個々のsEVの表面強化ラマン散乱に基づくバイオセンシングの疾患診断および治療への応用を探る

Summary

ここでは、ラベルフリー表面強化ラマン分光法(SERS)を用いて個々の小さな細胞外小胞(sEV)を解析するプロトコルを提示し、低侵襲疾患の診断と治療的投与手段としてのsEVの評価を可能にします。

Abstract

本プロトコルは、表面強化ラマン分光法(SERS)と機械学習(ML)を統合し、診断および治療用途のために個々の小さな細胞外小胞(sEV)を検出し分子プロファイリングする包括的なラベルフリープラットフォームを示しています。この方法は、サイズ排除クロマトグラフィーまたは超遠心分離のいずれかを用いたsEV分離から始まります。分離された小胞は、単一小胞感度を持つ設計されたプラズモニック金ナノピラミッド2Dアレイ基板上で解析されます。内在的なラマン生化学指紋を活用することで、外部ラベルなしで高特異度検出を可能にします。スペクトル取得後、データは前処理され、訓練済みの機械学習アルゴリズム(例:LDA、SVC)を用いて疾患状態を分類し、組織、血漿、唾液のsEVを用いて、それぞれ90.1%、70.9%、60.7%の分類精度で胃がんと健康な対照群を成功裏に区別します。さらに、その治療応用は、グラフェン被覆基板を内部標準として用いることで、単一sEVにおけるドキソルビシン負荷を定量化することで示されています。このアプローチにより、早期疾患検出や単一小胞レベルでの薬物負荷効率の理解に不可欠な集団の異質性を捉えるハイスループット解析が可能になります。

Introduction

細胞外小胞(sEV)は、通常直径30〜200 nmで、細胞から自然に生物体液に分泌され、起源を示すタンパク質、脂質、核酸を運び^ます。唾液、尿、その他の体液に存在する非侵襲的バイオマーカー^{として4、}特に^{腫瘍学において}早期疾患診断、予後、治療的モニタリングに期待を寄せています^5,6,7。しかし、その臨床翻訳は、複雑な生物学的行列における高い異質性と低い存在比により妨げられています^。こうした課題を克服するために、このプロトコルは表面強化ラマン分光法(SERS)を活用しています。これはプラズモニック基板^9,10,11を介してラマン散乱を最大10、¹⁰〜10、¹¹倍....

Protocol

人体標本の採取はヘルシンキ宣言に従って行われ、UCLAの機関審査委員会(IRB)によって承認されました。すべてのドナーは研究参加前に書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

注:本研究では、商業ベンダーから購入した4つの細胞株、AGS(CRL-1739)、A549(CCL-185)、NCI-N87(CRL-5822)、Hs 738.St/Int(CRL-7869)が使用されました。これらの細胞株は、ベンダーの指示と試薬に従って培養・継皮されました。調整された培地は-20°Cで収集・保存され、その後処理されました。韓国のサムスン医療センターでは、ドナーが自主的に組織、血漿、唾液の標本を提供しました。胃がん組織は外科的切除時に採取され、非がん対照群からは内視鏡で生検を採取しました。血漿は標準的な臨床プロトコルに従いEDTAチューブ内で採取されました。各被験者から約5mLの未刺激の全唾液を採取し、2,600 × gで4°Cで15分間遠心分離しました。 細胞外RNAを保存するため、上清液には20 U/mLのSUPERase-In RNase阻害剤が補足されました。すべての標本はさらに加工されるまで-80°Cで保管されました。sEVは、確立されたプロトコルに従い、条件付けされた培地および臨床標本から分離^{されました。}

Results

単一小胞SERSプロトコルの成功裏の実装により、個々のsEVから異なるラマンスペクトルが得られ、下流の診断分類や治療薬の負荷管理が可能になります。 図1 は、ここで報告したプロトコルを用いた胃がんの診断試験と、薬剤負荷型sEVsモニタリングアプリケーションのワークフローを示しています。

図1:研究のフローチャート。 (A) 胃がんの単一小胞SERS診断のワークフロー。臨床小胞は単離されプラズモニック基質上に沈着し、個別にラマンスキャンされ、多変量機械学習を用いて疾患識別およびサブ.......

Discussion

このプロトコルの重要な側面は基質の準備とsEV精製です。ラベルフリーSERSの性能は、均一で高コンフォーマルなプラズモニック基板の生成に強く依存し、強い強化「ホットスポット」を備えています。同様に、サイズ排除クロマトグラフィー による 高純度のsEV分離は、信頼性が高く再現可能なSERSスペクトルを作成するために不可欠です。タンパク質集合体やリポタンパク質のような不純物は、小胞信号を弱めるだけでなく、スペクトルノイズを導入して下流の機械学習分類を混乱させることがあります。

当プラットフォームの大きな利点は、検証済みの単一小胞分解能であり、これはsEVの異質性という課題を克服する上で重要な要素です。レーザースポットは単一の小胞より大きいものの、金ナノピラミッド形状による超線形信号増幅により、プラズモニックホットスポットに最も近いsEVが信号を支配します。これに加え基質上の低胞密度により、各スペクトルは個々のsEVの分子スナップショットを表しています。この能力により、ウェスタンブロットや質量分析などの.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1倍PBS	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	J61196。AP
300メッシュ銅グリッド	電子顕微鏡科学	EMS200-Cu
4%パラホルムアルデヒド溶液	シグマ・オルドリッチ	1004960700
4&プライム;Si wafers	MSEサプライズ	WA0810	(100) oriented
A549細胞株	ATCC	CCL-185
AGS細胞株	ATCC	CRL-1739
遠心分離ローター F-35-6-30、5430	エッペンドルフ	<ストロング>22654306<ストロング>
CHAマーク40	CHAマーク40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	電子ビーム蒸発
Crエッチャント溶液	シグマ・オルドリッチ	651826-500ML
ドキソルビシン D-4000	LCラボラトリーズ	D-4000_3g
ExoView R100システムおよびExoViewヒトテトラスパニンキット	ナノビュー・バイオサイエンス	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
FeCl3溶液	シグマ・オルドリッチ	451649
HFソリューション	シグマ・オルドリッチ	695068-500ML
Hs 738.St/Int 細胞株	ATCC	CRL-7869
共焦点ラマン顕微鏡を借りて	レニショー	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscope --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
KOHソリューション	シグマ・オルドリッチ	417661
MaxQ 4000ベンチトップインキュベーティング/冷蔵シェーカー	サーモ・サイエンティフィック	SHKA4000(4320)
MCO-19AICインキュベーター	三洋	8380-30-0035
ミレックス-GPフィルター	ミリポーアシグマ	SLGPM33RS	0.22 & micro;m
NanoSEM 230顕微鏡	FEI	SEM-FEI-014
ナノサイト NS300	マルバーン・パナリティカル	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/product-support /nanosight-range/nanosight-ns300
NCI-N87細胞株	ATCC	CRL-5822
オプティマ TLX 超遠心分離機	ベックマン・カウルター	8043-30-1197
オックスフォード・プラズマラボ 80プラス	オックスフォード・プラズマラボ	https://plasma.oxinst.com/ 製品/RIE/プラズマプロ-800-RIEです
ポリスチレン球	アルファ・アーサール	<ストロング>AA42711AB<ストロング>	500 nm
qEVoriginal/35nm	アイゾン	ICO-35
単層グラフェン	MSEサプライズ	ME0408
T-75フラスコ	VWR	156800
TF20 高解像度電磁波	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
ウラニル酢酸塩溶液	電子顕微鏡科学	22400-1