アミロイドとクロスベータアーキテクチャ

サマリー

アミロイド線維は多数のタンパク質によって形成され、その結果生まれた線維は「クロスβシート」構造を共有しています。ここでは、アミロイド線維のサンプルがどのようにX線ファイバー回折のために準備されるか、またそのパターンがどのように解析されるかを説明します。

要約

アミロイド線維は、誤って折りたたまれた自己組織化されたタンパク質が、明確に定義された反復構造に組織化されています。アルツハイマー病や2型糖尿病などのタンパク質誤折りたたみ疾患において、不溶性アミロイド線維が組織内に沈着する重要な役割でよく知られています。さらに、多くの生物において重要な機能的役割を果たし、強度、足場、防護を提供することがわかっています。アミロイドの最初の構造モデルは、整列したアミロイド線維の束からX線ファイバー回折データを集めたことに基づいています。これにより、一般的なクロスβ構造の初期モデルが生まれ、高配向かつ半結晶性サンプルからのより詳細な回折解析に取って代わられ、ペプチドの反復構造への組織の詳細が得られました。ここでは、これらの線維の基礎構造を決定する方法に焦点を当て、病原性、機能性、合成源からのアミロイド線維の共通の特徴を記述しました。サンプルの準備、データ収集、そしてその後のデータ解析を行い、実験データと比較可能なモデル構造を作成します。

概要

アミロイド線維は、組織の細胞外空間にタンパク質性線維が蓄積するアミロイドーシスと呼ばれる疾患群の中で初めて同定^{されました。}各疾患は、特定の前駆体タンパク質が立体構造変化を起こし、高度に秩序立てた安定したタンパク質線維を形成することによって特徴付けられます ^2,3。より新しい定義では、細胞環境内に蓄積する線維も含まれます。近年では、アミロイド構造を利用して安定性、接着、さらには情報の記憶を提供する機能システムがいくつか特定されています。自己組織化してアミロイド線維を形成できるタンパク質構造は幅広く存在しますが、すべて交差^{β構造を共有し}ています。このクロス・β配置は、アストベリーが鶏卵白⁵で最初に記述し、その後ゲデスがクロスβシルク⁶についてさらに説明しました。このタンパク質構造では、線維は線維軸に垂直に走るβ本の鎖で構成され、それらがβシートとして配列され、側鎖を介して結合して後に立体ファスナー7と呼ばれるものを^{形成します。}これにより、繊維に平行に走る水素結合によって保持された非常に安定した組織が形成され、側鎖8を通じた疎水性、静電性、極性の相互作用が並行^{しています。}

初期の構造研究では、X線ファイバー回折を用いてアミロイド線維の構造を調べ、線維を整列・配向してアミロイド線維の束を形成し、回折計^9,10のX線ビーム内に配置しました。ヒトの病変組織から抽出された複数のアミロイド線維から回折パターンに適合するように、アミロイド線維の一般的な構造が生成され^、これがさらなる構造記述の基礎となりました^。近年、固体核磁気共鳴(ssNMR)、微結晶X線結晶学、低温電子顕微鏡(CryoEM)の進展により、クロスβ構造¹¹の原子詳細が明らかになりました。しかし、X線ファイバー回折法は依然として重要かつ有用であり、タンパク質の繰り返し的な組織化に関する情報を提供します。さらに、場合によっては、より長距離のオーダーに関する情報もアクセス可能になることがあります。基本的に、X線ファイバー回折は異なるタンパク質から形成されるアミロイド線維の存在を確認するためによく用いられ、交差βパターンは繊維状のアセンブリがアミロイド¹²として分類されるための主要な要件の一つです。

ここでは、アミロイド線維を製備し、X線ファイバー回折データ収集のために整列させる方法について説明します。さらに、回折データをさらに解析してモデル構造、予測回折パターン、そして 体外由来のフィブリルからの回折データとの比較についても詳細に示します。

プロトコル

1. X線ファイバー回折のためのファイバーサンプルの準備

1. 選択されたアミロイドゲン系ペプチドの線維形成に最適な条件下で、対象タンパク質またはペプチドを溶解し、電子顕微鏡または原子間力顕微鏡を用いて線維形成を評価します。サンプルの調製方法や画像診断の実施方法の詳細は^他に記載されています。 図1に示すように、繊維が長く、まっすぐで、枝分かれしていないことを確認してください。例えば、 図1 に示された線維は透過電子顕微鏡(TEM)で画像化されました。線維を含む液滴を電子顕微鏡グリッドに置き、ウラニル酢酸¹⁴で負染色します。
   注意:グリッド上の繊維が均等に覆われ分布していることが望ましいです。
2. 理想的にはすべてのファイバー軸が平行なファイバーの束を作るために整列します(図2A)。
   1. キャンドルワックスをホットプレートで溶かして液体になるまでします。ダイヤモンドペンなどのガラスカッターを使い、1mmのホウケイ酸ガラス毛細血管を約2〜3cmの長さに切り、液体のワックスに短く浸します。キャンドルワックスは毛細管作用で引き上げます(毛細血管内で約1〜2mmの長さ)。繊維懸濁液が均等に休むように、蝋の表面が平らであることを確認しましょう。
   2. プラチシンを使って、ワックスで満たされた端の間に0.5mmから2mmの隙間を設けて、ペトリ皿内で密封された毛細血管を水平に取り付けます(図2A)。
   3. ピペットを使い、2つの毛細血管のワックスで満たされた端の間に10μLの溶液液滴を慎重に吊るします。溶液がワックスの両端に接触しつつ、ガラスにまで及ばないようにしてください。
   4. ペトリ皿を覆ってサンプルをほこりから守りましょう。試料を一晩蒸発させ、線維の整列を行います( 図2A参照)。
      注意:サンプルが完全に乾燥するまでに数日かかることがあり、これは周囲の温度や湿度、サンプルの粘度によって異なります。
   5. プレートを封印してください;冷蔵庫で低温で培養するか、密閉箱で湿度を保って乾燥を遅らせることで、サンプルの整列が良くなることがあります。
3. ガラス毛細血管内のアミロイド線維を整列させます(図2B)。
   1. 直径0.7mmのシリコンガラス毛細血管に1mLの注射器を小さなゴムチューブを取り付け、2〜3cmの線維懸濁液を吸引します。
   2. 毛細管の片端を溶かしたワックスで密閉し、もう片端を開いたままにして蒸発させてください。毛細血管を垂直に配置し、数日から数週間かけて乾燥させ、毛細血管管内に乾燥した円盤状に形成します(図2B)。
4. 線維を「マット」または薄膜状に整列させます(図2C)。
   1. 高濃度(例:>10 mg/mL)のフィブリルサンプルをガラススライド、パラフィルム、またはテフロン片に置き、蓋をして少なくとも24時間自然乾燥させます。これが乾燥して表面に薄く平らな膜が形成されるはずです。これをメスで慎重に持ち上げ、接着剤やスリシンでガラスの毛細管に取り付けます。
   2. マットにはランダムな繊維の配置があります( 図2C参照)。試料をゴニオメーターのヘッドに慎重に取り付け、X線ビームが試料の端を通り、フィルムの平面に平行になるようにします(図2C)。
      注意:フィルムの表面を通過する回折はランダムな整列により回折リングを生じさせます( 図2C参照)。
5. サンプルを調べろ。
   1. 光学顕微鏡下で交差偏光器を通して試料の整列を調査します。複屈折が認められる場合、線維束に良好な整列がある可能性が高いです。
   2. 毛細管繊維のサンプルをプラチシンでゴニオメーターのヘッドに取り付けます。試料をX線ビームに置く際、繊維束、マット、ディスクのいずれかであるかを考慮してください。
      1. サンプルの回転軸はファイバー束の周りに位置します(図2A)、円盤では繊維は管の直径に沿って整列する傾向があります(図2B)。マットはフィルム面に平行で垂直な2つの明確な方向を持ちます(図2C)。
   3. 社内のX線装置(タンパク質結晶学用にCuKα)またはシンクロトロン放射を用いて回折パターン( 図3A参照)を収集します。露光時間はX線ビームの強度によって異なります。回折源の推奨収集時間に応じて調整します。

2. データ分析

1. データ分析におけるCLEARERの使用¹⁵.
   注:X線ファイバー回折パターン解析プログラムは、対応著者から学術ユーザーに無料で利用可能です。回折解析のための他の手法も利用可能です^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸。括弧内の斜体はメニューコマンドを示します。
   1. 回折パターンを.tiffファイルに変換し、CLEARERにアップロードします(図4)。
   2. 回折設定(回折パターン:回折設定)を入力し、TIFF画像のピクセルサイズ、X線ソース、試料と検出器までの距離を入力します。
   3. 回折パターンが経絡が垂直になるように配置されていることを確認してください(画像処理:回転)。セン タリングモジュール(回折パターン:センター画像) を使って画像をセンタリングします。2つの主要な軸(子午線と赤道)を定義します:- このモジュールはパターンのこれら2つの軸に沿った強度を比較します。センタリングが完了したら、画像を保存し、次のステップで必ず活用してください。
   4. 適切な角度(2つの主軸[子午線と赤道]に沿って設定)を指定し、 回折平均モジュール (回折パターン:半径平均)を用いて回折信号の位置と強度を示すグラフを出力します(図4A)。
   5. ピークファインモジュール(回折パターン:ラジアル平均:ピークアインド)(図4B)を使って回折信号位置を測定し、自動的に出力します。ピークサーチ幅を調整しつつ、ノイズが検出されないようにして、すべての回折信号が正確に検出されていることを確認します。
   6. Zoom & Measureモジュール(回折パターン:Zoom & Measure)を使ってピークファイントで出力される信号位置を確認します。すべての信号位置が記載され、正しい軸に割り当てられているか確認してください。
   7. 観測回折信号を生成する単位セル寸法(b および c)を、 Unit Cell Optimizationモジュール (回折パターン:Unit Cell Optimization)(図5A)を用いて探索してください。赤道で検出された強い信号を調べ、単位格子入力表に入力するための初期推測を生成し、CLEARERが潜在的なセルを探す最小および最大[hkl] 指数を指定します(次元は子午線方向で、デフォルトは4.76 Åです)。
   8. ポテンシャル単位セルの寸法を計算し、予測された回折信号位置と観測された反射を比較します。単位胞は予測信号と実験信号の一致度に応じてスコアが付けられます。その後、上位20試合が表示されます。ペプチド前駆体長や電子顕微鏡、AFM、固体核磁気共鳴(ssNMR)などの情報を考慮し、データと試料に最適な単位格子を選ぶのに役立ちます。

3. CLEARERを用いた構造モデリングとモデルのテスト

1. 分子モデル(PDB形式)を構築する。
   注意:Pymol(DeLano)¹⁹ やInsight II(Accelerys)などのタンパク質モデリングプログラムを活用し、β鎖構造およびβシート配置で前駆体ペプチドのPDB座標を生成する。この節では、直交方位単位格(すべて90°角)に用いられる簡単な過程について説明します。回折に関するより専門的な知識が必要な場合には、非直交組織も可能です。これらはより複雑な単位格についてはCLEARERで探ることができます。
   1. ペプチドをβシート状に三次元配置し、決定された単位セルに収めます。このモデルにセル内の対称性に関連するすべてのオブジェクトが含まれていることを確認してください。
   2. PDBモデルを 構造チェーンジェネレーターモジュール(回折シミュレーション:構造:構造チェーンジェネレーター)に読み込み、構築された構造座標を確認します。ファイバー軸とビーム軸が正しく割り当てられていることを確認してください。決定した単位格の寸法を入力します。選択セルの寸法で衝突が発生するかどうかを確認してください(図5B)。
   3. PDBモデルの座標を ファイバー回折シミュレーションモジュール (回折シミュレーション:ファイバー回折シミュレーション)にアップロードしてください。
      1. ファイバー軸の方向、ビームの向き、ステップ3.1.2から選択した単位セル寸法、X線源と検出器の設定を入力し、 シミュレートをクリックします。直交方位胞シミュレーションでは、ファイバー軸は使用されるモデル内のファイバー軸の向きに関連するデカルト軸によって定義されます。
      2. ビーム軸がファイバー軸に垂直であることを確認してください。すなわち、他の2つの可能な軸のいずれかに垂直であることを確認してください。シミュレーション設定を.htmlファイル(ファイル:名前を付けて保存)として保存してください。これらは後でアップロード・編集することで、最適なモデル構造を反復的に探求できます。
      3. 得られたシミュレーションパターンを生の形式で保存し、後でアップロードしてさらなる分析に備えるか、.tiffとして保存してください(この形式では追加のコントラスト情報が破棄されます)(シミュレーション:表示可能な画像をTIFFとして保存)。次に、これらを実験パターンと比較してください。
2. シミュレーション回折パターンと実験パターンを比較して提示します。
   1. ステップ2.1.5-2.1.6を用いてシミュレーション回折信号を測定し、実験パターンから測定したものと比較してください(図6)。これらをテーブルに記録してください。
   2. 「レイヤー(回折パターン:レイヤー)」というモジュールを使って、シミュレート済みおよび実験パターンを重ね合わせて信号位置を比較してください(図6C)。
   3. 実験パターンとシミュレーションパターンの信号位置と相対的な強度を比較するために、シミュレーションパターンの象限を実験パターンと並べて配置します(図6B参照)^8,20,21。
   4. 提案された単位格子とモデルの妥当性を評価し、シミュレーションされたパターンと実験回折パターンの類似性を改善するためにモデルとセルを反復的に修正します。
   5. ステップ3.1で示された手順を用いて、異なるモデルやセルの結果を広範に比較し、いくつかの代替案を検証します。TEM、AFM、NMRなど他の手法から収集された情報がモデリングを制約し^{、データに}適合する最良の構造表現に到達すると考えられていることを確認し^{ましょう。}

結果

CcbMet例²⁴: 図1 は、X線ファイバー試料の調製に適したグリッド上で高密度のアミロイド線維を示す電子顕微鏡写真を示しています。 図2 は、繊維サンプル(図2A)、ディスク(図2B)、マット/フィルム(図2C)から生成可能なさまざまなテクスチャを示し、X線ビームの方向を示しています。 図3A は、伸縮フレーム整列されたファイバーから得られる回折パターンを示し( 図2Aにテクスチャ)、特徴的なクロス-ß回折パターンを示し、4.76 Åで観測さ...

ディスカッション

X線ファイバー回折は、サンプルがアミロイド構造を形成しているかどうかを評価し、線維内の前駆体タンパク質やペプチドの分子組織のさらなる理解を得るために利用できます。ここでは、繊維サンプルをX線ファイバー回折のために準備する方法、データの取得、そして解析の方法を説明しました。重要なのは、得られるデータの品質が個々のファイバー内の順序の両方に依存していることです。したがって、初期のサンプル準備は非常に重要であり、繊維が合成か組織から抽出されたかもデータの質に影響を与えます。過剰な塩分がパターンを隠す可能性があるため、アミロイド線維の最適なバッファーの探求が重要かもしれません。リン酸塩バッファーなどの塩バッファーで作られた繊維の洗浄は、繊維の品質と整列度を改善し、より高品質なデータにつながります。アライメント手法の最適化は、セクション2の方法から選択したり、試料の乾燥を遅らせてアラインメントにより多くの時間を確保することで品質を向上させることもできます。繊維同士の相位が高ければ高いほど回折パターンの向きが良くなり、データからより多くの情報を得ることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.7 mm 径のX線  石英ガラス毛細管	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlin, Germany	Q-07-001-80
ガラス毛細管 1.5 mm ホウケイ酸ガラス	Harvard Apparatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	例、他のメーカーでも入手可能
タンパク質結晶学X線回折計	様々な		様々なメーカー