ここでは、lncPVT1が甲状腺がん細胞におけるHIF-1αの安定性と解糖遺伝子発現をどのように調節するかを調べるためのプロトコルを提示し、代謝調節と潜在的な治療標的の研究を可能にします。
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研究記事
ここでは、lncPVT1が甲状腺がん細胞におけるHIF-1αの安定性と解糖遺伝子発現をどのように調節するかを調べるためのプロトコルを提示し、代謝調節と潜在的な治療標的の研究を可能にします。
甲状腺がんは、最も重要な内分泌系がんとして、集団全体で疫学的傾向が加速しています。治療法の進歩にもかかわらず、再発と転移は依然として課題です。長い非コード RNA PVT1 (lncPVT1) は、複数の種類のがんにおいて保存された発がん性調節因子として浮上していますが、TC におけるその特定の機能についてはさらなる調査が必要です。私たちの研究は、TC 細胞株 TPC-1 と K1 を使用して、lncPVT1 が正常酸素状態と低酸素条件下の両方で解糖にどのように影響するかを調べることに焦点を当てました。lncPVT1 の過剰発現は、低酸素下でのグルコース消費と乳酸産生を大幅に増加させ、解糖を増強する能力を裏付けました。さらに、lncPVT1はGLUT1、HK1、HK2、PGK1などの主要な解糖遺伝子をアップレギュレートし、TC細胞の増殖を促進しました。メカニズム的には、lncPVT1 は、低酸素誘導因子 1α (HIF-1α) の分解を妨げ、蓄積を引き起こすことにより、低酸素誘導因子 1α (HIF-1α) を安定化しました。この蓄積されたHIF-1αは、解糖に関与する遺伝子の発現を制御する特定の調節配列に結合し、最終的にこれらの遺伝子を活性化し、解糖活性を高めます。私たちの発見は、lncPVT1がHIF-1αの安定性と解糖遺伝子発現を調節し、TC代謝の理解を進め、新しい治療標的を明らかにする可能性があることを実証しています。
非常に蔓延している内分泌悪性腫瘍である甲状腺がん (TC) は、発生率が急速に増加しています1。外科的処置、放射線療法、甲状腺ホルモン抑制療法などの治療戦略の進歩にもかかわらず、TC 患者のかなりの割合が依然として腫瘍の再発と転移のリスクに直面しており、その分子病因をより深く理解する必要性が強調されています 2,3。TC の発症は、電離放射線被ばく、化学発がん物質との接触、タバコの使用、肥満など、いくつかの確立された危険因子と関連しています。しかし、複雑な根底にあるメカニズムはとらえどころのないままです4.TC の分子メカニズムの理解が限られているため、がんにおける調節的役割について、ノンコーディング RNA、特に lncRNA にますます注目が集まっています。
新たな証拠により、選択的スプライシング、転写調節、マイクロRNA(miRNA)スポンジなどのメカニズムを通じて、特に腫瘍発生における多面的な生物学的プロセスの極めて重要な調節因子としてlncRNAが確立されています5,6,7。形質細胞腫変異体転座 1 (PVT1) は、染色体 8q24.21 および癌遺伝子 C-myc 8 の下流に位置します。このうち、染色体 8q24.21 の C-myc 癌遺伝子の下流に位置する lncRNA である lncPVT1 は、肝臓がん9 や腎細胞がん10 などのいくつかの悪性腫瘍における発がん性の役割で大きな注目を集めています。それにもかかわらず、TC における lncPVT1 の機能的意味はほとんど解明されていません。
がん細胞は、腫瘍形成の重要な特徴である代謝リプログラミングを受け、酸化的リン酸化の減少と相まって解糖活性の上昇、すなわちウォーブルグ効果を示します11。固形腫瘍によく見られる微小環境の特徴である低酸素症は、腫瘍の挙動に大きな影響を与え、解糖と攻撃性を促進し、予後不良をもたらします12。低酸素誘導因子 1 (HIF-1) は、低酸素レベルに対する細胞の反応を調節する重要な因子であり、腫瘍の生存と進行をサポートする多数の適応変化を調整します13。以前の研究では、lncPVT1 が乳がん14、膵管腺癌15、骨肉腫16 などの複数の悪性腫瘍の解糖を調節することが実証されています。さらに、lncPVT1 は、上咽頭癌の HIF-1α を安定化することにより細胞増殖を促進することが示されています17。しかし、lncPVT1 発現と臨床パラメーターとの相関関係は、がんでは報告されていません。さらに、lncPVT1 の特定の機能とメカニズム、または独自の臨床的意味は、TC では不明のままです。したがって、この研究の目的は、lncPVT1 が正常酸素状態と低酸素症にさらされた TC 細胞株 TPC-1 および K1 のグルコース代謝にどのような影響を与えるかを調査することでした。lncPVT1の過剰発現がグルコース消費、乳酸産生、細胞増殖に及ぼす影響を調べました。さらに、lncPVT1が支配するHIF-1α安定化メカニズムと、解糖関連の転写プログラミングに対するその結果として生じる影響を解読しました。この包括的な調査は、特に代謝リプログラミングと低酸素適応の文脈において、lncPVT1 が腫瘍形成にどのように寄与するかについて新しい視点を提供します。
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細胞培養とトランスフェクション
ヒト甲状腺癌(TC)細胞株TPC-1およびK1を、10%ウシ胎児血清と100μg/mLのペニシリン-ストレプトマイシンを添加した4.5 g/Lのグルコースを含むダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で培養しました。細胞は、5%CO2の加湿インキュベーターで37°Cに維持されました。低酸素処理のために、特に指定がない限り、1 x 105細胞を、1%O2、5%CO2、および94%N2で37°Cで24時間平衡化した密閉された低酸素チャンバーに移しました。lncPVT1(lncPVT1 OE)および対応する陰性対照(NC)の安定した過剰発現は、製造元の指示に従って、レンチウイルス発現系を使用してTPC-1およびK1細胞で生成されました。
血糖値の評価
グルコース消費量を評価するために、甲状腺癌細胞株を常酸素条件(21%O2)および低酸素条件(1%O2)で24時間培養しました。培地中のグルコース濃度は、メーカーのプロトコルに従ってグルコースアッセイキットを使用して測定されました。簡単に言えば、2 μLのコンディショニング培地を新たに調製したグルコース作業試薬と混合し、37°Cで10分間インキュベートしました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して530 nmで測定され、グルコースレベルを定量化しました。
乳酸レベルの評価
甲状腺癌細胞株TPC-1およびK1(2 x 104 細胞/ウェル)を、正常酸素条件(21%O2、5%CO2、37°C)および低酸素条件(1%O2、5%CO2、37°C)で24時間培養した。インキュベーション後、培養プレートを室温で300 x g で5分間遠心分離し、細胞と破片をペレット化しました。続いて、各ウェルから2 μLの清澄化上清を回収し、96ウェルプレートで200 μLの乳酸アッセイ試薬と混合しました。反応混合物を37°Cで10分間インキュベートした後、停止溶液を加えて反応を終了しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して530 nmで測定されました。乳酸濃度は、吸光度値を既知の乳酸標準から生成された標準曲線(通常は0〜20 nmolの範囲)と比較することによって決定されました。すべての測定は 3 回に分けて実行されました。
細胞増殖アッセイ
甲状腺癌細胞を、100 μLの培地中にウェルあたり3 x 103細胞の密度で96ウェルプレートに播種しました。次に、細胞を常酸素(21%O2、5%CO2、37°C)または低酸素(1%O2、5%CO2、37°C)条件下で0時間、24時間、または48時間インキュベートしました。各時点で、10 μLの細胞増殖試薬を96ウェルプレートの各ウェルに添加しました。次に、プレートを37°Cで40分間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロプレートリーダーを使用して450 nm(OD450)での光学密度を測定し、細胞増殖を定量化しました。すべての測定は、少なくとも 3 回の技術的反復で実行されました。
qRT-PCR分析
1 x 106甲状腺癌細胞から、正常酸素条件(21%O2、5%CO2、37°C)および低酸素条件(1%O2、5%CO2、37°C)で、メーカーのプロトコルに従ってチオシアネート-フェノール-クロロホルムグアニジニウム抽出試薬を使用して抽出しました。RNAの純度と濃度は、260/280 nmで吸光度比を測定することにより、分光光度法で評価されました。相補的DNA(cDNA)合成のために、逆転写酵素、ランダムヘキサマープライマー、dNTP、RNase阻害剤、および反応バッファーを含む20 μLの反応容量で500 ngのトータルRNAを逆転写しました。逆転写を25°Cで10分間行い、続いて42°Cで50分間行い、70°Cで15分間加熱して終了させた。
定量的PCRは、cDNAテンプレート(元のcDNA合成の1:5〜1:20希釈)、SYBR Green PCRマスターミックス、フォワードプライマーおよびリバースプライマー(それぞれ0.2 μM)、およびヌクレアーゼフリー水を含む総反応量20 μLのSYBR Greenベースの検出システムを使用して実行されました。PCR増幅は、次のサイクル条件でサーモサイクラーで実施されました:95°Cで3分間の初期変性。95°Cで15秒間変性40サイクル、60°Cで30秒間アニーリング、72°Cで30秒間伸長。続いて融解曲線分析を行い、増幅の特異性を検証します。
GLUT1、HK1、HK2、PGK1、およびGAPDHのプライマー配列(表1)は、公開された配列18に基づいて設計され、商業的に合成されました。標的遺伝子の発現レベルをGAPDHに正規化し、2-ΔΔCt法19を用いて計算した。
ウェスタンブロット
治療後、甲状腺癌細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した放射免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液を使用して溶解しました。細胞溶解物を断続的に混合しながら氷上で30分間インキュベートし、次に12,000 x g で4°Cで15分間遠心分離して不溶性破片を除去しました。上清のタンパク質濃度は、製造元の指示に従ってビシンコニン酸 (BCA) アッセイを使用して測定されました。同量のタンパク質(サンプルあたり30 μg)を5倍ローディングバッファーと混合し、95°Cで5分間沸騰させ、電気泳動分離のために10%SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードしました。タンパク質を120 Vで約90分間電気泳動によって分離し、100 Vで4°Cで90分間湿式転写システムを使用してポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に転写しました。 非特異的結合を防ぐために、0.1%トゥイーン-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%脱脂乳で5%無脂肪乳で室温で1時間ブロックしました。続いて、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(抗HIF-1α抗体(1:3,000)および抗ベータアクチン抗体(1:8,000)とともに、メンブレンを4°Cで一晩インキュベートした。TBSTで3回洗浄した後(それぞれ10分間)、メンブレンをブロッキングバッファーで1:5,000に希釈した適切な西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体と室温で1時間インキュベートした。さらに 3 回の TBST 洗浄に続いて、強化化学発光(ECL)検出システムを使用してタンパク質バンドを視覚化し、ゲルドキュメンテーションシステムで画像化しました。
デュアルルシフェラーゼアッセイ
lncPVT1による解糖関連遺伝子の転写調節を調べるために、TPC-1細胞をウェルあたり1 x 105細胞の密度で24ウェルプレートに播種し、4.5 g / Lのグルコースを含むDMEMで培養し、10%ウシ胎児血清と100 μg / mLのペニシリン-ストレプトマイシンを一晩添加しました。細胞は、メーカーの指示に従って、脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、500 ngの低酸素応答要素(HRE)駆動ホタルルシフェラーゼレポータープラスミドと50 ngのレニラルシフェラーゼコントロールプラスミドを同時トランスフェクトしました。トランスフェクション効率は、GFP発現プラスミドとの並行トランスフェクションを含め、トランスフェクションの24時間後に蛍光顕微鏡下でGFP発現を評価することによって確認されました。正常酸素(21%O2)または低酸素(1%O2)条件下で24時間インキュベートした後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを使用してルシフェラーゼ活性を測定しました。ホタルルシフェラーゼ活性をレニラルシフェラーゼ活性に正規化し、その比率をサンプル間の比較分析に使用しました。
データ分析
すべてのデータは平均± SD として表示されました。統計評価は統計分析ソフトウェアで実行されました。グループ間の比較は独立した t 検定を使用して実施され、統計的有意性は 0.05 未満の p 値閾値に基づいて決定されました。
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lncPVT1によって媒介されるTC細胞株における解糖の促進
当初、レンチウイルス発現系を用いてTPC-1細胞とK1細胞にlncPVT1 OEとNCを確立しました。lncPVT1の過剰発現の成功は、qRT-PCRによって確認されました(図1A-B)。解糖への影響を評価するために、細胞を正常酸素および低酸素下で24時間培養しました。私たちの発見は、低酸素症がTPC-1およびK1細胞のグルコース消費と乳酸産生を著しく促進することを示しました(図1C-F)。特に、lncPVT1の過剰発現は、低酸素下でこれらの解糖応答をさらに増強しました。
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最も一般的な内分泌悪性腫瘍である TC は、再発と転移の点で重大な課題を引き起こします22。甲状腺発がんのメカニズムは、特に発癌性代謝リプログラミングのlncRNAを介した調節と基本的な細胞挙動に関して、不完全に定義されたままです23 。この研究では、発癌性lncPVT1と、TC細胞における解糖およびHIF-1αの安定性に対するその影響に焦点を当てました。
Warburg 効果は、悪性腫瘍、特に低酸素条件下での基本的な代謝シグネチャを表しており、これは通常、解糖の増加と酸化的リン酸化の減少によって特徴付けられます24。急速に成長する固形腫瘍に蔓延する低酸素症は、腫瘍の攻撃性と予後不良を決定的に支配します 25,26,27,28
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著者らは、財務上か非財務的かを問わず、利益相反はないと主張している。
研究資金は福建省科学技術計画プロジェクト(2022J01784)を通じて提供されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BCAプロテインアッセイキット | メイルンビオ | MA0082-2 | WBタンパク質定量アッセイ |
| バイオセーフティキャビネット | リシェン | HFsafe-1200LCシリーズ | 細胞継代と増殖 |
| 遠心機 | 白陽 | B320A型 | 遠心分離機セル |
| 化学発光イメージングシステム | バイオラッド(米国) | ケミドックタッチ | WB開発 |
| CO2 インキュベーター | サーモ(USA) | 311 | 細胞培養 |
| ECL化学発光検出キット | メイルンビオ | MA0186-1 | WB開発 |
| フローサイトメーター | BDの | FACSカルバー | フローサイトメトリーアポトーシスアッセイ |
| 蛍光倒立顕微鏡 | ニコン(日本) | TS2-FLの | 細胞観察 |
| 蛍光定量PCR装置 | ABI(アメリカ) | 7300 | PCR実験 |
| GAPDH | プロテインテック | 60004-1-IG | WB内部参照抗体 |
| グルコースアッセイキット | 建城 | A154-1-1 | 生化学的アッセイ |
| HIF1A | ボスター | A00013 | WB抗体 |
| HRP 結合アフィニピュアヤギ抗マウス IgG(H+L) | プロテインテック | SA00001-1 | 免疫組織化学(IHC)実験 |
| HRP 結合アフィニピュアヤギ抗ウサギ IgG(H+L) | プロテインテック | SA00001-2 | 免疫組織化学(IHC)実験 |
| K1細胞株 | 中国科学院細胞バンク(中国・上海) | NA | ヒト甲状腺乳頭癌細胞株 |
| 乳酸アッセイキット | 建城 | A019-2-1 | 生化学的アッセイ |
| マイクロプレートリーダー | サーモ(USA) | K3 | ELISA検出 |
| PAGEゲル超高速調製キット(15%) | メイルンビオ | MA0384 | WB電気泳動 |
| PCR装置 | バイオラッド(米国) | PTC100 | PCR実験 |
| 染色済みレインボープロテインマーカー | メイルンビオ | MA0342 | WB電気泳動 |
| タンパク質垂直電気泳動システム | バイオラッド(米国) | パワーパック200 | WB電気泳動 |
| SDS-PAGEタンパク質ローディングバッファー(5X) | ビヨタイム | P0015L | WB電気泳動 |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | シグマ | 151-21-3 | WB電気泳動 |
| TPC-1細胞株 | 中国科学院細胞バンク(中国・上海) | NA | ヒト甲状腺癌細胞株 |
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