脊髄損傷後の認知障害に対する電気鍼治療

サマリー

本研究は、脊髄損傷後の認知障害を治療するための標準化された電気鍼治療手法を確立しました。さらに、電気鍼治療の認知障害改善効果を評価するためのY迷路および新しい物体認識実験のプロトコルについても詳細に説明されました。

要約

脊髄損傷(SCI)は中枢神経系(CNS)に非常に障害を及ぼし破壊的な疾患であり、四肢の運動障害や感覚機能障害を引き起こすだけでなく、海馬や皮質の構造や機能を乱し、認知機能障害を引き起こし、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。したがって、効果的な治療法や評価方法を探ることが不可欠です。電気鍼治療(EA)は、従来の鍼治療と現代の電気療法技術を統合した新しい治療法であり、高い安全性と副作用の少ないという利点を持ち、脊髄損傷の管理に広く用いられています。伝統中国医学(TCM)の理論によれば、長管は脳と脊髄をつなぐものです。したがって、ガバナー血管の経位にEAを施すことで、脳と脊髄の機能を効果的に回復させることができます。このプロトコルでは、アレンの手法を用いてSCIモデルを構築しました。私たちは、SCIラットの認知障害を治療することを目的としたEA手技を導入しました。さらに、Y mazeおよび新規物体認識(NOR)実験の運用過程を詳細に記述し、EAがラットの認知障害改善にどの程度効果があるか評価しました。本研究は、SCI後の認知障害の参考となる治療プロトコルを提供するだけでなく、この疾患に対する治療戦略の検証とその後の研究探求のための予備的な実験的支援も提供します。

概要

脊髄損傷(SCI)は、一般的に外的力によって脊髄やその周囲の構造が損傷することに起因する中枢神経系(CNS)の一般的な障害です。この状態は損傷レベル¹以下で感覚、運動、自律神経機能障害を引き起こすことがあります。さらに重要なのは、脊髄損傷が不安、うつ病、認知障害といった二次的な合併症を引き起こすこと^{があり、これらは}患者のリハビリに悪影響を及ぼし、生活の質を著しく低下させることです。複数の疫学研究では、SCI患者のアルツハイマー病(AD)のリスクが一般集団よりもかなり高いことが示^{されています。}別の研究では、SCI患者の認知障害の発生率が最大60%に達する可能性があることが確認されています^5,7。SCIは運動皮質の萎縮を引き起こすだけでなく、認知機能に関連する脳領域の神経活動も低下させます⁸。脊髄損傷後の海馬、視床、皮質の炎症増加は認知障害の重要な要因と考えられています(^9,10,11)。認知障害などSCIに関連する合併症の改善は、患者のリハビリテーションを促進し、社会復帰を促進するために不可欠です。

鍼治療は伝統中国医学(TCM)の重要な要素であり、その卓越した臨床効果で知られています。電気鍼治療(EA)は、伝統的な鍼治療と現代的な電気療法技術を統合した革新的な治療法^です。特定の経穴に低電圧電流を流すことで神経や筋肉を刺激し、慢性疼痛や神経系損傷後の機能回復に治療効果をもたらします 13,14,15。多くの研究で、EAは脊髄損傷後の神経機能回復を促進し、神経障害性疼痛、神経原性膀胱、痙縮などの合併症を軽減できることが示されています16,17,18,19。中医の理論によれば、ガバナー・ヴェッセルは脳と脊髄に接続しており、^{その機能に影響を与え}ています。大追(GV14)および明門(GV4)経位にEAを施すことで、神経炎症を緩和しグリア瘢痕の形成を抑制することで、^SCI後の運動機能回復を促進することがわかりました。さらに、我々の研究により、白匯(GV20)および銀堂(GV29)経穴の経位を用いた経理が、ADモデルマウスの認知能力を向上させることが明らかになりました^22,23。それにもかかわらず、脊髄損傷後の認知障害に対処するためのEAの可能性は十分に探求されていません。

本研究では、経位選択、鍼灸角度、治療期間などを含む、SCIラットの認知障害治療におけるEAの運用方法について説明します。さらに、Y迷路検査とNOR検査、病理学的評価を用いて、EAの認知障害治療の有効性を評価しました。本研究は、この疾患の臨床治療の参考文献を提供することを目的としています。

プロトコル

すべての実験手順は、国立衛生研究所の実験動物ケア・利用ガイドラインに厳格に従って実施され、北京中医薬大学動物倫理委員会(承認番号:BUCM-2024042505-2065)によって承認されました。

1. 動物の調理

1. 実験用に220.0g±20.0gの成体オスSprague Dawley (SD)ラットを選定しました。
2. 動物たちは北京中医薬大学実験動物センターで、温度管理された24 ± 2°C、12時間の暗光サイクルで飼育し、無菌飲料水と標準的なペレット食を 自由に提供します。
3. 実験前に7日間、すべての動物を環境に慣らしてください。
4. 24匹のSDラットをランダムに3つのグループ(各グループにn=8匹)分けます:偽手術(Sham)グループ、SCIモデル(モデル)グループ、そして電気鍼(EA)グループです。実験設計の時間軸図は 図1に示されています。

2. SCIモデルの確立

注:手術の8時間前、ラットは水分と食事を奪われ、手術器具は高温蒸気で滅菌されました。SCIモデルはアレンの方法²⁴の改良を用いて構築されました。

1. ラットを麻酔誘導ボックスに入れ、4%イソフルランを含む酸素(1L/分)で完全に麻酔されるまで誘導します。
2. 誘導ボックスからラットを取り出し、鼻と口を麻酔マスクに当てます。麻酔を維持するためにイソフルラン濃度を1.5%〜2%に調整してください。
   注意:ラットの麻酔過程では、ラットの状態を注意深く監視することが不可欠です。ラットが浅く速い呼吸や体温低下を示す場合は、過麻酔を避けるためにイソフルラン濃度を減らしてください。
3. ラットの背中の毛を剃って手術部位を完全に露出させます。手術部位をヨードフォルとアルコールで消毒してください。
4. 第10胸椎(T10)を位置づけてください。T10を中心に2.5cmの中央縦切開を開いてください。
5. 手術用刃を使って背中の筋肉を分離し、棘突起と胸椎に隣接する筋肉を露出させます。止血鉗子でT10の棘突起と椎板を除去し、約10mmの脊髄の区間を露出させます。
6. 改型アレン装置を用いて露出した硬膜(200キロダイン)に正確に衝撃を与え、中程度の打撲を誘発します。
   注:SCIモデルの成功は、損傷部位の硬膜のうっ血と浮腫、そして尾の痙攣スイングによって特徴づけられます。シャム群では、同じ外科的処置を受け、椎板の摘出も含まれていましたが、脊髄は損傷しませんでした。
7. 硬膜をゼラチンスポンジで覆い、傷口を層ごとに縫合します。
8. ラットを37°Cに設定した一定温度の温熱パッドに置き、意識を取り戻すまで観察します。
9. 感染を防ぐため、手術後3日間、ラットの筋肉にペニシリンナトリウム注射を1日1回投与してください。さらに、排尿を促すために1日2〜3回膀胱マッサージを行ってください。

3. EA治療

1. SCIモデルを確立した後、24時間後にEA介入を実施してください。
2. 使い捨ての滅菌鍼(直径:0.30mm、長さ:25mm)を準備します。
3. 中医理論と臨床経験に基づき、EA治療には白匯(GV20)、大追(GV14)、明門(GV4)経穴を選択します。
4. 黒いシルクの靴下を用意してください。ネズミを誘導して黒いストッキングに穴を開けさせてください。ネズミを結び、タイで板に固定します。
   注意:ロープは、ラットが過度にきつく縛られて窒息したり、過度に緩んだ縛りで逃げ出したりしないように、適度に締める必要があります。
5. GV20の経位は頭頂骨の中心、額の正中線と両耳先をつなぐ線の中点の交差点に位置します。GV14は、第7頸椎(C7)と第1胸椎(T1)の間に、背中の正中線上に位置します。GV4は、背中の正中線上にある第2腰椎(L2)の棘突起の下のくぼみに位置します(図2)。
6. 経穴を医療用ヨードフォルと75%医療用アルコールで消毒してください。
7. 針を斜めに下向きに、15°の角度で2〜3mmの深さでGV20に差し込みます。針をGV14およびGV4のポイントに45°の角度で、深さ5〜7mmで挿入します(図3A)。
8. 針をEA治療装置に2 Hzの周波数、1 mAの強度で接続します。波形を連続波として選択します(図3B、C)。
   注:このEA介入は28日間毎日実施され、各セッションは20分間でした。シャム群とモデル群のラットは処置を受けませんでしたが、EA群と同じ方法で毎日20分間動けなくされました。

4. 運動機能の評価(図4)

注:手術後1^日目、7^日目、14^日目、21^日目、28^日目 に、各グループのラットの運動機能がBasso, Beattie, and Bresnahan(BBB)スコアで評価されました。

1. ネズミは自由に動けるように、開けて静かな場所に置いてください。
2. ラットの後肢の動きを観察し、確立されたスケール²⁵に従ってスコアをつけます。
   注:ラットのグループ分けを知らなかった2人の研究者が独立してスコアを割り当て、各ラットの最終スコアを評価の平均として算出しました。

5. Y迷路実験の実施(図5)

注:EA介入の初日(実験29^日 目)にY迷路実験が実施され、自発交替試験と新規腕探索試験が含まれていました。Y迷路の実験手順は 図5Aに示されています。

1. 実験用の動物ケージを実験環境に置き、30分間慣れさせます。
2. Yミーズ装置をアルコールで清掃し、Yミーズの3本の腕をスタートアーム、ノベルアーム、そしてもう一方のアームにランダムに配置します。
3. 自発的な交互試験段階では、新しいアームにバッフルを取り付けます。
4. ラットをスタートアームの先端に優しく置き、両腕で自由に探索させて10分間過ごします。ラットがスタートアームともう一方のアームに入る時間、距離、停留時間を記録してください。
5. 各ラットが検査を終えた後、チャンバー内の排泄物をすべて除去します。チャンバー内部を75%の医療用アルコールで清掃し、清潔なガーゼで乾燥させて、過去の被験者が残した臭いの妨害を防ぎます。実験中は室内環境を静かに保ちましょう。
6. バッフルを取り外し、自発交替実験の4時間後に新しい腕探索実験を行います。
7. ネズミをスタートアームの先端に優しく置き、3本のアームで自由に探索させて5分間過ごします。
8. 5分以内に各腕に入ったラットの順序、入り回数、距離、滞在時間を記録します。

6. 新しい物体認識(NOR)実験の実施(図6)

注:EA介入の2日目(実験30^日 目)にNOR実験が実施されました。NORの実験手順は 図6Aに示されています。

1. 70cm×60cm×30cmのボックス、青い立方体、赤い円筒形の物体からなる実験装置を準備します。
2. 実験用の箱にラットを入れて、10分間自由に周囲を探索させてください。
3. 上記の実験が1時間終わった後、実験箱の壁から約10cm離れた2つの角に対称に同一の立方体体を2つ置きます。
4. ラットを実験箱に、頭をオブジェクトブロックから離して配置します。ネズミが10分間自由に周囲を探索させて、オブジェクトブロックに慣れさせてください。
5. 各ラットの試験終了後は、残留臭いが後続のラットの行動に与える影響を最小限に抑えるため、実験箱をアルコールでしっかりと拭き取ってください。箱が乾いたら、次のネズミを入れます。
6. 上記の実験が4時間終わったら、右側のオブジェクトブロックを円筒形のオブジェクトに置き換えます。
7. ネズミを実験用の箱に再導入し、頭はオブジェクトブロックの壁から反対側を向いています。ラットが箱の中で5分間自由に探索できるようにしてください。
8. 円筒形および立方体の物体を探索した時間、そして総距離と時間を記録してください。優先指数は次の式で計算します:(新しい物体探索時間 - 旧物体探索時間)/(新しい物体探索時間+旧物体探索時間)×100%。

7. ショ糖好み検査の実施

注:単一ケージの飼育は、飲み行動を混乱させる可能性のある水を巡る社会的競争を防ぐために利用されています。

1. 1%ショ糖溶液のボトルと水道水のボトルを用意します。
2. 砂糖溶液と水道水のボトルをケージに入れ、12時間ごとに位置を入れ替えてください。
3. ラットが砂糖水と水道水に48時間慣れるまで待ってください。その後、断食せずに24時間水を飲ませません。
4. ケージに戻して砂糖水と水道水のボトルを入れます。2時間後にボトルの位置を変え、4時間にわたって各液体の消費を記録します。(ショ糖溶液摂取量/ショ糖溶液摂取量+水分摂取量)×100%の式で抽出します。

8. 海馬のHE染色

1. 行動検査後、ラットに3%フェノバルビタールナトリウム(2.0 mL/kg)で麻酔します。パラホルムアルデヒドを用いた心臓灌流を行います。脳組織を取り、パラフィンに埋め込む。厚さ5μmのスライスを準備します。
   注意:パラフォーマルデヒドは刺激物であり、換気の良い環境で取り扱う必要があります。
2. スライスをキシレン(I)とキシレン(II)で10分間連続して脱脂します。スライスをグラデーションアルコールに浸して脱水し、各グラデーションは3分間持続します。最後に、スライスを蒸留水に2分間浸します。
3. スライスをヘマトキシリン溶液で10分間染めます。余った溶液を水で1〜3分洗い流します。スライドを塩酸エタノールに素早く5〜10秒浸します。スライドをもう一度水ですすいでください。
4. スライスを弱アルカリ水溶液に移し青色リターンします。スライスを水で1〜3分洗い流します。スライスを85%エタノールに3〜5分間浸します。
5. スライスをエオシン溶液で3〜5分染め、洗った後はグラデーションアルコールで脱水します。スライスをキシレンに5〜10分浸します。最後に、スライスを密封するために中性樹脂を使ってください。
6. 染色されたスライドを400×倍率の光学顕微鏡で調べます。

9. ELISA解析

1. 行動検査後、ペントバルビタールナトリウム(200 mg/kg)腹腔内注射でラットを安楽死させます。海馬組織を採取してください。
2. 海馬組織を重量し、事前に冷却された均質化チューブに移します。
3. 組織ホモジナイザーを使って氷の上で組織を均質化します。
4. ホモジネートを5000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。 上澄液を採取し、総タンパク質濃度を測定します。
5. ELISAキットを用いて海馬内のIL-1βおよびIL-6の濃度を測定します。

10. 統計解析

1. 統計分析には適切な統計分析ソフトウェアを使用してください。データを標準偏差±平均として表現します。
2. BBBスコアデータにおけるグループ間の差異を分析するために、重複測定と最低有意差検定(LSD)を用いた双方向分散分析(ANOVA)を実施します。
3. LSD法を用いて一方向ANOVAを行い、データが正規分布または均質分散の他の試験のグループ間のばらつきを比較します。そうでなければ、ノンパラメトリック検定を実施してください。
4. データが正規分布に適合する場合は、ピアソン相関解析を行います。そうでなければ、スピアマン相関解析を行う。
5. Pが0.05<とき、統計的に有意な差と考えます。

結果

EAはSCIラットの運動機能を向上させます
SCI操作の^1日後、 モデルグループのBBBスコアは0となり、SCIモデルの確立が成功したことを示しています。手術後1^日目、7^日目、14^日目、21^日目、28^日目 を通じて、モデルグループのBBBスコアはシャムグループよりも有意に低く(P < 0.01)。特に、手術後7^日目、14^日目、28^日目 に、EAグループのBBBスコアはモデルグループよりも有意に高かった(P < 0.01;図4)。

EAはSCIラットの認知機能を高めます
Y迷路実験の結果(図5A

ディスカッション

脊髄損傷は患者の生理学や心理に深刻なトラウマを与えるストレスイベントであり、運動や感覚障害だけでなく認知障害にもつながります^。報告された⁴によると、SCI後の認知機能低下リスクは健康な人の13倍に高くなっています。中高年のSCI患者は、^SCIを経験していない同年代の患者と比べてADに対する感受性が高いです。怪我の後、SCI患者は新しい生活習慣に適応し、社会に再統合しなければなりません。しかし、認知機能の障害はこの過程を妨げ、リハビリテーションに悪影響を及ぼすことがあります。したがって、SCI患者のリハビリテーションにおける効果的な治療法を模索することが重要です。中医の特有療法であるEAは、鍼穴に特定の刺激を加えることで臓器機能を高め、神経精神疾患に関連する症状を効果的に緩和します(^26,27)。本研究は、脊髄損傷...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9% 生理食塩水	北京索萊包科技有限公司	IN9000, P1022-10
4% パラホルムアルデヒド	ビヨタイム	P0099
75%医療用アルコール、ヨードフォル	北京欧北生物科学技術有限公司	OB40126-1、HX0098A	消毒に使用
鍼治療針	中炎太和有限公司	ZY500
小動物用麻酔装置	上海玉炎インスツルメンツ有限公司	ABM(反発ミサイル)
動物行動分析システム	北京中石帝創科技有限公司	ZS-XWT-II
遠心機	エッペンドルフ、ドイツ	5811FR080384
電気鍼治療器具	汕頭医療機器工場有限公司	6805-D	中古 電気鍼治療のために
ELISAキット	江来生物学科学技術有限公司	JL18365、JL20896	IL-1、IL-6レベルの検出に使用されます
ゼラチンスポンジ	江西湘恩医療技術開発有限公司	24092901
ヘマトキシリン溶液、イオシン溶液	シグマ・オルドリッチ	03971	HE染色に使用
インフィニット・ホライゾン・インパクター	アメリカ合衆国ケンタッキー州レキシントン	IH-0400	脊髄損傷モデルの構築に使用
イソフルラン	深圳瑞沃德生命科学技術有限公司	R510-22-10
顕微鏡	オリンポス
ペニシリンナトリウム	クールアバー	CP8271-5g
フェノバルビタールナトリウム	シグマ・オルドリッチ	P3761
SDラット	四北府(北京)生物学技術有限公司	SCXK2019-0010
SPSS	アイビーエム	バージョン26.0	統計ソフトウェア
蔗糖	北京ソーラーバイオテクノロジー有限公司	S8271
キシレン	上海アラジン生化学技術有限公司	X112050