慢性低酸素症のマウスモデルにおける電気鍼による心・脳保護

サマリー

本研究では、電気鍼治療の心脳保護効果を調査するために、12週間の慢性低酸素マウスモデルを確立しました。この発見は、認知機能改善に一般的に用いられる経穴への電気鍼刺激が、認知機能の向上だけでなく、心機能障害の緩和や心筋組織の病理的損傷の軽減にも寄与することを示しました。

要約

本研究では、電気鍼治療の心脳保護効果を調べるため、12週間の慢性低酸素マウスモデルを確立しました。低酸素症関連疾患に対する既存の治療法、例えば高圧酸素療法や特定の医薬品は、アクセスの困難や単一標的メカニズムによって制約されることが多いです。このギャップを埋めるために、私たちは、従来認知機能向上のために用いられてきた経穴へのEA刺激が、慢性低酸素状態下で認知機能と心臓機能の両方を同時に改善できると仮説を立てました。30匹の雄C57BL/6Jマウスを、対照群(Con)、慢性低酸素症モデル群(CH)、慢性低酸素症と電気鍼治療群(CH+EA)の3つのグループに無作為に割り当てました。CHおよびCH+EA群は、12週間にわたり1日8時間、低酸素環境(10.0%±0.5% O₂)にさらされ、CH+EA群はさらに最後の2週間でGV20、GV24、両側ST36で毎日EA刺激を受けました。行動検査、心エコー評価、組織病理学的解析により、EAは不安様行動を有意に緩和し空間記憶を向上させるだけでなく、複数の心機能パラメータを強化し、海馬神経障害や心筋再構築を減少させることが示されました。これらの発見は、EAが心脳保護効果をもたらし、伝統中国医学の「ホリスティック概念」と一致し、低酸素症に関連する心脳併存症に対する新しい非薬物的介入戦略を提供することを示しています。

概要

低酸素症は、高地環境、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、心血管疾患、さらには航空宇宙や潜水作業などの専門的なシナリオなど、さまざまな状態で一般的な病理学的課題であり、多臓器機能障害につながる可能性があります。体内で最も酸素消費量が高い臓器である脳と心臓は、特に低酸素障害に対して脆弱です。研究によれば、COPD患者の認知障害の有病率は32%から88^{%の範囲であり、心}機能障害の発生率は最大70%に達します。^3。研究により、慢性的な低酸素症は脳ミトコンドリア機能障害を引き起こし、その結果、酸化ストレス、カルシウム過負荷、神経炎症を引き起こし、最終的には海馬や大脳皮質の神経障害を引き起こし、学習や^{記憶機能を障害}させることが示されています。同時に、低酸素は交感神経系とレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)の両方を活性化し、血管収縮、血圧上昇、心後負荷の増加、心筋肥大や線維症を促進し、最終的に^心不全へとつながります。.この同時進行する心脳損傷は患者の臨床管理の難しさを大幅に高め、効果的でアクセスしやすい治療戦略の開発を重大な未充足の臨床ニーズとしています。

低酸素誘発性認知障害および心機能障害に対する現在の治療戦略は主に高圧酸素療法、脳代謝促進剤(例:ピラセタム、オキシラセタム)、神経栄養因子療法^10,11、およびβ遮断薬(例:メトプロロール)¹²です。しかし、これらのアプローチには大きな制約があります。高気圧酸素療法は専門的な機器を必要とし、アクセスのしやすさが不足しています。薬理学的介入は副作用を引き起こすことが多く、通常は単一の病理経路を標的とします。一方、神経栄養因子療法は血液脳関門の浸透や安定性に関する課題に直面しています。したがって、同時進行の心脳治療のための効率的でアクセスしやすい戦略の特定が重要な研究方向となっています。

鍼治療は伝統中国医学(TCM)の基本的な要素であり、多目的的な規制の需要に沿ったホリスティックな治療的視点を強調しています。神経系および心血管系の疾患に対して独自の治療的可能性を示しています。電気鍼治療(EA)は、伝統的な針治療と電気刺激を統合した現代的な鍼治療の進化形であり、神経電気生理活動のより精密な調節を可能にします^13,14。EAは脳虚血再灌流損傷を効果的に改善し、心筋酵素(GPBB、H-FABP)の放出を減少させ、顕著な心臓防御効果を発揮します^15,16。まとめると、伝統鍼治療の現代的な革新として、電気鍼治療は多機構的かつ多標的的な調節を行い、神経学的および心血管疾患の治療において明確な応用価値と臨床的可能性を示し、TCMと現代医学を架け橋としています。

しかし、低酸素性認知障害や心臓損傷に対するEAの現在の研究は主に単一臓器・システムへの影響に限定されており、心脳の同時治療における可能性の探求は見られていません。TCMの「ホリスティック概念」と、長期慢性低酸素症によって引き起こされる心肺脳機能障害の併存の臨床現実に基づき、本研究は「同時心脳治療」におけるEAの効果を調査し、低酸素症による神経障害、心筋肥大/線維症、関連する機能障害の同期改善における役割を明確にし、心肺脳関連疾患に対する全体的かつ標的的を絞った非薬理学的レジメンを提供します病気。

プロトコル

7〜8週齢、体重18〜22g(材料 表参照)の30匹のオスのC57BL/6Jマウスが、河北夷陵製薬研究所新薬評価センターのSPF施設に収容されました。周囲の温度は20〜26°C、相対湿度は40%〜70%で、12〜12時間の明暗サイクルで維持されました。マウスは標準的な実験用齧歯類の餌や清潔な水を自由に利用できました。1週間の順応期間の後、マウスは3つのグループ(n=10)にランダムに割り当てられました:正常対照群(Con)、慢性低酸素モデル群(CH)、および慢性低酸素と電気鍼治療群(CH+EA)。すべての実験手順は河北宜陵製薬研究所動物研究倫理委員会(承認番号:TTN-2025001)により承認され、実験動物のケアおよび使用に関するガイドラインに厳格に従って実施されました。

慢性低酸素マウスモデルの確立 (図1)

慢性低酸素マウスモデルは、先に記載された方法を修正して確立^{されました。}自動ガス制御・供給システムが用いられ、低酸素環境を生成・維持しました。このシステムは、純酸素と窒素を特定の比率で混合するソレノイドバルブを正確に調整し、その混合物を特注のステンレス鋼製低酸素室に送るようプログラムされていました。この仕組みにより、ガス供給のタイミングと濃度の正確な制御が可能となりました。チャンバー内の酸素濃度はデジタル酸素分析装置で継続的に監視され、ガス流量を調整するフィードバック機構によって10.0%±0.5%に維持されました。CH群およびCH+EA群のマウスは低酸素室に同居され、1日8時間(午前9時から午後5時まで)低酸素状態にさらされ、その後はその日の残り時間は正常な状態に戻されました。このプロトコルは12週間毎日繰り返しました。低酸素曝露の間、動物たちは自由に食べ物や水を摂取できました。初期の窒素注入時には酸素濃度を下げるよう特別な注意が払われました。この過程は、酸素濃度の急激な低下による急性の動物死を防ぐために段階的に行われました。コングループのマウスは、隣接する部屋でノールキシックな環境で飼育され、他のすべての飼育条件は実験群と同じでした。

麻酔(図2)

電気鍼治療介入中の動物の安定性を確保し、生理的ストレスによる転帰への干渉を最小限に抑えるため、本研究では吸入性イソフルランを麻酔に使用しました¹⁷。一貫した運用環境を確保するため、実験群のすべてのマウスに麻酔が施されました。麻酔前に、小動物用麻酔装置( 材料表参照)と37°Cに設定された温度制御式加熱パッドが準備され、手術中の動物の低体温症を防ぎました。麻酔誘導は密閉された誘導チャンバーで、2%-2.5%のイソフルラン( 材料表参照)を用いて約1分間行われました。自発的な動きが失われ、筋緊張が著しく低下した後、各マウスを温熱パッドに移しました。特別に設計されたミニチュアマスクが鼻先に優しく装着され、0.5%〜1.2%のイソフルランで麻酔を維持しました。麻酔の有効深度は、まばたき反射の欠如および足底刺激に対する有意な離脱反射の欠如によって決定されました。この麻酔プロトコルにより、マウスの麻酔状態は30分以上安定し、その後のすべての処置を完了するのに十分でした。

電気鍼治療

慢性低酸素症曝露11週目にCH+EA群マウスに対して電気鍼治療介入を開始しました。選ばれた経穴は頭部の白輝(GV20)と神廷(GV24)、そして両側の祖三里(ST36)でした。GV20は頭蓋頂点の中央線、両耳尖の中間点¹⁸に位置しています。GV24は額の正中線に位置し、目の^内眼窩をつなぐ線の中央点より約1〜2mm上にあります。ST36は後肢、膝関節の下側かつ外側、線骨頭の下縁から約2mm下のくぼみに見られます^20,21。マウスが安定した麻酔状態に到達した後、操作者は右手に使い捨ての滅菌ステンレス鍼(仕様:0.18 × 7 mm;材料表参照)を握りました。頭の経位(GV24およびGV20)では、左手で頭皮を優しく持ち上げ、針を皮下に15〜30°の角度で挿入し、後方に約2mmの深さまで進みました。下肢のST36経穴には、針を垂直に約3〜4mmの深さで挿入しました。電気鍼治療装置の出力電極(材料表参照)は針のハンドルに接続され、一方のリードはGV20と左のST36を、もう一方のセットはGV24と右のST36を接続しました。同時に2本のワイヤーセットで電気鍼刺激が施されました。EAパラメータは以下の通りに設定されました:連続波、2 Hz周波数^22、23。現在の強度は0.1 mAから徐々に増加し、局所肢のわずかなリズミカルな痙攣(通常は約2 mAで維持)が観察されました。電気鍼治療は1日1回30分、6日間連続して1日休養し、合計2週間の療程で実施されました。一方、コングループとCHグループのマウスは、同じ期間と状態の麻酔と拘束を受けましたが、針の挿入や電気鍼の起動は行われませんでした。

野外試験

オープンフィールドテスト(OFT)は、^{新しい環境下}でマウスの自発的な運動活動、探索行動、不安様反応を評価するために実施されました。OFT装置は白いキュービクル(50cm、50cm、30cm)で、その床は行動分析のためにほぼ25マスのグリッド状に分割されていました(各マスは10cm、10cm)。正式なテストの前に、すべてのマウスは環境変化によるストレスが行動結果に与える影響を最小限に抑えるため、1時間の間テストルームに慣れさせました。テスト中、各マウスを装置の中央に優しく置きました。2分間の慣れの後、行動は正式に10分間記録されました。セッション全体は、移動軌跡を自動的に追跡するビデオトラッキングシステム(材料 表参照)で記録されました。分析されたパラメータには、総移動距離、中心ゾーンでの滞在時間、中心ゾーンでの速度、中心ゾーンへの進入回数が含まれていました。すべてのマウスは同じ中央の場所から探索を開始し、マウスは一度だけテストされました。嗅覚干渉を防ぐため、各マウスのテスト後、装置は75%エタノールで徹底的に洗浄されました

モリス・ウォーターメイズ(MWM)

記憶機能を評価する標準的な方法であるモリス水迷路(MWM)テストは、主にマウスの空間学習および記憶能力を評価するために用いられ^ました。装置は直径120cm、深さ30cmの円形プールで構成され、概念上は4つの等しい象限(I、II、III、IV)に分割されていました。外部からの注意をそらすため、プールの周囲には遮光カーテンが掛けられ、その上の壁には実験中ずっと固定された明確な視覚的な手がかりが固定されました。プールは22〜24°Cの水で満たされ、水位はプラットフォーム表面から約1cm上に保たれていました。水中には20%の濃度で無毒の二酸化チタン粉末が添加され、不透明化することでマウスと背景のコントラストを高め、より正確な映像トラッキングを実現しました。実験手順は6日間連続し、5日間の空間獲得訓練フェーズと1日間の空間プローブ試験で構成されました。訓練段階では、直径10cmの円形プラットフォームが第III区画に設置され、目標地点として使用されました。初日は、プラットフォームを水面よりやや上(~1cm)に設置し、ネズミが脱出目標に慣れてもらいました。2日目から5日目にかけて、プラットフォームは水面下約1cmの水面に潜り、空間学習を評価しました。毎日、4つの区画それぞれからプールの壁に面した水面に、決められた順序でネズミを順番に置きました。実験者は動物を置いた後、意図しない空間の手がかりにならないようにすぐに部屋を出ました。隠れたプラットフォームを見つけるのにかかった時間(脱出遅延)は各試行ごとに記録されました。もしマウスが90秒の制限時間内にプラットフォームを見つけられなかった場合、優しくプラットフォームに誘導され、空間学習を強化するために30秒そこに留まらせ、その遅延は90秒と記録されました。もしマウスが90秒以内にプラットフォームを見つけた場合、10秒の間そのプラットフォームに留まることが許されました。訓練の後は、タオルで拭いて元のケージに戻しました。開始象限の順序は体系的に変化し、各マウスの試験間隔は約20分でした。ビデオトラッキングシステム(材料表参照)は、泳ぐ距離、速度、脱出遅延などのパラメータを自動的に記録 します。6日目には空間記憶を評価するためのプローブ試験が実施されました。プラットフォームは目標区画(第III象限)から外され、各ネズミは前の目標位置(象限I)の反対側の象限から解放され、90秒自由に泳ぐことが許されました。目標区画(かつてプラットフォームがあった場所)で過ごした時間、かつてのプラットフォーム上の正確な横断回数、そして泳ぐ軌跡が記録されました。プローブ試験直後、マウスは十分に乾燥させられ、低体温症を防ぐために熱源の下で元のケージに戻されました。実験全体を通じて、迷路を取り巻くすべての視覚的手がかりの位置は変わらなかった。これは実験条件での一貫性を確保するためである。

心エコー

マウスの心エコーは非侵襲的かつリアルタイムの画像診断技術であり、心臓の構造と機能を評価する上で重要であり、心血管疾患モデルの研究に広く応用されています。検査は全身麻酔下で行われ、前述のプロトコルに従い、手技中は麻酔状態を維持します。ネズミは37°Cの温度で制御された温度制御されたプラットフォームの上で仰向けに置かれます。 四肢を優しく固定した後、胸と腹部に均一に除毛クリームを塗布します。すべての髪と残留クリームは1〜2分後に徹底的に除去され、最適な超音波伝導品質を確保します。リアルタイムの生理学的モニタリングのために、導電性ゲルを介して四肢に接続された電極パッチを用いて心電図と呼吸数を継続的に記録します。標準的な超音波画像を得るために、マウスの位置を調整して頭部が尾よりやや高く、心臓の長軸がプラットフォームと平行になるようにします。プローブで胸壁に過度な圧力をかけることは、心臓の形状を変え測定精度に影響を与える可能性があるため、特に注意が必要です。毛を剃った部分には、厚さ2〜5mmの気泡のない超音波ジェルをたっぷり塗布します。高周波のリニアアレイプローブ(30〜50 MHz)が使用され、プローブの向きのマーカーは常にマウスの頭部を指しています。プローブは最初、マウスの体の長軸に平行に配置され、その後約30°〜45°反時計回りに回転させます。左心室の副胸骨長軸視点を明確にするために微調整が行われます。動的画像取得は、超音波画像で左心室室、大動脈弁、僧帽弁が明確に表示され、心臓先端が大動脈流路と水平に整列していることが示された時点で開始されます。すべての画像は、データの比較可能性を確保するために一貫したパラメータ設定を用いる経験豊富なオペレーターによって取得されます。検査後、超音波プローブは標準手順に従って洗浄され、残留したゲルはマウスの体から拭き取ります。その後、マウスは温かいケージに移され、麻酔から完全に回復し正常な歩行が回復するまで厳重に監視されます。

パラフィン切片の準備

行動検査終了後、マウスは腹腔内注射によるペントバルビタールナトリウム(20 mg/kg)麻酔を受けました。その後、経心内射流(生理食塩水)で固定し、その後10%パラホルマルデヒド投与しました( 材料表参照)。脳組織を慎重に抽出した後、10%パラホルマルデヒドに室温で72時間の固定に浸されました。心臓灌流は心筋の微細構造を変化させるため、本研究で組織学的解析に用いられた心臓標本は、灌流手術を受けなかったマウスから特定的に採取され、その他の取り扱い条件は同一のままであることに注意が必要です。固定が完了すると、組織は流水で6時間洗い流されました。その後の勾配脱水は自動組織処理機(材料 表参照)を用いて行われ、60%、70%、90%エタノールをそれぞれ1時間ずつ浸け、続いて95%および100%エタノールをそれぞれ2時間ずつ浸けました。脱水されたサンプルはキシレンで2時間クリアされ、60°Cでパラフィンで浸潤されて3時間浸入されました。最後に、組織を埋め込み機械でパラフィンに埋め込み、標準的な解剖学的配位を確保しました。埋め込まれたブロックが完全に固化した後、厚さ4μmの連続断片をロータリーマイクロトームで切断し、ポリLリジンコーティングガラススライドに取り付け、空気乾燥させて保管し、その後の染色と分析に備えました。

ヘマトキシリン・エオシン染色

脳および心臓組織の組織学的検査は、ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色を用いて行われ、低酸素損傷の評価と電気鍼治療介入の治療効果を評価しました。厚さ4μmの組織切片は、まずキシレンIおよびキシレンIIで脱硫され(それぞれ10分)、その後段階エタノール(100%、95%、80%各2分)で再水和され、最後に蒸留水で洗浄されました。染色のために、切片をヘマトキシリン溶液に3〜8分間浸けて核の染色が透明になるまで行い、流水で洗浄してブルーイングを誘発し、その後エオシンで1〜3分間カウンターステインして細胞質に適切なピンク色を得ました。最後に、染色された部分は絶対アルコールで脱水され、キシレンでクリアされ、中性バルサムで取り付けられました。

ニッスル染色

海馬領域におけるニューロンの生存状態を評価するために、ニッスル染色法を用いてニッスル体およびニューロン内の細胞形態の分布を観察しました。脳組織パラフィン切断の脱水と再水和後、スライスは予熱したトルイジンブルー染色液に浸され、56°Cの定温インキュベーターで1時間培養されました。染色後、切片は蒸留水で優しくすすいで後、ニッスル分化液に数秒間から最大2分間移しました。この分離過程は顕微鏡で慎重に監視され、背景がほぼ無色になるまで観察されました。その後、分離された断片は絶対エタノール系列で急速脱水され、キシレンでクリアリングされ、最終的に中性樹脂で埋め込まれて恒久的な保存と観察が行われました。

マッソン三色染色

マソン三色染色は古典的な結合組織染色技術であり、主に心臓組織内のコラーゲン線維と筋繊維を区別するために用いられました。心臓パラフィン断片の脱パラフィンおよび再水和後、着色手順はMassonトリクロム染色キットに付属していた製造元の指示に従って実施されました(材料 表参照)。染色プロトコルは以下の通り実施されました。当初、切片は新たに調製されたワイガートの鉄ヘマトキシリン作業液に4分間浸けられ、核を着色し、均一な染色を確保するために優しく攪拌されました。その後、切片を流水で洗浄し、1%酸性アルコールで5〜10秒分化し、4分間ブルーイング溶液で処理してクリアな青紫色の核染色を得ました。切片はその後、ポンソー酸フクシン溶液で5分間染色され、その後0.2%ホスホモリブ酸溶液で1分間分異されました。弱酸の作業液で1分間短くすすぎた後、0.2%アニリンブルー(pH 6.8)溶液で2分間カウンターステインし、コラーゲン繊維を際立たせました。染色工程が完了すると、区画は段階的なエタノールで脱水され、キシレンでクリアされ、最終的に中性バルサムで貼付されました。すべての取り付けセクションは、完全自動スライドスキャンシステム(材料表参照)でデジタルキャプチャされ、その後 の分析が行われました。

統計解析

得られた結果はSEM±平均として示されます。データは一方向ANOVAを用いて解析し、その後LSD事後検査(t-test)を行いました。OFTおよびMWMのデータ解析には双方向ANOVAが用いられました。p < 0.05が有意水準と見なされていました。統計分析とチャートはGraphPad Prism 9.0ソフトウェアによって作成されました。

結果

電気鍼治療は、マウスの慢性的な持続性低酸素症によって引き起こされる不安様行動や認知機能障害を軽減します。

CHに曝露されたマウスの不安様行動は、まずOFTを用いて評価されました(図3A)。軌跡プロットは明確な行動パターンを示しました。対照マウスは新しい環境で強い探索傾向を示し、移動パターンはアリーナ全体を覆い、主にコーナーゾーンに集中していました(左パネル)。対照的に、CHモデルマウスは探索が著しく減少し、主に隅に留まり、中央部分(中央パネル)をほとんど避けていました。EA治療後、低酸素マウスは探索行動が改善し、中心領域(右パネル)での活動が顕著に回復しました。定量解析により、対照群と比較して、CHマウスは総移動距離、中心ゾーンでの滞在時間、中心ゾーン通過回数(いずれもP.001<0.001)で有意な減少を示し、低酸素誘発性不安様行動を示しました。重要なのは、EA治療がこれらのCH誘発性行動障害を著しく改善したことです(P...

ディスカッション

この研究は、長期的な慢性低酸素症がマウスに不安様行動や空間記憶障害を引き起こす可能性があることを裏付けており、これは先行研究結果と一致しています(^26,27)。一方で、長期的な慢性低酸素症は心機能障害や心筋構造障害を引き起こすこともわかりました。しかし、現在では、低酸素症による認知障害と心臓障害を同時に改善できる治療戦略が不足しています。この目的のために、長期慢性低酸素症による認知機能障害および心機能低下の改善におけるEA介入の可能性を評価しました。本研究は、認知機能改善に一般的に用いられる経穴群(GV20、GV24、ST36)へのEA刺激が認知機能の改善だけでなく、心機能や心筋構造を有意に改善し、低酸素誘発性認知機能障害や心機能低下の同期的な改善を実現できることを初めて確認したものです。したがって、行動的および組織学的観点から「心臓と脳の同時保護」の客観的証拠を提供します。この発見は、低酸素関連病変における伝統中国医学の「ホリスティック概念」の科学的根...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10%パラホルムアルデヒド溶液	ビロイ(北京)バイオテクノロジー株式会社、< > Ltd	RL3234
ANY-MAZE	科学	SA201	ビデオトラッキングシステム
C75BL/6Jマウス	北京HFKバイオサイエンス 株式会社	番号110322220103041767	性別:男性、nbsp;体重:18–22g
使い捨て鍼	華陀	246076	単回使用用の滅菌鍼(0.25mmで急性;13mm)
電気鍼治療器具	万里の長城	KWD-808 I
HistoCore MULTICUT - 半自動ロータリーマイクロトーム	ドイツ、ライカ	RM2245	パラフィンスライサー
花戸鍼治療 針	蘇州医療機器工場	2655519
イソフルラン	RWDライフサイエンス株式会社	R510-22
マッソンs トリクロムステインキット	ソラルビオ	G1340	マッソン染色キット
モリス水の迷路	サンスビオ	SA201	モリス水迷路装置
NanoZoomer デジタル病理学	浜松フォトニクス株式会社	C9600-01
NDP。ビュー2	日本、桜		スライドスキャナーソフトウェア
小動物麻酔装置	後輪駆動	YL-LE-A106
ティッシュテック・プリズマ・プラス	日本、桜	20B2X00014000034	パラフィン埋め込み組織切片、凍結切片、スライドマウント細胞などの標本の染色用に設計された完全自動装置です。
Tissue-Tek TEC 6埋め込みモジュール	日本、桜	M01-021E-02	パラフィン埋め込み機