アミロイドとクロスベータアーキテクチャ

サマリー

アミロイド線維は多数のタンパク質によって形成され、その結果生まれた線維は「クロスβシート」構造を共有しています。ここでは、アミロイド線維のサンプルがどのようにX線ファイバー回折のために準備されるか、またそのパターンがどのように解析されるかを説明します。

要約

アミロイド線維は、誤って折りたたまれた自己組織化されたタンパク質が、明確に定義された反復構造に組織化されています。アルツハイマー病や2型糖尿病などのタンパク質誤折りたたみ疾患において、不溶性アミロイド線維が組織内に沈着する重要な役割でよく知られています。さらに、多くの生物において重要な機能的役割を果たし、強度、足場、防護を提供することがわかっています。アミロイドの最初の構造モデルは、整列したアミロイド線維の束からX線ファイバー回折データを集めたことに基づいています。これにより、一般的なクロスβ構造の初期モデルが生まれ、高配向かつ半結晶性サンプルからのより詳細な回折解析に取って代わられ、ペプチドの反復構造への組織の詳細が得られました。ここでは、これらの線維の基礎構造を決定する方法に焦点を当て、病原性、機能性、合成源からのアミロイド線維の共通の特徴を記述しました。サンプルの準備、データ収集、そしてその後のデータ解析を行い、実験データと比較可能なモデル構造を作成します。

概要

アミロイド線維は、組織の細胞外空間にタンパク質性線維が蓄積するアミロイドーシスと呼ばれる疾患群の中で初めて同定^{されました。}各疾患は、特定の前駆体タンパク質が立体構造変化を起こし、高度に秩序立てた安定したタンパク質線維を形成することによって特徴付けられます ^2,3。より新しい定義では、細胞環境内に蓄積する線維も含まれます。近年では、アミロイド構造を利用して安定性、接着、さらには情報の記憶を提供する機能システムがいくつか特定されています。自己組織化してアミロイド線維を形成できるタンパク質構造は幅広く存在しますが、すべて交差^{β構造を共有し}ています。このクロス・β配置は、アストベリーが鶏卵白⁵で最初に記述し、その後ゲデスがクロスβシルク⁶についてさらに説明しました。このタンパク質構造では、線維は線維軸に垂直に走るβ本の鎖で構成され、それらがβシートとして配列され、側鎖を介して結合して後に立体ファスナー7と呼ばれるものを^{形成します。}これにより、繊維に平行に走る水素結合によって保持された非常に安定した組織が形成され、側鎖8を....

プロトコル

1. X線ファイバー回折のためのファイバーサンプルの準備

1. 選択されたアミロイドゲン系ペプチドの線維形成に最適な条件下で、対象タンパク質またはペプチドを溶解し、電子顕微鏡または原子間力顕微鏡を用いて線維形成を評価します。サンプルの調製方法や画像診断の実施方法の詳細は^他に記載されています。 図1に示すように、繊維が長く、まっすぐで、枝分かれしていないことを確認してください。例えば、 図1 に示された線維は透過電子顕微鏡(TEM)で画像化されました。線維を含む液滴を電子顕微鏡グリッドに置き、ウラニル酢酸¹⁴で負染色します。
   注意:グリッド上の繊維が均等に覆われ分布していることが望ましいです。
2. 理想的にはすべてのファイバー軸が平行なファイバーの束を作るために整列します(図2A)。
   1. キャンドルワックスをホットプレートで溶かして液体になるまでします。ダイヤモンドペンなどのガラスカッターを使い、1mmのホウケイ酸ガラス毛細血管を約2〜3cmの長さに切り、液体のワックスに短く浸します。キャンドルワックスは毛細管作用で引き上げます(毛細血管内....

結果

CcbMet例²⁴: 図1 は、X線ファイバー試料の調製に適したグリッド上で高密度のアミロイド線維を示す電子顕微鏡写真を示しています。 図2 は、繊維サンプル(図2A)、ディスク(図2B)、マット/フィルム(図2C)から生成可能なさまざまなテクスチャを示し、X線ビームの方向を示しています。 図3A は、伸縮フレーム整列されたファイバーから得られる回折パターンを示し( 図2Aにテクスチャ)、特徴的なクロス-ß回折パターンを示し、4.76 Åで観測さ.......

ディスカッション

X線ファイバー回折は、サンプルがアミロイド構造を形成しているかどうかを評価し、線維内の前駆体タンパク質やペプチドの分子組織のさらなる理解を得るために利用できます。ここでは、繊維サンプルをX線ファイバー回折のために準備する方法、データの取得、そして解析の方法を説明しました。重要なのは、得られるデータの品質が個々のファイバー内の順序の両方に依存していることです。したがって、初期のサンプル準備は非常に重要であり、繊維が合成か組織から抽出されたかもデータの質に影響を与えます。過剰な塩分がパターンを隠す可能性があるため、アミロイド線維の最適なバッファーの探求が重要かもしれません。リン酸塩バッファーなどの塩バッファーで作られた繊維の洗浄は、繊維の品質と整列度を改善し、より高品質なデータにつながります。アライメント手法の最適化は、セクション2の方法から選択したり、試料の乾燥を遅らせてアラインメントにより多くの時間を確保することで品質を向上させることもできます。繊維同士の相位が高ければ高いほど回折パターンの向きが良くなり、データからより多くの情報を得ることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.7 mm 径のX線  石英ガラス毛細管	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
ガラス毛細管 1.5 mm ホウケイ酸ガラス	Harvard Apparatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	例、他のメーカーでも入手可能
タンパク質結晶学X線回折計	様々な		様々なメーカー