左心疾患による肺高血圧症のZSF-1ラットモデルにおける拡張期機能障害のパルス波ドップラー評価

サマリー

左心疾患による肺高血圧症の前臨床モデルにおけるドップラー超音波検査を用いた拡張期機能評価のプロトコルを提示します。

要約

拡張期機能障害および駆出率保持率を持つ心不全(HFpEF)は、左心疾患による肺高血圧症(PH)の重要な要因です。前臨床モデルにおけるリラクゼーション異常の標準的な in vivo 評価には、2次元(2D)心エコーとドップラーによる伝道尿流および組織のリラクゼーション評価が含まれ、これは複雑で高価、高度な心エコー機器を必要とします。ここでは、左心疾患による拡張期機能障害を評価する価値ある代替法が、2D心エコーを使わずにパルス波ドップラー超音波を用いた確立された齧歯類モデルで示されています。拡張期の僧帽弁流パターンは頂端窓から特定され、同時に記録された心電図トレーシングと相関されます。拡張期機能の指標が収集され、これらの指標の特定はこのプロトコルで記述されます。この低コストで容易に実装可能な手法は、PH、心血管疾患、HFpEFに関連する拡張期機能障害の関連マーカーを特定します。さらに、2D心エコーが望まない場合や利用可能でない場合でも、時間経過による進行を再現可能に検出します。この方法の主な制限は、心臓構造の可視化ができないこと、ドップラー信号の角度依存による不正確さの可能性、そしてプローブの位置を調整し血流との整列を最適化することで動物の身体の体型に関する問題です。

概要

肺高血圧症(PH)は治療法のない致命的な病気で、肺血圧の上昇を特徴とします^。左心疾患(LHD)は世界的に最も一般的なPHの原因であり、高い費用と重大な罹患率と関連しています^2,3。PH-LHDの心臓の原因には、収縮期または拡張期の機能障害を引き起こす複数の異なる要因が含まれます。例えば心不全は多面的な臨床症候群であり、世界中の主要な死亡原因の一つであり続け^{ています。}心不全患者のうち、HFpEFは事故に基づく入院の半数以上を占め^{ています。}拡張期機能障害は、LHD(PH-LHD)^6,7によるHFpEFとPHの相互作用において最も重要な前駆症状の一つであり、基本的な特徴となっているとされています。PHおよびHFpEFの臨床的および亜臨床的特徴の多くを再現する適切な前臨床モデルが不足しているため、これらの疾患のメカニズムの理解^は不完全です。

拡張期機能障害はPH-LHDの特徴であり、2D心エコーおよび^ドップラー心エコー8で評価できます。左心室拡張期機能の評価における二次元およびドップラー法には、初期拡張期E波のピーク、後期拡張期A波のピーク、僧帽弁A持続時間(A波発生からA波終了までのゼロ基準線の時間間隔)、僧帽弁E/A比、E波減速時間(DT、ピークE波からゼロ速度基準線への外推時間)などが含まれます。 中隔僧帽弁環の組織ドップラーイメージング(TDI)(e'、僧帽弁環の組織弛緩の心エコーパラメータ)およびIVRT(大動脈弁閉鎖から僧帽弁開閉までの時間)の組織ドップラーイメージング(TDI)です。心エコー図のリラクゼーション障害のマーカーには、A波増強およびE波減少の環境におけるE/A比の低下または逆行の組み合わせ、IVRTの延長、E波減速時間の短縮、組織ドップラー指数の遅延(e'速度の延長、平均中隔E/e'の増加)、および全波縦断力(GLS^)の絶対値の低下が含まれます9.心エコー測定と侵襲的血行動態測定を比較した研究では、心エコー測定と侵襲的測定が比較可能であり、心臓血行動態を評価する信頼できる方法であることが示されました¹⁰。しかし、2D心エコーは複雑で高価であり、高度な心エコー機器と人員を必要とします。これらの要因は、動物における病気の進行を追跡する上で大きな制約となっています。したがって、研究者は縦断的研究では2つの指標(研究開始と終了)に頼るか、横断研究デザインでは単一測定に依存します。

これらの拡張期機能障害のパラメータの中で、E、A、E/A、A持続時間、DT、IVRTはパルス波ドップラー心エコーで評価でき、2D心エコーの必要を不要とします。本記事では、拡張期機能のドップラー評価プロトコルを、確立されたZSF-1ラットモデルのPH-LHD¹¹で示しています。合計25頭(遺伝的に肥満10頭、遺伝的に瘦削15頭)の雄ZSF1ラットが縦断的に追跡され、生後8週から24週の間、拡張期機能障害の発症を超音波検査で評価しました。同じ心エコー指標が2つのコホートで評価されました。すべての動物はベースライン(生後8週)で評価されました。拡張期機能障害のドップラー証拠は、中間測定が行われた生後16週までに現れました。終点測定は生後24週で行われました。データ収集を行った研究者は肥満コホートの明らかな体重増加のため盲検化ができませんでしたが、データ分析を行った研究者は動物の表現型を盲検されました。この実装しやすい方法は齧歯類の病況進行を縦断的に評価する道筋を提供しますが、プローブの整列や動物の大きさによっては、良質なドップラー信号の角度依存性が難しくなるという制約があります。

プロトコル

すべての手続きは、ジョンズ・ホプキンス大学動物ケア・使用委員会(ACUC)のプロトコルRA21M273承認に従って実施されました。データ収集や測定目的で不快感を経験した動物は一切ありませんでした。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 機器と動物の準備

1. 麻酔室を70%エチルアルコールで清掃し、すべての表面を拭き取ってください。
2. 使い捨てのおむつ替えパッドとペーパータオルでチャンバーを敷きましょう。ガスの流入口と出口口が詰まっていないことを確認してください。
3. 以下の安全および麻酔取り扱いの注意事項を必ず守ってください。
   1. 麻酔ステーションは換気の良い場所に設置してください。
   2. 麻酔器具の漏れや故障がないか点検してください。
   3. 回路が動物に接続されるまでは蒸気発生器の電源を入れないでください。
   4. 実験中は酸素の流れを継続的に維持してください。
   5. スカベンジングシステムが麻酔回路システムと連続していることを確認しましょう。
   6. 鼻のコーンと動物の鼻の間の隙間をテープで塞ぎ、麻酔薬のこぼれを減らし、空気中の汚染物質の漏れを防ぎます。
   7. 麻酔維持段階では、麻酔回路内の新鮮なガス流量を減少させます。可能な限り低い新鮮ガス流量の使用が推奨されます。
   8. 実験終了後は、残留麻酔剤と呼吸器を洗浄するために高流量で酸素を投与し続けます。
4. 酸素タンク(100%)を開けて、麻酔チャンバーに酸素を自由に流します。
5. 動物のケージを開けて、動物を麻酔室に入れます。
6. チャンバーをしっかりロックしてください。
7. イソフルラン蒸発器を開け、酸素(2L/分)と混合した2%から3%のイソフルランを麻酔チャンバーに自由に流します。
8. 動物は酸素-イソフルランガス混合物を最大3分間、または全身麻酔の十分な深さが得られるまで吸い込みます。
   注:麻酔は、実験開始前に動物が非有害または有害刺激に反応せず、自然呼吸を続けている場合に十分とみなされます。

2. 心電図追跡の取得

1. 心電図トレーシングパッドに接続されたタブレットを起動してください。利用可能なアプリから RSMonitor を選択してください。心電図パッドは、前方のラウンドボタンを押して起動します。
   注意:点滅する緑色のランプはECGパッドがタブレットとペアリングしていることを示します。緑色の点灯はペアリングの完了を示します。
2. ユーザーインターフェースの右下隅にある 「SETTINGS 」をタップします。
3. 実験設定のドロップダウンメニューから PRESETS を選択してください。
4. 「保存済みプリセット」のドロップダウンメニューをタップします。
5. Rat CV を選択し、右下の OK ボタンを押してください。
   注意:パッドは「ラット」モードにして、足 で 心電図を検出できるようにしてください。
6. 心電図パッドを70%エチルアルコールで洗浄し、心電図ゲルの残留物を取り除きます。
7. 心電図には高導電性電極ゲル、ドップラー用には水溶性の低アレルギー性超音波ゲルを使いましょう。
8. ノーズコーンへのガス混合気の流れを開放します。
9. 麻酔を受けた動物を非侵襲的な心電図パッドの上に仰向けに置き、鼻は適切なサイズの鼻錐に当てます。蒸気出力を1.5%〜2%(酸素流量1L/min)に設定してください。鼻錐にイソフルランが自由に流れるようにしてください。
10. 麻酔室に向かうガスの流れを止めてください。
11. コットンチップのアプリケーターを使って前足の背面と後足の足底側に少量の電極ジェルを塗布します。心電図パッドの電極接触面にテープで足を固定し、電極ゲルが十分な接触を心電図パッドにしっかり接していることを確認してください。
    注意:ネズミはラットに比べて鼻のコーンが小さい必要があります。
12. 優しい脱毛クリームを使って胸部と腹部の毛を除去し、皮膚プローブとの接触を良くします。残った除毛クリームは拭き取り、肌の刺激を防ぎましょう。
13. 等電基線と心電図トレーシング上のP-QRS-T波形がコンピュータモニターに表示されていることを確認してください。
    注意:心拍数によっては、P振幅とT振幅がQRS複体と区別できない場合があり、R波はドップラー波形のタイミングを決定する上で最も重要な要素です。

3. コンピュータのセットアップ

1. コンピューターを起動しろ。
2. 動物と関心のあるデータをコンピュータにフォルダ作成します。実験中に撮影されたスナップショットはこのフォルダに保存されます。
3. 前面と背面(大きな青い箱)のパルスドップラートランシーバーを点灯させます。
4. ドップラー信号処理装置(小さな黒い箱)を起動します。
5. ドップラー信号処理ワークステーションのアイコンを開いてソフトウェアを起動します。
   注:初期システム設定は以下の通りです:システム設定で10 MHzまたは20 MHz、サンプリングレート:125 kHz、サンプルサイズ:512、ローパスフィルター:150 kHzで、ほとんどの実験に適しています。
6. 左上の セットアップ をクリックしてください。
7. システムセットアップを選択します。
8. 実験に適したプローブ周波数を選択します(マウスと小型ラットは20 MHz、大型ラットは10MHz)。
   注:インターフェースは2つのパネルで構成されています。上側はドップラー速度スペクトログラムの表示用パネル、下側は心電図を表示するパネルです。
9. 若いラットやマウスを調査する際は20MHzプローブを接続してください。高齢、大型、肥満のラットには10 MHzのプローブを使いましょう。注目すべきは、両方のプローブを同時に接続でき、ドップラートランシーバーモジュールにより周波数やプローブの切り替えが容易であること(前面のトグルスイッチ)が可能である点です。
10. トランシーバーモジュールのドップラー設定を:
    1. ハンドヘルドプローブトランスデューサーがチャネルAまたはBのコンセントに設定されていることを確認してください。
       注意:受信機の選択はデータ取得に影響を与えず、ソフトウェアの変更も引き起こさない。
    2. それぞれ適切な10/20 MHzチャネルを選択して10/20 MHzハンドヘルドプローブを動作させます。
    3. パルス繰り返し周波数(PRF)を62kHzに設定し、最適な距離の曖昧さを確保し、PWドップラーで最も近いサンプル体積から検出可能な最大速度を上げつつ、エイリアシングを最小限に抑えます。
    4. DIRECTIONスイッチをTWDに設定すると、プローブに向かってくる流れをゼロフローベースラインより上の波形として表示します。
       注意:プローブから離れる流れは、ゼロフロー基準線 より下 の波形として表示されます。
    5. マウス用の範囲を2.5〜3.5mm、ラット用4〜6mmに調整して、サンプルの置く深さを選びます。
       注意:ラットの心臓はトランスデューサー面から最初の1cm以内、マウスの心臓は最初の0.5cm以内にあります。皮膚プローブ界面からサンプル体積の中央までの距離が測定され、伝達物質流の検出範囲は動物の大きさ、年齢、体型によって異なります。
    6. FILTERを15に設定して、位相速度出力を「減衰」に平滑化し、速度の過大または過小評価を防ぎ、最適な速度推定を確保します。
11. ユーザーインターフェース画面の左上にある GO ボタンを押してください。ポップアップウィンドウが表示されます。
    1. 新しいウィンドウに、関連する取得情報(動物の種類、性別、生年月日、獲得日の年齢、体重など)を入力してください。
    2. ディレクトリのドロップダウンメニュー(フォルダ作成についてはステップ3.2参照)から動物と実験の識別子とともに、希望する事前作成フォルダを選択します。
    3. OKを押してください。
       注意:初期ファイル番号は _00 に設定されています。
    4. 左のスケールバーを使って(軸を左クリックして上下にドラッグする)心電図のベースラインを調整し、R波がはっきり見えるようにします。
       注意:基準線は、カーソルをECGパネルに置いたまま、マウスを右クリックして前後に動かすことでシフトできます。

4. ドップラー測定の実施

1. プローブと皮膚間の超音波伝達を促進するために、動物の胸部および腹部の胸骨下・上腹部領域に少量の超音波ジェルを塗布します。
2. ドップラープローブを胸骨のすぐ下(椎骨のすぐ下でやや左側)の横隔膜の中央に置き、頭を頭の左側に向け、動物の左耳に向けて、プローブを小さな円を描くようにゆっくりと動かし、半径を1mmずつずつ細かく動かして流れのスキャンを開始します。
3. 常にプローブを横隔膜の下の皮膚に優しく押し付けてください。
4. 僧帽弁流が検出できない場合は、ダイヤルを0.5 mm単位で回して伝送波形を検出し(図1A)、ダイヤルの回転ごとに円を回す動作を繰り返し、必要に応じてレンジを調整します。
   注意:方向スイッチが「TWD」(方向)に設定されている場合、ゼロ基準線上にM字型の拡張期順行性フローパターンが現れ、僧帽弁開口時に起こる僧帽弁の流れと整合する拡張期の流れパターンを示します。注目すべきは、僧帽弁の流れパターンでは大部分の流量が基準線より上にあるのに対し、主に基準線より下にある非対称V字型波形は、大動脈弁など別の弁を通る収縮期の流れを示しています。大動脈血流パターンに一致する波形に遭遇した場合は、動物の先端をわずかに右に動かし、上方に傾けます(最小限の1〜2ミリの動きで済みます)。すべての信号はリアルタイムで表示されます。拡張期の三尖弁流は、基準線上では類似したM字型の波形として現れます。しかし、右心房と右心室間の圧力勾配が低いため、ピーク速度は大幅に低くなります(図1B)。三尖弁の流れと一致する波形に遭遇した場合は、プローブを動物の左側にわずかにスライドさせ、皮膚に対する角度を変えずに行います。
5. ドップラー波形と心電図を同時に画面に表示させること。
   注意:ECGスイープ速度は、パネル右下の上下矢印をクリックすると快適なレベルに調整できます。画面ごとに4〜5拍が見えるのが最適です。

5. ドップラー超音波からのデータの取得

1. 正しい流れが特定されたら、フットペダルを使ってスナップショットを作成します。最適なデータ品質のために、必要に応じて複数回繰り返し行うことができます。
   注:理想的な画像はスペクトル境界の明確な定義を示し、スペクトルの広がりやスペクトルの塗りつぶしがなく、順流と逆流の同時表示はなく、拡張期の僧帽間道および収縮期大動脈の流れが同時に表示されます。フットペダルを踏むとスナップショットが自動的に保存されます。
2. データ品質に満足したら、ユーザーインターフェース右上の STOP ボタンをクリックしてデータ取得を停止します。平均速度や収縮・緩和時間を信頼できる表現のためには、心電図波形とドップラー波形のペアを最低3回複製する必要があります。
3. 上部のファンクションバーにある 「ファイル 」メニューをクリックしてください。
4. ドロップダウンメニューから 「開く」 を選択します。
5. 分析のために、事前に作成されたフォルダから最も高品質なデータファイルを選択します。
6. 左上の 「Analysis 」をクリックしてください。ポップアップウィンドウが表示されます。
   1. ステップ2を選択する:一般的なセットアップ
      1. データタイプ: ドップラー
      2. 信号: 僧帽弁流入
      3. 動物:実験に適したモデルを選択します。
      4. デフォルトの測定名で「すべての測定名」を設定してください。
7. 分析コントロールのドロップダウンメニューから 「ステップ5:Rピークエディタ 」をクリックしてください。 表示ビートとRピークマーカーを選択してください。自動 計算を選択します。
   注:Rピークの緑色マーカーが表示されます。緑のマーカーをR波の先端に合わせます。不要なビートマーカーは、マーカーにカーソルを置き、マウスを右に素早く動かしながら右クリックを押し続けることでパネルから除去できます。
8. Analysis Controlのドロップダウンメニューから ステップ6:ビートエディター をクリックしてください。「 ビートとRピークマーカーを表示 」を選択し、「 すべてのビートを選択し」をクリックします。
9. Analysis Controlのドロップダウンメニューから ステップ7:マーカーエディター をクリックします。「 分析マーカーの表示」をクリックしてください。「現在のマーカー選択済み」から測定用の希望パラメータを選択します。
   1. データの完全性のために以下のパラメータが必要であることを確認しましょう(図1):
      1. ES:早めの始まりです。これは基礎線で測定される初期拡張期フローのアップストロークの始まりです。
      2. EPV:初期のピーク速度。ベースライン上の最初のピーク速度は、早期拡張期における左心房(LA)-左心室(LV)圧力勾配を反映しています(これは既存のLA-LV圧力勾配による受動流速の最大速度です)。
      3. EEAS:早期終了、心房開始。これはLAとLV間の圧力の均等化と流れの停止(ディアスタシス)を反映しています。
      4. APV:心房のピーク速度。基準線より上の2つ目のピーク速度は、後期拡張期における左心房-左心室圧力勾配を反映しています。これは「心房蹴り」時の血流のピーク速度です。
      5. AE:心房末期。後期拡張期終了時の流れ停止と、LA-LV間の圧力の均等化を反映しています。
      6. IVCTE:等容性収縮の時間終了。これは収縮期開始時に僧帽弁閉鎖から大動脈弁の開閉までの時間間隔を指します。
      7. IVRT:等容性リラクゼーション時間が始まります。これは、大動脈弁が閉鎖されてから拡張期が始まる僧帽弁の開口までの時間間隔です。
   2. 上記の測定を行った後、分析コントロールのドロップダウンメニューからステップ8:測定結果を選択します。
   3. 「 結果をクリップボードにコピー」をクリックしてExcelファイルにデータをコピーしてください。Excelデータを保存してください。
   4. 「分析コントロール」ウィンドウを閉じてください。
   5. 左上の「 ファイル 」をクリックして「 保存」を選択します。これにより、測定された分が保存されます。
   6. ドップラー信号処理ワークステーションを退出してください。

6. 実験の終了

1. イソフルランを止め、動物の足からテープを外してください。
2. 動物を電極パッドから取り出します。
3. 残っている脱毛クリームと電極ジェルをきれいに取り除きます。
4. 動物をケージに戻し、水や餌を自由に提供してください。
5. 動物が麻酔から回復しつつ、施設のプロトコルに従ってモニタリングを受けること。
6. 酸素を止めて。
7. 麻酔室を掃除しろ。

結果

この方法はPH-LHDの拡張期機能を縦断的に評価することを可能にします。拡張期機能を最も正確に評価するためには、僧帽弁と大動脈弁の開閉に関連する順行および逆行性の流れパターンを同一心周期内に複数周期にわたって視覚化する必要があります(図1)。大動脈弁の閉鎖は拡張期の始まりを示し、その最も初期の段階は等容性弛緩期であり、僧帽弁の開口と拡張期初期および後期の間に続く二相性二位性伝達尿の開始に続きます。拡張期は血流停止と僧帽弁閉合で終わります。これらのフローパターンの変化は 図1 に示されており、収縮期経大動脈血流はゼロ流量ベースラインの下に描かれ、等容性弛緩は大動脈弁閉鎖から僧帽弁開口までの流れゼロ、二相拡張期の僧帽間伝達流はベースライン上にM字型のパターンで描かれ、その後に僧帽弁閉鎖から大動脈弁開口まではゼロ流量が示されています。スペクトルドップラーによる大動脈または僧帽弁の同時検出がなければ、等容収縮と弛緩時間は測定できません。

ディスカッション

本稿では、2D心エコーを使わずにパルス波ドップラー超音波を用いた確立された齧歯類モデルにおいて、PH-LHDの拡張期機能障害を評価する代替法を示します。拡張期の僧帽弁流パターンは頂端窓から特定され、同時に記録された心電図トレーシングと相関して、舒張期機能の指標を決定できます。この低コスト技術は、拡張期機能と機能障害のマーカーを縦断的に同定し、高価な2D心エコー検査の必要を回避します。

拡張期機能障害はPH-LHDの重要な特徴であり、受動的心室硬さの増加と能動的弛緩の障害を特徴とします。左心室の拡張期コンプライアンスの低下は、安静時(≥15 mmHg)および運動時(≥25 mmHg)で左心室拡張末期圧(LVEDP)および肺毛細血管楔形圧(PCWP)が上昇します。これらはHFpEFの診断であり、PH-LHDの前駆体ですが、侵襲的技術や高度な画像診断法なしには判定が難しいです(^17,18).これらの値を取...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔装置	VetEquip Inc.	901806
コンピュータ	デル	7420プラス
綿棒	ピューリタン医療製品会社	806-WC
脱毛クリーム	チャーチとドワイト	300725
ドップラープローブ10MHzおよび20MHz	インダス・インスツルメンツ	NA
ドップラー装置	インダス・インスツルメンツ	NA
心電図パッド	インダス・インスツルメンツ	NA
電極ゲル	パーカー研究所	45993
イソフルラン・ヴェポライザー	VetEquip Inc.	911103
超音波ジェル	パーカー研究所	45659
換気式麻酔誘導チャンバー	VetEquip Inc.	942102