら、Dumont #5鉗子を使用して表面張力を克服し、解剖された蛹をシリコンの表面までそっと押し下げます。蛹を皿の中心近くに一列に並べます(図4B)。
  5. Dumont#5鉗子を使用して、各蛹の腹部に2本の昆虫針を挿入し、所定の位置に保持します(図4C、D)。蛹が腹側を上にして向きを変えていることを確認してください。
  6. Vannasスプリングハサミを使用して、各蛹の基底膜と前頭領域を切り開きます(図4E)。
  7. はさみを開口部に挿入し、各蛹の左右に沿って切ります(図4F、G、Q)。はさみを配置し、発達中のノタムのすぐ下を胸部と腹部の接合部まで切り戻し、腹側部分で脚と翼を取り除きます。はさみが水平に挿入され、胸部の背側部分に接触しないようにしてください(図4Q)。
  8. Dumont#5鉗子を使用して、蛹の腹側部分をつかんで持ち上げ、Vannasスプリングハサミで取り除きます(図4H、I、Q)。
  9. Dumont#5鉗子を使用して、脳、腹側神経索(VNC)、気管、および腸を取り除きます(図4J、K、Q)。気管の真下にある発生中のIFMと、胸部の背側部分の表皮に付着したVNCを乱さないように注意してください。
  10. 200 μLのピペットチップの先端をクリップして、より広い開口部を作成します。チップをクリップした200 μLピペットを使用して、胸部上で1x PBSバッファーを穏やかに洗浄し、残りの脂肪体のほとんどを除去してIFMを露出させます(図4L、M)。筋線維と表皮をつなぐ腱の付着部が裂けないように優しくしてください。
  11. Vannasスプリングハサミを使用して背側胸部の正中線を切り取り、IFMを含む2つの「リーフレット」を作成します(図4N)。
  12. はさみを使用して背側胸部のリーフレットを腹部から切り離し(図4O、Q)、Dumont#5鉗子を使用して、リーフレットを黒いガラス皿内の300 μLの固定液に移します(図4P)。IFM筋線維や腱の損傷を避けるために、鉗子でヘッドケースのリーフレットをつかみます。
  13. 希望の時間(通常は15分)固定します。200 μLピペットを使用して固定液を慎重に除去し、500 μLの0.05%PBS-Tで洗浄します。ブロッキングと免疫染色を続行します(以下のステップ4を参照)。
    注意: 黒いガラス皿にサンプルを章動させたり、揺らしたりしないでください。蛹の初期段階での筋肉と腱の付着は非常に壊れやすく、絶え間ない緩衝液の攪拌で引き裂かれ、IFMが失われます。溶液を交換するときにサンプルがピペットチップに吸い込まれないように、ディッシュ内のバッファーの端の周りをゆっくりと慎重にピペットで移動させます。

4. 固定IFMサンプルの免疫染色と組織化学

  1. ピペット、ピペットチップ、必要な抗体や染色剤など、必要な消耗品を組み立てます。0.05%PBS-T、ブロッキング溶液、および抗体/染色剤混合物を調製します( 補足ファイル1を参照)。
  2. 洗浄液(0.05%PBS-T)をサンプルからピペットで取り除き、ブロッキング溶液を加えます。サンプルをブロッキング溶液中で室温で少なくとも30分間インキュベートします(ステップ1〜2はロッキングあり、ステップ3はロッキングせずに)。
    注:サンプルは、4°Cで一晩ブロックすることもできます。 このプロトコルでは、サンプルを0.05%PBS-T中の5%正常ヤギ血清(NGS)でブロックしました。ソリューション オプションのブロックの詳細については、 補足ファイル 1 を参照してください。
  3. ピペットを使用して胸部からブロッキング溶液を取り除きます。一次抗体混合物を加え、室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします(ステップ1〜2はロッキングあり、ステップ3はロッキングせずにインキュベートします)。
    注:このプロトコルは、一次抗体の大部分と互換性があります。抗体はブロッキング溶液で希釈する必要があります。このプロトコルでテストされた一次抗体希釈は、1:10から1:2000の範囲で、個々の抗体ごとに実験的に決定されます。一次抗体染色の最適化の詳細については、 補足ファイル1に記載されています。
  4. ピペットを使用して一次抗体混合物を除去し、サンプルを0.05%PBS-Tでそれぞれ10分間3回洗浄します。
  5. 二次抗体または染色混合物をサンプルに加えます。漂白を最小限に抑えるために、サンプルをアルミホイルで覆います。室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします(ステップ1〜2はロッキングし、ステップ3はロッキングせずに)。
    注:ほとんどの二次抗体および蛍光細胞染色剤は、このプロトコルで使用できます。多くの二次抗体は、1:500の希釈で使用されます。以下の代表的なデータ(代表的な結果を参照)では、核をDAPI(1 mg / mLストック、0.05%PBS-Tで1:1000に希釈)およびローダミンファロイジンでF-アクチン(300単位/ mLストック、0.05%PBS-Tで1:500に希釈)で標識しました。
  6. ピペットを使用して二次/染色混合物を取り除き、室温で0.05%PBS-Tでサンプルをそれぞれ10分間4回洗浄します。洗浄後すぐに取り付け(手順5)に進みます。

5. 顕微鏡分析のために染色したサンプルをスライドに取り付ける(図5)

  1. ペイントブラシ、鉗子、つや消し顕微鏡スライド、カバーガラス(#1厚さ)、透明なマニキュア、封入剤、糸くずの出ないワイプなど、必要な消耗品を組み立てます( 材料 表を参照)。
  2. 顕微鏡スライドのつや消し書き込み領域に、関連するサンプル番号または希望する識別情報(日付、遺伝子型、抗体、スライド番号など)をラベル付けします。
  3. カバーガラススペーサー(#1カバーガラス)を追加し、サンプル配置用にカバーガラスの間に約1cmを残します(図5A-C)。スペーサーを所定の位置に保持するために、50%グリセロールの少量の使用を使用します(図5A、D)。
    注:スペーサーは、厚いサンプルを取り付ける際のサンプルの歪みを防ぎます。成人の胸部には通常、2 つのカバーガラスの厚さのスペーサー、48 時間の APF 胸部には 1 つのカバーガラスの厚さのスペーサーが必要であり、オープンブックのリーフレットにはスペーサーがありません。
  4. カバーガラススペーサーの間のウェルに、または初期の蛹サンプルをマウントする場合は顕微鏡スライドの中心に、封入剤を一滴加えます(図5C-D)。スライドを実体解剖顕微鏡の下に置きます。
    メモ: 複数の種類の取り付け用紙を使用できます。自己硬化性メディアを使用する場合は、メディアが硬化する前にサンプルの向きを適切に調整するのに十分な時間を確保するために、硬化時間が数時間のメディアを検討してください。封入剤はサルコメアの寸法に影響を与えることが示されているため、実験のすべてのサンプルに同じ試薬を使用する必要があります。
  5. ピペットを使用して、サンプルからできるだけ多くの洗浄バッファーを除去します。鉗子または絵筆を使用して、スライド上の封入剤の滴にサンプルをすぐに移します(図5E)。
  6. Dumont #5鉗子を使用して、サンプルを行と列に整理し、サンプルが重なり合っていないことを確認し、IFMを上に向けて胸部の向きを合わせます(図5F、J、Q、S)。向きには、剛毛/キューティクルが上を向いているサンプルを慎重にひっくり返す必要がある場合があります(図5G、H、K、L、R)。IFMに触れるとサルコメア構造が損傷しますので注意してください(代表的な結果を参照)。
  7. 胸部サンプルの上に#1カバーガラス(18 x 18 mmまたは22 x 22 mm)を慎重に追加します(図5M)。スペーサーを使用する場合は、サンプルの両側のスペーサーに接触するまでカバーガラスをそっと押します(図5N)。
  8. ピペットチップまたはスポイトを使用して、すべての胸部が包まれるまで、サンプル領域を封入剤で埋め戻します(図5O)。画像取得を妨げる気泡を作らないようにしてください。
  9. 透明なマニキュアを使用してウェットマウントを密閉します。サンプルカバーガラスとスペーサーカバーガラスの両方の周囲を密閉することを忘れないでください(図5P、S)。
    注意: トップコートや速乾性のマニキュアは密閉性が悪く、封着剤が蒸発する際に気泡が発生するため、使用は避けてください。
  10. スライドを室温で10分間乾燥させます。スライドケースに入れて4°Cで保存してください。 スライドは数日または数週間にわたって画像化できます。
  11. 実験計画に従って、蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはその他のシステムでサンプルを画像化します。取得および画像解析のためのプロトコルは、他の場所で利用可能です14,30,46,47,48。

結果

上記の解剖プロトコルは、オープンブック法(ステップ3)を使用した蛹形成(APF)の8時間後から、半胸郭解アプローチを使用した成人段階(ステップ1および2)まで、IFM筋線維およびサルコメア形態の顕微鏡分析のための高品質のサンプルを生成するために使用できます。これらの解剖は、筋肉とサルコメアの形成 18,42,49、転写因子機能 50,51、および RNA 調節37,38 などの調査に適用されています。以下に示す代表的な結果は、このプロトコルとさまざまな固定方法との互換性を実証し、一般的な解剖アーティファクトを詳述し、SmnE33変異体表現型を使用して、IFMモデルにおける形態学的および細胞生物学的問題に対処するためのこのプロトコルの有用性を示しています。

IFM解剖は複数の固定方法と互換性があります

組織化学または免疫蛍光サンプルのサンプル調製の重要な側面は、固定による細胞構造の正確な保存です。固定剤は、架橋によって分解を防ぎ、タンパク質と脂質の構造を安定化することにより、組織の構造と形態を維持します52,53。固定剤の異なるクラス、例えば、アルデヒドベースと有機溶媒は、異なる浸透効率と架橋効率を有し、異なる官能基を標的とすることにより抗体標的認識に異なる影響を与える53,54。IFM解剖は、4%パラホルムアルデヒド(PFA)、9%グリオキサール、メタノール固定(図6)を含む複数の固定方法と互換性があり、この解剖プロトコルの一般的な有用性を強調しています。

サルコメアのサイズと形態をさまざまな固定方法の適用と比較するために、1 日の成体 w 1118 ハエの半胸郭清が行われました。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(図6A、E)または弛緩溶液(RS)(図6B、F)のいずれかでの4%PFA固定を比較した。弛緩液にはATPが含まれており、サルコメアを弛緩状態で維持するためにサルコメアの寸法を定量化するときに使用することをお勧めします20,55(補足ファイル1を参照)。4%PFA固定はサルコメアの形態を効果的に維持しますが、PBSとRSの4%PFA固定との間でサルコメア幅に有意差が見られました(図6I、J)。メタノールでの固定は筋線維とサルコメアの構造を保存しましたが(図6C、G)、サルコメアは4%PFA固定よりも有意に短く、薄かった(図6I、J)。IFMは、一晩の9%グリオキサール固定(図6D、H)(3%グリオキサール固定は効果がなかった)で効果的に保存でき、4%PFA固定と比較してサルコメア幅も有意に変化しました(図6I、J)。結論として、IFM ヘミソレースは複数の固定剤で効果的に保存できます。ただし、固定剤と緩衝液の両方がサルコメア寸法の測定に影響を与える可能性があるため、実験は適切なコントロールと明確に定義された一貫した固定プロトコルを使用して設計する必要があります。

IFMにおける一般的な解剖および固定アーティファクト

顕微鏡検査の課題の 1 つは、特に新規ユーザーや研修生にとって、技術的アーティファクトと骨の表現型を区別することです。ショウジョウバエIFMにおけるこの区別を支援するために、最も一般的に観察されるアーティファクトと解剖の失敗の代表的なデータが提示されています(図6)。固定プロトコルでは、固定の過少または過剰を回避するために、固定の種類、濃度、および長さを最適化する必要があります52,53,54。弛緩溶液中の4%PFAでインキュベートしたw1118 1日成人半胸郭清の固定時間経過を使用して、15分または30分の固定時間はサルコメアの形態を正確に維持する一方で、7分間の固定は一貫性のないサルコメアの形態を生成することが観察されました(図6K-M)。さらに、組織の剛性が低く、固定時間が短いため、IFMを損傷することなく胸部を切断して二等分することがより困難になります。カットと取り付けの両方のプロセス中に追加のアーティファクトが発生する可能性があります。IFM筋線維構造は、ブレードが鈍く破れたりほつれたりする場合(図6N)、ブレードが滑ったり、切り傷が角度が付けられたりした場合(図6O)、不規則に見えることがあります。鉗子が取り扱いまたは取り付け中に固定IFMに直接接触すると、ディボットや伸びにつながる印象を与え、サルコメアを引き離す可能性があります(図6P)。切断、取り扱い、または取り付け中に胸部が伸びたり変形したりすると、サルコメアも引き離され、明確に境界が切られたZディスクが失われます(図6Q)。最後に、鉗子またはブレードでIFMを「鋸で切る」または「こする」と、特に筋線維の表面で、筋原線維の摩耗とほつれ、ほつれ、および混乱につながります(図6R)。潜在的なユーザーは、これらの技術的アーティファクトに精通し、表現型分析から除外する必要があります。

IFMにおけるSmn E33表現型の発生進行

オープンブックおよび半胸郭解は、筋肉表現型の発生軌道を追跡し、発生中に目的の遺伝子がいつ作用するか、筋原線維表現型がいつ発生するかを特定するのに特に役立ちます。RNA結合タンパク質生存運動ニューロン(Smn)39の低形対立遺伝子であるSmnE33のIFM発生表現型は、オープンブックおよび半胸郭清の幅広い有用性を示す代表的なデータとして提示されています。

スプライセオソームを形成する小さな核リボ核タンパク質(snRNP)、スプライシング反応を触媒してmRNAを生成する高分子複合体7は、SMN複合体によって組み立てられます。生存運動ニューロン (Smn) とジェミンタンパク質からなる SMN 複合体は、すべての生物の生存率に必要です56。ヒトのSMNレベルの低下は、重度の遺伝性神経筋障害である脊髄運動萎縮症(SMA)21につながります。ショウジョウバエは、低形対立遺伝子 SmnE33 の発生を含む、SMA の病因と Smn の細胞機能を理解するためのモデルとして使用されています。SmnE33 ハエは生存可能で繁殖力がありますが、飛んだりジャンプしたりすることはできません39。SmnE33ハエは運動ニューロンの樹状化欠陥を持っていますが、無秩序なIFM構造と飛行筋特異的アクチン88F発現の喪失も示します39,57。SMNは、ハエおよびマウスのZディスクでα-アクチニンと共局在しており39、Smnが筋肉特異的な機能を持っている可能性があることを示唆しています。

筋原線維構造がいつ失われ、筋肉の発達にSmn機能が必要かをよりよく理解するために、26時間のAPF、72時間のAPF、および1〜5日の成人でのIFMにおける SmnE33表現型の発生経時分析が行われました。72時間のAPFと成人の両方のコントロール w1118 IFMは、強力なファロイジン染色F-アクチンシグナル(図7E、E'、I、I')および規則的なサルコメア構造(図7G、G'、K、K')を有するが、ファロイジンシグナルは劇的に減少し(図7F'、F'、J')、サルコメア構造は存在しない(図7H、H'、L、L') SmnE33 IFM です。代わりに、F-アクチンは、核の周りの網状構造、または細胞質の不規則な束または「スターバースト」構造で観察され(図7H、H'、L、L')、Act88F発現18、 39 の喪失と細いフィラメントを組み立てることができないことと一致しています。26時間APFで SmnE33表現型を調べるためにオープンブック解剖を実施したところ、初期のIFM発生が SmnE33で正常に進行することが明らかになりました。 w1118 コントロールIFM(図7A、A'、C、C')と比較して、 SmnE33ハエは、半胸部あたり6本の背側縦IFM線維を持ち、筋原線維形成の前に筋線維周辺に組織化されたF-アクチンケーブルを形成し (図7B、B')、筋線維全体にメッシュ状のF-アクチンネットワークを示します(図7D、D').これらの結果は、IFM分化の初期段階が正常に進行する一方、SmnはIFM発達の後期段階でAct88F発現を維持し、サルコメアを構築するために必要であることを示しています。重要なことに、これらの代表的な結果は、オープンブックおよび半胸郭清によって達成できる表現型の詳細と解像度を示しています。

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図1:成体IFMの半切片解剖。(A)顕微鏡スライド上の1x PBSに成虫のハエを配置します。(B)鉗子(シアン、ドット)を使用してフライを安定させ、はさみ(オレンジ)で頭を取り除きます。(C-E)左(C)と右(D)の翼、および腹部(E)を取り外します。(F)頭、腹部、翼を捨て、胸部を固定剤に移します。 (G、H)鉗子を使用して向きを安定させる(H)ために、後方(P)と盾片を上向き(G)にして、1x PBS-Tの滴でスライド上の固定胸部を向きます。(I-K)クライオスタットブレードを使用して胸部を半分に切断し(I-J)、2つの胸部半切片(K)を生成します。(L)半切片を生成するための矢状カットの位置を示す、クライオスタットブレードと胸部の図。刃を右にスライドさせて胸部の盾片に切り込みを入れ、滑らかな動きで下に動かして(黄色の矢印)、胸部を切断します(赤い点線)。(M、N)胸部の冠状(M)および横方向(N)の概略図で、主要な筋肉群の位置と切り口の位置(黄色の三角形の間)を示しています。胸部の向きが示されています(L、左;R、右。V、腹側;D、背側;A、前方;P、後部)。スケールバー = 1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:蛹の病期分類と蛹の発達の特徴。(A)オスおよび(B)メスの蛹は、0〜2時間のAPFで白い前蛹として区別できます。オスの蛹は、後方(矢印)に向かって、対の丸い半透明の構造(発達中の精巣)を持っています。(C)蛹の発達の特徴として機能する特徴の表。特徴としては、蛹の成熟、頭の外反、蛹の蛹からの剥離、目の色素沈着の発達、剛毛、翼、脚、エパンドリウム、キューティクルの色素沈着、処女スポット(胎便)の可視性などがあります。目の色と色素沈着は徐々に暗くなります。表の各列の上部にラベル付けされた蛹の発達のタイミングと段階(黒いテキストで示された時点、青いテキストで下の蛹の発達の対応する段階)は、以前にBainbridgeとBownes19,41によって定義されていました。(D-E)赤い目を持つ無傷の蛹における0〜2時間、24時間、48時間、72時間、および96時間APFでの蛹の発達の時間経過(D;Mef2-Gal4、fln-GFP)そして、蛹のケースから解剖されたオレンジ色の目を持つ蛹(E;Fln-Gal4)。48時間から96時間のAPFで目と剛毛が徐々に黒ずむことに注意してください。(F)発生の初期、中期、および後期の時点における蛹の致死性の例。ファレート致死性ハエは完全に形成されていますが、蛹のケースから完全に閉じ込められていません。スケールバー = 1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:蛹IFMの半切片解剖(>48時間APF)。(AH)蛹ケースからの蛹の除去。両面テープ(A、B)のストリップに蛹を貼り付けます。前隆起(C)で開き、Dumont#5鉗子(青、矢印は移動方向、ドットは静止)を使用して鰓蓋(D)を取り除きます。鉗子を使用して、蛹ケースをストリップ(G)に切り開き(E)、剥がします(F)。蛹ケースのストリップは、両面テープに貼り付けられています。腹部を露出させた後、蛹をケース(H)から持ち上げます。(I)蛹のケースから蛹を解剖するプロセスを示す概略図。回路図の各ステップに対応する図パネルにはラベルが付けられています(下)。赤い点線は、蛹を傷つけずに鉗子を挿入して蛹ケースを切り開くことができる場所を示しています。 (J-L)蛹をケースから取り出し(J)、PBS(K)1滴で顕微鏡スライドに移した後、はさみで腹部(L)を取り除きます。(M)腹部を捨て、胸部を固定剤に移します。(N)固定後、蛹の胸を1x PBS-Tの滴でスライドに移します。蛹の背側を上に向け、鉗子で安定させます。(O-P)クライオスタットブレード(O)を使用して、蛹の半切片(P)を切断します。カットの配置は図1 M-Nと同じです。スケールバー = 1 mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:蛹IFMのオープンブック解剖(<48時間APF)。(A)図3A-Iに示すように蛹ケースから蛹を取り除いた後、蛹を黒いシリコン解剖皿内の1x PBSに移します。(B-D) 鉗子(B)を使用して蛹をシリコン皿の表面までそっと押し下げ、2つの昆虫ピン(C、D)を使用して腹側を上に固定します。(E)はさみ(オレンジ色)を使用して、頭の基底膜(bm)とキューティクルを開きます。 (F、G)右(F)と左(G)に沿ってカットします。カットの位置は(Q)に図示されています。(H、I)鉗子(H)で腹側部分を持ち上げ、はさみ(I)で取り外します。(J、K)鉗子を使用して、脳 (J)、外側体幹気管、および腸 (K) を除去します。(L-M)ピペットからの穏やかなバッファーの流れを使用して脂肪体を除去し、IFMを露出させます。(N)胸部を2つのリーフレットに切ります。(O、P)リーフレットを切り取り、固定剤に移します。 (Q)オープンブック解剖の手順を要約した概略図。各ステップに対応する図パネルにはラベルが付けられています(下)。上面図と側面図は、蛹の左側と右側の切り口(赤い点線)の配置を示すために提供されています。翼、脚、およびテング(ラベル付き)は、蛹の背側と腹側を区別するために使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:顕微鏡スライドへのサンプル取り付け。(A-D)カバースリップスペーサーは、厚い胸部半切片サンプルを取り付けるために使用されます。グリセロール(A)は、スペーサー(#1カバーガラス)を標識スライド(B)に貼り付けるために使用され、サンプルはスペーサー(C)の間のスペースの封入剤にマウントされます。後期の蛹と成虫の胸部には、2つの#1カバーガラススペーサー(D)が必要です。蛹の中間の時点には単一の#1カバーガラススペーサーが必要であり、初期の蛹の解剖はスペーサーなしで取り付けることができます。(E-H)成人の半胸郭サンプルは、鉗子または絵筆 (E) を使用して封入剤に移されます。胸部は最初はランダムに配向され(F)、IFMがカバーガラス(H)に向かって上向きになるように鉗子(G)を使用して反転する必要がある場合があります。(I-L)初期の蛹の開いた本の解剖からのリーフレットは、鉗子(I)を使用して取り付けるために移されます。リーフレットはランダムに向き付けられ(J)、鉗子(K)を使用して反転して、IFMがカバーガラス(L)に向かって上を向くようにすることができます。(M-P)サンプルの向きが適切になったら、サンプル(M)の上にカバーガラスを置き、スペーサー(N)にも軽くたたきます。サンプルの周囲に封入剤(O)を充填し、気泡が発生しないように注意してください。カバーガラスとスペーサーのすべての開いた端をマニキュア(P)で密閉し、封入剤の蒸発を防ぎます。(Q-R)IFMがカバーガラスに向かって上を向いた適切に取り付けられた成人胸部サンプル(Q、10倍倍率)の画像(R、20倍倍率)。(S)完成したスライドの概略図で、スペーサーの間にサンプルがIFMアップを配向し、マニキュアがすべての開いた端をシールします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:IFM解剖は、さまざまな固定剤と互換性があります。(AH)筋線維構造(A-D)の共焦点z投影、または対照w 1118成人IFMの筋原線維およびサルコメア構造(E-H)の単一平面画像。片胸郭清は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (A、E) または弛緩液 (RS) (B、F)、メタノール (C、G)、または 9% グリオキサール溶液 (D,H) 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を含む複数の固定方法と互換性があります。DAPI(1:1000)、青。ファロイジン(1:500)染色されたF-アクチン、灰色。(I,J)E-Hからのサルコメアの長さ(I)と幅(J)の定量化。固定方法とバッファーは、サルコメアの長さと幅の測定に大きな影響を与える可能性があります。メタノール固定によるサルコメア長は、3.040 ± 0.2935 μm±測定された長さの3.271 0.2736 μm、3.190 ± 0.2586 μm、および3.217 ± 0.2023 μmよりも有意に短かった(p < 0.001)。サルコメア幅は、テストされたすべての固定方法(PFA(PBS)、1.410±0.1331μm;PFA(RS)、1.284±0.2514μm;メタノール、1.280 ± 0.1538 μm;および 9% グリオキサール固定、1.137 ± 0.2032 μm)。箱ひげ図は、外れ値データポイントが黒い点としてマークされたTukeyひげで示されています。有意性は、事後 Tukey 検定 (**、p < 0.01; ***、p < 0.001) による ANOVA によって決定されました。(K-M)RS固定における4%PFA中の成人w1118の固定時間経過の単一平面共焦点画像は、7分(K)と比較して15(L)または30(M)分の固定時間が、よく保存された一貫したサルコメア構造をもたらすことを示しています。(N,O)筋線維の解剖アーティファクトを示す4%PFAに固定された成体Act88F-Gal4 IFMのZスタック投影一般的なアーティファクトには、鈍い刃 (N) または角度の付いた切断 (O) による筋線維の切断、擦り切れ、または部分的なものが含まれます。(PR)PBSの4%PFAに固定された成人w1118サンプルの単一平面共焦点画像は、サルコメアと筋原線維に共通する解剖アーティファクトを示しています。一般的な技術的アーティファクトには、取り付け中の鉗子との接触によるサルコメアの不規則な伸張 (P)、縦方向の切断中に筋線維を伸ばすことによる Z ディスクのレジスタ外の引き抜き (Q)、および摩耗または鈍い刃による筋原線維の擦り切れ、混乱、またはカール (R) が含まれます。DAPI(1:1000)、青。ファロイジン(1:500)染色されたF-アクチン、灰色。スケールバー = 100 μm (A-D、N-O)、5 μm (E-H、K-M、P-R)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:SmnE33の発生IFM表現型を調査するための解剖の適用。 (A-D)26時間APFにおける初期蛹の筋肉構造対照(A,A',C,C')およびSmnE33(B,B',D,D')における筋線維構造(A,A',B,B')および筋原線維およびサルコメア構造(C,C',D,D')の単一平面共焦点画像。 コントロールと SmnE33 はどちらも、半胸部あたり 6 本の IFM 筋線維を持ち、F-アクチン ケーブルを形成します。(E-H)72時間APFにおける後期蛹の筋肉構造対照(E,E')とSmnE33(F,F')における筋線維構造のZ投影画像SmnE33のIFMはDAPI染色に基づいて存在しますが、強力なF-アクチンシグナルを欠いています。単一平面共焦点画像は、コントロールIFMが高度に組織化されたサルコメア構造(G、G')を持っていることを示しています。対照的に、SmnE33 IFM(H、H')は異常な星のようなF-アクチン構造(黄色の矢印)を持ち、対照IFMで観察される組織化されたサルコメア構造を欠いています。(I-L)制御中の成人の筋肉構造 (I, I', K, K') および SmnE33 (J, J', L, L')。Z投影法(I,J)と単一平面共焦点画像(K,L)は、SmnE33IFMにおけるF-アクチン含有量の大幅な減少と異常なアクチン構造(黄色の矢印)を明らかにします。DAPI(1:1000)、青。ファロイジン(1:500)染色されたF-アクチン、マゼンタまたはグレー。スケールバー = 50 μm (A、B)、10 μm (C、D、G、H、K、L)、100 μm (E、F、I、J)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1: 本文で使用される固定および染色方法、特に 図6 および 図7に示すデータを生成するために使用された詳細な説明。一次抗体の希釈度の決定に関する追加情報が含まれています。このプロトコルで使用されるバッファーコンポーネントとレシピのリストも提供されます。これらのデータは、解剖プロトコルの動機付けとなり、共焦点顕微鏡および発生IFM表現型の分析におけるその有用性を実証します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:成人IFMの半胸郭清のステップのフロー図。 半胸郭IFM切片を準備するための 図1 の手順のテキストの要約。解剖、固定、胸部二切の後、顕微鏡分析のために切片を染色します。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:蛹IFMの半胸郭清のステップのフロー図。 蛹IFMの半胸郭切片を準備するための 図3 の手順のテキスト要約。蛹のケースから取り出した後、蛹を固定し、二等分し、顕微鏡検査のために染色します。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:初期の蛹IFMのオープンブック解剖のステップのフロー図。 48時間のAPFの前に蛹IFMのオープンブック解剖を実行するための 図4 に示す手順のテキスト要約。解剖と固定の後、IFMが取り付けられた上皮リーフレットを顕微鏡検査のために染色します。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、 D.メラノガスター 成虫(図1)および後期蛹(48時間〜96時間APF)(図3)IFMの半胸郭解剖の手順、および初期蛹(8時間〜48時間APF)(図4)の時点でのIFMのオープンブック解剖の手順を示しています。このプロトコルは、免疫組織化学および蛍光顕微鏡アプリケーションに最適です。プロトコルは、解剖手順の概略図と段階的な写真で説明されています。概要図はさらに、 ショウジョウバエ 分野に不慣れな科学者だけでなく、学部生の研究者や初期段階の研修生もプロトコルにアクセスできるようにします。プロトコルユーザーがアーティファクトと 正真正銘 のサルコメア表現型を区別できるようにするために、不十分な固定およびサンプル前処理アーティファクトの代表的な例が含まれています。

IFM 半胸郭清で最も難しいステップは、胸部の二等分です (図 1I、J、L および図 3O)。このステップを習得するには時間と練習が必要です。切断中の安定性を高めるために、個々の胸部を両面テープに貼り付けて36をカットできますが、IFMの乾燥を避けるように注意する必要があります。胸部の腹側から背側を下に向けて切断することも可能なので、新規ユーザーはセットアップでどのアプローチが最も効果的かをテストできます。IFMの損傷を避けるために、新しい鋭利な刃で切断を行い、刃が鈍くなったら交換する必要があります。ミクロトーム(クライオスタット)ブレードは、針、鉗子、またはメスの刃を使用する他のプロトコルと比較して、このプロトコルで胸部をきれいに切断するために使用されます24、32、36。カミソリの刃は、胸部をきれいに二等分するための別の代替手段です。軽く固定された組織は安定して保存されていますが、「ふにゃふにゃ」になり、切断がより困難になる可能性があるため、二分前の固定も重要です。30〜60分の固定時間は、抗原の利用可能性と組織の硬さのバランスをとり、切断を容易にし、経験があれば15分に短縮することができます。

半胸郭製剤の1つの制限は、抗体の浸透です。半胸は厚いサンプル32であり、最高品質の共焦点顕微鏡写真は、IFMの上部10〜20μmから得られます42、 58。洗剤濃度が低すぎたり、透過処理時間が短すぎたりすると、染色が弱くなり、一貫性がなくなる可能性があります。抗体の浸透は、一次抗体でのより長い(2〜3日)インキュベーションによっても改善できます。2光子システムまたは作動距離が長い対物レンズも、イメージング深度59を増やすことができます。実験者がIFM筋線維の全径を画像化する必要がある場合は、矢状面でのミクロトーム24、 58 または凍結切片27 などの代替アプローチを検討する必要があります。

メインプロトコルで取り上げられていない重要な側面は、画像データ解析です。10倍または20倍の画像(図6A-D、図7A、B、E、F、I、J)でのIFM筋線維の分析の場合、標準的な分析には、筋線維が付着しているかどうか、および筋線維の粗大形態が無傷であるかどうかの判断が含まれます37、38。実験に応じて定量化できるパラメータの例には、長さ、幅、数、付着数、または引き裂かれた筋線維の数37、60が含まれます。このプロトコルの主な利点は、蛍光顕微鏡との互換性と、60倍または100倍の高倍率でサルコメアおよび筋原線維の形態を分析できることです(図6E-H、図7C、D、G、H、K、L)。サルコメアの形態は、技術的アーティファクトのないサンプルで分析する必要があります(図6K-P)。考えられる筋原線維およびサルコメアの表現型の多くのカテゴリは、以前に定義されています60。最も一般的には、サルコメアの長さと幅は、画像処理ソフトウェアでZディスクからZディスクへの線を描画して測定することによって、または自由に利用できるいくつかの自動化ツールの1つを交互に使用することによって測定されます18、45、61。サルコメア形態の評価は、Z ディスクまたは M ライン、または太いフィラメントまたは細いフィラメント30、34、58 をラベル付けするマーカーを含めることによって強化できます。これらのデータを使用して、この解剖プロトコルを使用して調製された対照サンプルとテストサンプルの間の筋線維、筋原線維、およびサルコメアの表現型を定量的に記述できます。

プロトコルユーザーは、固定によって筋線維およびサルコメアの形態が維持される一方で、固定剤、緩衝液、および封入剤が組織の収縮または腫脹を引き起こし、形態学的パラメータの測定に影響を与える可能性があることに注意する必要があります45。電子顕微鏡検査に必要なグルタルアルデヒドの固定と脱水は、サルコメアの直径を縮小させることが知られていますが43、一方、繊維のスキニングとグリセレーションはサルコメアの直径を増加させることが示されています44,45。この現象は、文献のサルコメアパラメータの違いの根底にある可能性があり、各実験に対照サンプルとテストサンプルを含めることの重要性を強調しています。対照IFMと試験IFMは、サルコメアの定量的パラメータを正確に比較するために、同じバッファーで同時に処理する必要があります。

この詳細なプロトコルは、免疫組織化学および蛍光顕微鏡検査のための成虫および蛹の IFM 解剖を、初心者および上級のショウジョウバイオリストにとってよりアクセスしやすくすることを目的としています。このプロトコルは、他の昆虫での使用だけでなく、クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)、単一分子蛍光in situハイブリダイゼーション(smFISH)、空間トランスクリプトミクスなどの他のイメージング技術にも適応できます。強力な ショウジョウバエ 遺伝学ツールと蛍光顕微鏡の組み合わせは、筋形成と筋肉機能の保存された原理を調査するユニークな機会を提供します。IFMは分子的および生化学的アプローチにも適しているため26、 27、分子表現型を筋肉の形態、細胞生物学、および機能に関連付ける将来の研究は、筋形成と筋肉障害の病因についてのより深い理解を提供するでしょう。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、 SmnE33 対立遺伝子を提供し、Smnに関する有益な議論をしてくれたGregory Materaに感謝します。著者らは、有益な議論とサポートをしてくれたフランク・シュノラー、コーネリア・シェーンバウアー、マヌエラ・ヴァイトクナット、アイヌール・カヤ・コプールに感謝します。著者らは、ブルーミントンストックセンターがハエを提供したことを認めています。この研究は、ミズーリ大学カンザスシティ校(UMKC)科学工学部、生物および生物医学システム部門(MLS)、UMKCファンディングフォーエクセレンスプログラム(MLS)、およびUMKC学部研究およびクリエイティブ奨学金オフィス(SF、MLS)からのスタートアップ資金によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
60mm組織培養皿フィッシャー・サイエンティフィックFB01292160mm、発泡スチロール
酢酸、氷河(認証ACS)フィッシャー・サイエンティフィックA38S-212
アデノシン三リン酸(ATP)ミリポール・シグマA1852年
アルミホイル、重厚アマゾン12インチ。×1000フィート。
黒いシリコン解剖皿:活性炭粉末ミリポール・シグマC9157ほとんどの薬局でも入手可能です
黒いシリコン解剖皿:シルガード184ミリポール・シグマ761036シリコン解剖食器を作るには、シルガードの成分をジップロック袋に入れてよく混ぜます。活性炭粉(~200mg)をシルガード(~50g)に加え、よく混ぜて袋の角を切り、60mmの培養皿に水を入れ、ピペットチップで泡を除去し、一晩で硬化させます。 
段ボール製スライドトレイ、リサーチ・プロダクツ・インターナショナル社フィッシャー・サイエンティフィック50-136-7558
共焦点顕微鏡、ニコンAXR逆焦点共焦点ニコンwww.microscope.healthcare.nikon.com/
共焦点顕微鏡、ツァイスLSM 780逆共焦点ツァイスwww.zeiss.com
ダーウィン昆虫飼育室(インキュベーター)フィッシャー・サイエンティフィック/ダーウィン・チェンバースIN034光、温度、湿度制御インキュベーター
解剖皿(黒いガラス)ミクロスコップ・テクニク・ディートヘルム398011リンパ式(染色用ボウル/リンパタンク)、黒いガラス、4x4cm、透明ガラスカバー付き
デュモン #3 鉗子ファインサイエンスツール11231-30デュモクセル直線型12cm鉗子、0.17 x 0.1 mmの先端 
デュモン #5 鉗子ファインサイエンスツール11252-20イノックス直線型11cm鉗子、生物学グレード、0.05 x 0.02 mmの先端 
EGTA(エグタジック酸)ミリポール・シグマ324626
エタノール、絶対量(200プルーフ)フィッシャー・サイエンティフィックBP28184分子生物学グレード
フィッシャーブランドプレミアムカバーグラス(18 x 18 mm)、カバースリップフィッシャー・サイエンティフィック12548Aガラス、四角い、#1厚さ(0.13 - 0.16 mm)
フィッシャーブランドプレミアムカバーガラス(22 x 22 mm)、カバースリップフィッシャー・サイエンティフィック12548Bガラス、四角い、#1厚さ(0.13 - 0.16 mm)
フラットボトム細胞培養プレート(24ウェル)フィッシャー・サイエンティフィック7200740
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