質量分析によるプラズマプロテオミクスの包括的なワークフロー:全身性ヒト疾患におけるバイオマーカー発見の戦略

サマリー

血漿プロテオミクスは、低侵襲サンプリングを通じて全身性疾患のバイオマーカー発見を可能にします。プラズマの複雑さによる分析上の課題にもかかわらず、本研究は最適化された液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)ワークフローを提供し、プロテオームのカバレッジを強化し、変動を低減し再現性を向上させ、疾病サンプルと対照サンプル間の正確な比較を可能にします。

要約

血漿は血液の細胞外成分であり、低侵襲で豊富な生体分子情報源を提供し、全身性疾患の調査に理想的です。ハイスループットプロテオミクス技術の登場により、循環中のタンパク質の大規模同定と定量化が可能となり、血漿分析に革命をもたらしました。これらの進歩により、がんや炎症性疾患を含むさまざまな疾患の早期診断、予後、治療的標的化のためのバイオマーカー発見が促進されました。しかし、プラズマの本質的な複雑さとサンプルの調製・分析方法の不一致により、プロテオームのカバー範囲や再現性は歴史的に制限されてきました。初期の粗プラズマ分析を用いたアプローチは、一貫性が低く、バッチ効果が顕著で、臨床コホート間の信頼できる比較研究を妨げていました。

これらの制約を克服するために、本研究では堅牢でスケーラブルなプラズマプロテオミクスワークフローを導入しています。このプロトコルは、免疫除去、分子量カットオフろ過、凍結乾燥、タンパク質の定量および正規化、酵素的消化、LC-MS/MSプロファイリングなどの主要な調製ステップを統合しています。この最適化された戦略によりプロテオームの深さが大幅に向上し、変動性を低減することで、疾患症例と健康対照群間のより正確かつ再現性の高い差別タンパク質発現解析が可能になります。このワークフローは、プラズマから高品質なプロテオミクスデータを生成しようとする研究者にとって貴重なプラットフォームを提供し、最終的にはバイオマーカー駆動型診断や個別化医療の発展に寄与します。

概要

血漿は血液の細胞外成分であり、疾病研究に関連する生物学的情報の蓄積源としてますます認知されています。タンパク質や代謝物から脂質や核酸に至るまで、多様な循環生体分子を運び、生物の生理学的・病理的状態を反映しています。この血漿の全身的な性質は、がんから代謝・炎症性疾患に至るまで、疾患の病態生理を調査するのに理想的な生体標本となっています。血漿をサンプルとして使用する主な利点は、低侵襲の採取方法であり、臨床現場での繰り返し採取が可能であり、疾患の進行や治療反応の観察に重要です。しかし、血漿は非常に複雑なプロテオームマトリックスを示しており、アルブミンや免疫グロブリンなどのタンパク質レベルが10桁以上にわたって存在し、同定を覆い隠^{しています。}

過去20年間で、プラズマプロテオミクスにより、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン(β-hCG)やトロポニンIなどの臨床的に関連したバイオマーカーの同定が可能となり、大規模なタンパク質解析技術の進歩により推進されました^。これらのツールは高感度な情報を入力として受け入れ、その高スループット特性により、血漿タンパク質の大規模なプロファイリングを可能にします。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS/MS)プラットフォームの登場により、10〜50μLの血漿入力から数千種のタンパク質を解析可能となり、動的検出範囲は数桁に及ぶ^3,4倍に及ぶ。これにより、トランスレーショナル研究におけるプラズマプロテオミクスの利用が増加しました。早期疾患検出、予後モデルの改善、新たな治療標的の発見など^です5。

この分野で重要な節目となったのは、ヒトプラズマプロテオームプロジェクト(HUPO-HPPP)の設立であり、これにより血漿タンパク質を体系的にカタログ化し、血漿プロテオミクスが確立された分野として実現可能であることが示されました^。その後、臨床プロテオム腫瘍解析コンソーシアム(CPTAC)は、これまでプロテオ^ム研究を混乱させていた再現性の問題に対処するため、厳密に検証されたプロトコルとクロスラボラトリー研究を採用しました。これらの取り組みは標準化の必要性を強調し、均一な血漿取り扱い、豊富なタンパク質の枯渇、酵素的消化、そして一貫したLC-MS/MSパラメータなどの重要な手順を強調しました。Geyerらの最近の研究では、標準化された手法を用いることで多くの個体間で血漿プロテオムシグネチャーが確実に生成できることが示されており、集団レベルの研究やバイオマーカー^{検証プロセスの}基礎となります8。

プラズマプロテオミクスの進展は、品質管理(QC)と性能指標が実験設計の重要な要素として認識されたことで大きく変化してきました。従来、消化効率、ペプチド同定率、計測器性能の違いにより研究ごとに一貫性が欠け、再現性に影響が出てきました。多くの研究がこれらの問題に対処するために行われています。Gaworらは、サンプル準備および質量分析性能に関する測定可能な品質指標を概説し、タンパク質プロファイリングパイプラインの堅牢性を評価する体系的な方法を提供しました^。Tsantilasらは、研究者がプラットフォームや研究所間でデータセットを比較できるコンピュータ化されたベンチマークツールを提示し、プロテオミクスデータの提示における透明性を高めました¹⁰。さらに、免疫枯渇、サイズ排除分画、データ非依存取得(DIA)などの方法論の進歩により、プロテオームのカバー範囲が拡大し、技術的バイアスが減少しました^11,12。このような品質保証措置により、血漿プロテオミクスデータの再現性が保証され、将来の臨床翻訳研究の足場となります。

これらの大きな進歩にもかかわらず、プラズマの本質的な複雑さは依然として課題を抱えています。粗血漿の直接解析では、非常に豊富なタンパク質が低存在量の分析物を圧倒してしまうため、プロテオームのカバー率が最適でないことがよくあります。これらの分析物の多くは最も有望なバイオマーカー候補です。さらに、タンパク質定量の変動、消化の不完全、クリーンアップの不十分さに起因する技術的なばらつきが、バッチアーティファクトやコホート比較可能性の低下に寄与することがあります¹³。これらの制約は、プロテオームの深さ、再現性、スケーラビリティのバランスを取った高度に最適化されたワークフローの必要性を強調しています。本研究プロトコルは、免疫枯渇、分子量カットオフろ過、凍結乾燥、タンパク質正規化・定量、酵素消化、LC-MS/MSプロファイリングを組み合わせた最適化されたプラズマプロテオミクスワークフローを示すことで、このニーズに応えます。プロテオームのカバー範囲を拡大し、技術的なばらつきを減らすことで、この方法論的枠組みは疾患影響群と対照群間の一貫した相対定量化を可能にします。スケーラビリティを導入し、下流解析を受け入れることで、このワークフローはプラズマプロテオミクスから臨床的に重要な情報を抽出するための実用的かつ再現性のある手法を提供します。

プロトコル

このプロトコルは、全身性炎症性疾患におけるバイオマーカー発見のためのプラズマプロテオミクスを強化するための効率的なワークフロー^{を示しています。}この調査は、制度倫理委員会および1975年のヘルシンキ宣言(2000年に改訂)に従って行われました。参加者からインフォームド・コンセントが取得されました。まず、血漿サンプルは高存在量タンパク質を除去するために免疫除去を行い、その後分子量に基づくろ過によってサンプルの複雑さを軽減します。その後、サンプルは凍結乾燥され、タンパク質濃度が下流処理に十分なように定量されます。正規化後、タンパク質はトリプティック消化を受けて分析に適したペプチドを生成します。最後に、質量分析法を用いて低存在量タンパク質を検出・定量し、健康状態と疾患状態の信頼できる比較を促進します(図1)は血液プロテオミクスのパイプラインを示しています。

1. サンプル採取:

1. 無菌条件下で肘部前静脈から静脈穿刺により、エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)真空管の参加者から3 mLの血液を採取します。これは訓練を受けた採血技師によって行われます。
2. プラズマを分離するには、12×15 mLの固定角度ローターで704 gの量で10分間遠心分離します。血漿サンプルは-80°Cの状態で保管し、次の検査まで待ってください。

2. 免疫力低下

注:免疫除去法は、親和性クロマトグラフィーを用いた方法で、血清、血漿、脳脊髄液(CSF)などの生体液から高濃度タンパク質を選択的に除去します。固定抗体を含むスピンカートリッジは、アルブミン、免疫グロブリン(IgG、IgA、IgM)、トランスフェリン、補体C3を含む14種類の一般的な高存在量タンパク質を標的・捕捉します。これらのタンパク質はカートリッジ内に保持され、低存在比のタンパク質はさらなる解析のために通過します。この技術は、サンプルの複雑さを低減し、潜在的なバイオマーカーの検出を改善することでプロテオムプロファイリングを向上させます。このアプローチは感度と再現性を向上させるためにプラズマプロテオミクスで広く採用されています^16,17。

1. カートリッジの準備
   1. 0.45mLのスピンカートリッジを冷蔵庫から取り出してください。周囲温度に均衡するまで放置してください。
   2. 処理したサンプル数に応じてバッファーAのエキル/ロード/ウォッシュとバッファーBの洗脱を準備します。10 μL血漿サンプルあたり、約5 mLのバッファーAと2 mLのバッファーBを塗布します。50mLの無菌遠心分離機チューブにデカントします。
   3. 滅菌のLuer-Lok 5 mL注射器2本をバッファーAのA、バッファーBのBとラベル付けします。
2. プラズマサンプルの調製
   1. 10μLの血漿サンプルを190μLのバッファーAで希釈し、最終体積200μLにします。
      注意:処理中の血漿タンパク質の分解を防ぐために、バッファーAにプロテアーゼ阻害剤を添加してください。
   2. 血漿サンプルには粒子状物質が含まれていることがあります。カートリッジが詰まる可能性があります。詰まりを防ぎ、試料の透明度を向上させるために、希釈した試料を0.22μmのスピンフィルターで1分間、16,000 ×g 、4°Cで遠心分離します。
3. カートリッジのセットアップ
   1. カートリッジキャップと底キャップを外して保管し、後で使うために保管してください。
   2. スピンカートリッジにルアーロックアダプターを取り付けます。
   3. 「A」とラベル付けされた注射器に4mLのバッファーAを取り込み、注射器をルアーロックアダプターに接続します。
   4. バッファーAを徐々にカートリッジ内に流し、樹脂が平衡し、閉じ込められた空気を押しのけます。
   5. 無菌マイクロピペットでカートリッジ上部の余剰バッファーを吸引します。
   6. Luer-Lokアダプターを外し、スピンカートリッジをF1とマークされたスクリューキャップの収集管に注入します。
4. 試料ローディングと分画採取
   1. 200μLのろ過済み希釈血漿を樹脂ベッドに直接加えます。
   2. カートリッジを100 × g で4°Cで1分間遠心分離します。 カートリッジはキャップを開けずに、または緩くキャップを閉めてスムーズな流れを保ちましょう。
   3. ラベル付きの収集管で流通過分率F1を採取します。遠心分離後、樹脂ベッドとフリットが湿った状態を保つようにしてください。
   4. カートリッジを室温で5分間置いてください。
5. 流過分の洗浄と回収
   1. 樹脂床にバッファーA400μLを加え、100× g で4°Cで2.5分間遠心分離します。 このエリュートをF1コレクションチューブに加えます。
   2. カートリッジを新しいF2とラベル付けされた収集チューブに移します。
   3. バッファーAをさらに400μL追加し、100× g で遠心分離機で4°Cで2.5分間過ごします。 F2チューブにエリュートを集めます。
6. 結合タンパク質の洗脱
   1. F2チューブからカートリッジを取り出し、Luer-Lokアダプターを取り付けます。
   2. 「B」とラベル付けされた注射器にバッファーBを2.5mL注ぎ、カートリッジに取り付けます。
   3. バッファーBをゆっくりとカートリッジ内に押し込み、結合した高濃度タンパク質を新しい収集チューブに溶出させます。
      注意:さらなる解析が必要な場合は結合した部分を保存してください;それ以外は適切に破棄してください。
7. カートリッジの再平衡
   1. バッファーB入りの注射器をカートリッジから取り出し、「A」とラベル付けされた5mLのバッファーA入り注射器を装着します。
   2. 緩衝剤Aをゆっくりと樹脂床に押し込み、カートリッジを0.5 mL/分の流量で再平衡させます。
      注意:樹脂ベッドやフリットを乾燥させないでください。保存中はフリットの上に少量のバッファーを残してください。
   3. 平衡が完了すると、カートリッジは次のサンプルの準備が整います。
8. 下流での利用
   1. 低存在比タンパク質の最大回収のために、F1とF2のフロースルー分画を組み合わせてください。
      注意:微分解析が必要な場合は、F1とF2も別々に解析可能です。添加されるバッファーは1 mLであり、良好な回収を確保するために合計F1分率は~850 μLである場合があります。粗血漿、フロースルー、およびソトリウムドデデシル硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を解析し、上位14の高存在比タンパク質の除去を確認します。F1、粗プラズマ、洗出液を通る12.5μLの流量をゲルに充填し、25μLのウェル容積を作ります(Laemmliサンプルバッファー:サンプル比2:1)

3. 5 kDaスピン濃縮体を用いたタンパク質濃度

注:5 kDaスピン濃縮器を用いた試料の濃縮は、サイズ排除と分子ろ過の原理に基づいており、単一のチューブ内で標的生体分子の迅速な濃縮と高い回収を実現しています。これにより、溶媒とバッファーの交換除去やタンパク質溶液の脱塩によってタンパク質の濃縮が可能になります。

1. スピンコンセントレーターに最大4mLのタンパク質サンプルを充填します。
2. スピンコンセントレーターを冷蔵遠心分離機に入れます。
3. 遠心分離機は5,000 g × 10°Cで30分間、または望ましい体積減少(例:30×濃度)が得られるまで続けます。
4. スピン濃縮器を遠心分離機から取り外し、マイクロピペットを使って保持チャンバーの底から濃縮サンプルを回収します。良好な回収を確保するために、合計850μLのタンパク質サンプルから~150μLの濃縮液が回収されることを期待してください。
   注意:タンパク質の完全性と回収効率を維持するために、遠心分離中に膜が乾燥しないように注意してください。

4. 脱塩とバッファー交換

1. 濃縮器の下部チャンバーからろ過液を捨てます。
2. 遠心分離機チューブに50 mMの重炭酸アンモニウムバッファー(pH 7.2-7.4)を同量充填します。(例えば、リテンテートが150μLの場合、バッファーを150μL追加します)
3. 元の濃度に達するまで、5,000 g × 10°Cで再び遠心分離機を行います。
4. このバッファー交換プロセスを3回繰り返し、塩類や尿素などの小分子汚染物質の約99%を除去します。
5. タンパク質サンプルはスピード真空凍結乾燥機で凍結乾燥して濃縮します。
   注意:下流用途に必要な脱塩の程度に応じてサイクル数を調整してください。

5. ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いたタンパク質定量

注:サンプルのタンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイを用いて測定され、標準は牛血清アルブミン(BSA)です。BCAアッセイは、洗剤適合のビシンコニン酸を基とした比色法で、総タンパク質を検出・定量します。この方法は、アルカリ環境下のタンパク質によるCu²⁺をCu⁺に還元する(ビウレット反応)に依存し、その後、ビシンコニン酸を含む試薬を用いて高感度かつ選択的に銅イオン(Cu⁺)を検出します。このアッセイは、1つの銅イオンと2つのBCA分子をキレートさせることで形成される紫色の錯体を生成します。BCAアッセイはBSAと一貫した線形応答を生み出し、信頼性の高い標準曲線基準を保証します。異なるタンパク質がBCAアッセイで異なる反応を示すことは知られていますが、BSAを用いることで多様なサンプル間で再現可能な相対定量が得られます。私たちの目標はすべての種の絶対定量ではなく均等なタンパク質負荷の正規化であったため、BSAベースの校正が最も堅牢で再現性の高いアプローチを提供しました。

1. 手続き
   1. 各BSA標準体(作業範囲20〜2000 μg/mL)を25 μLと未知のタンパク質サンプルを96ウェルプレートの指定されたウェルに加えます。
   2. 各ウェルに200μLのBCA作動試薬を加えます。
   3. マイクロプレートシェーカーで30秒ほどよく混ぜます。
   4. プレートを蓋をして37°Cで30分間培養します。
   5. 皿を室温にしてください。
   6. マイクロプレートリーダーを使って562 nmの吸収を測定します。
2. データ分析
   1. すべてのサンプルおよび標準吸光度値から、空白(ゼロタンパク質)の平均吸光度を差し引きます。
   2. 吸収度とBSA濃度の標準的な曲線(マイクログラム/マイクロリットル)をプロットします。
   3. 曲線の回帰方程式を使って未知のサンプル中のタンパク質濃度を計算します。

6. タンパク質濃度の正規化

1. 手続き
   1. 適切な定量法を用いて各血漿サンプルのタンパク質濃度を測定します。
   2. 各サンプルの濃度と総体積を記録します。
   3. 希釈剤として50 mMの炭酸水素アンモニウムバッファー(pH 7.8)を準備します。
   4. 必要な希釈量は、式 C₁V₁ = C₂V₂ を用いて計算します。
   5. 濃度が1.3 mg/mL、体積が100 μLのサンプルの場合、1 mg/mLに達するために必要な最終体積を計算します:[V₂ = \frac{1.3 × 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. 最終体積から初期体積を差し引いて追加するバッファの体積を計算します:バッファ体積 = 130 μL − 100 μL = 30 μL。
   7. 100μLの血漿サンプルに50 mMの炭酸水素アンモニウム(pH 7.8)を30 μL加えます。
   8. ピペッティングや短時間渦巻でサンプルを優しく混ぜます。
   9. 最終体積が130μLで、標準化濃度1 mg/mLであることを確認してください。
   10. 下流のプロテオミクスサンプル準備を進めてください。
       注意:BCAアッセイの結果に基づいて必要な希釈因子を計算し、正確な濃度調整を確保してください。各ステップは検証され、データは補足データとして提供されます(補足表1)。

7. サンプル調製と三剤分解

1. タンパク質還元
   1. 適切な還元剤(例:1,4-ジチオスレイトール[DTT])を炭酸アンモニウムバッファー液に添加し、最終濃度100 mMにします。
   2. 混合物は60°Cで30分間、サーモミキサーまたは加熱ブロックで孵化します。
      注意:DTTは刺激物であり、排気フード内で手袋を着用して扱うべきです。
      注:消化に使われるトリプシンに関する追加情報は 、材料表に記載されています。簡単に言えば、シーケンシンググレードのトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)処理トリプシン(キモトリプティック活性を除去するため)を用いて、リシンおよびアルギニン残基の切断に対する高い特異性を確保しました。酵素活性はメーカー仕様に基づいて検証されており、N-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)活性は約1単位のタンパク質1mgに相当します。DTTおよびヨウドアセトアミド(IAA)濃度に関しては、100 mM DTTおよび200 mM IAAは反応で使用された最終濃度ではなく、ストック溶液を指していることを確認しています。還元およびアルキル化時の最終的な作動濃度は標準範囲内(通常はそれぞれ5〜10 mM DTTおよび10〜20 mM IAA)でした。
2. システイン残基のアルキ化
   1. 還元後、試料を室温で5分間冷やします。
   2. チューブの底に凝縮液を集めるために短時間遠心分離機を使います。
   3. 50 mMの重炭酸アンモニウム(ABC)バッファーで200 mM IAAを加え、還元システイン残基をアルキル化します。
   4. IAA分解を防ぐため、サンプルは室温の暗い場所で30分間培養します。
      注意:ヨードアセタミドは光に敏感で潜在的に有毒です。露出を避け、暗い光の中で扱いましょう。
3. 酵素的消化
   1. 使用直前に50 mM ABCバッファーでシーケンスグレードの修飾トリプシンを準備します。
   2. 各サンプルにトリプシンを1:25(w/w)の比率で添加します。
   3. 反応を37°Cで17時間培養し、酵素による完全な消化を可能にします。
      注意:消化時間が長くなると消化過多を引き起こす可能性があります。孵化期間中の温度安定性を確保してください。
4. 反応の消滅
   1. 酵素反応を停止させるために、各試料に蟻酸を加えて最終濃度1.0%(v/v)にします。
   2. 37°Cで20分間インキュベートし、残留トリプシンを変性させ、ペプチド混合物を安定化させます。
      注意:蟻酸は腐食性があります。適切な個人用防護具(PPE)を使用し、化学換気フードで作業してください。
5. ペプチド回収
   1. 消化済みペプチド混合物を 3500g で室温で12分間遠心分離し、不溶性物質を除去します。
   2. 消化済みペプチドを含む透明な上清液を、ペレットを乱さずにオートサンプラーバイアルに慎重に移してください。
   3. ペプチド溶液は-20°Cで保存し、さらにLC-MS/MS分析が行われるまで保存します。
6. LC-MS分析の準備
   1. ペプチドサンプルをイオン移動度を備えたLC-MSシステムに直接積み込み、ペプチド分離と分析を行います。
   2. 蒸発や汚染を防ぐために、すべてのバイアルが適切に密封されていることを確認してください。

8. LC MS-MS分析

1. ペプチドロードと脱塩
   1. ペプチドサンプル1μgを部分ループ注入モードでサンプルループにロードします。
   2. C18トラップカラムを用いて、0.1%の蟻酸を含む水溶媒で15 μL/minの流量で1分間洗浄して脱塩ペプチドを行います。
      注意:溶媒Aとして0.1%の蟻酸、溶媒Bとして0.1%のアセトニトリルを溶媒Bとして使用してください。
2. ペプチド分離
   1. トラップカラムを解析用逆位相C18カラムと直列に接続します。
   2. 3%から40%の溶媒Bまでの線形勾配を用いて、流量300 nL/minで55分間でペプチドを溶出します。
   3. カラムを80%溶剤Bで7.5分間洗い流し、残留成分を除去します。
   4. 次の注入前に3%の溶媒Bでカラムを再平衡させます。
   5. 走行中はカラムオーブンを35°C、オートサンプラーを4°Cに保ちます。
      注意:キャリーオーバーを最小限に抑えるために、サンプル間にブランクインジェクションを含めてください。
3. 質量分析取得設定
   1. 脱出ペプチドの質量スペクトル解析
      1. UPLCシステムをセットアップし、それを直接高精細MSに連結します。
      2. システムをMSソフトウェアで制御します。
      3. 質量分析計はハイブリッド四重子イオン移動度直交加速度飛行時間(OA-TOF)機器として構成されていることを確認してください。
      4. 運転開始前に、すべての窒素およびロックスプレーガス接続がしっかり固定されて漏れがないか確認してください。
         注意:高電圧接続および加圧ガスは、実験室の安全基準に準拠して取り扱ってください。
   2. イオン化装置
      1. 質量分析計を二重電気噴霧イオン源を用いて正エレクトロスプレーイオン化(ESI)モードで運転します。
      2. ナノESIキャピラリー電圧を3.4 kVに設定してください。
      3. 試料コーン電圧を40V、抽出コーン電圧を4Vに調整します。
      4. イオン移動度分光法(IMS)窒素ガス流量を90 mL/minに設定します。
      5. スプレーの安定性を点検し、イオン電流が一定であることを確認してから進めてください。
   3. イオン移動度分離
      1. イオン伝送時にはIMSイオンガイドパルスの高さを40Vに設定します。
      2. IMSイオンガイドの速度を800 m/sに調整してください。
      3. IMSサイクル全体を通じて移動波高を8Vから20Vに線形に上げ、最適なイオン分離を実現します。
         注意:IMSガスの流れを安定させること;変動はイオン分離やドリフト時間の再現性に影響を与えることがあります。
   4. ロック質量校正
      1. 2 μg/μLヨウ化ナトリウム(NaI)溶液を用いて飛行時間(TOF)分析装置を校正します。
      2. キャリブレーション範囲を50 m/zから2000 m/zのイオン検出に設定してください。
      3. デュアルエレクトロスプレーイオンソースチャネルを用いて、45秒ごとにロック質量参照スペクトルを取得し、リアルタイムの質量補正を行います。
      4. データ取得に進む前に、キャリブレーション曲線が質量精度を± ppm以内に達成していることを確認してください。
4. データ取得
   1. 連続モードでデータを取得し、2つの機能を交互に行います。
      1. 機能1(低エネルギーMS):低エネルギー前駆体イオンスペクトルを記録。
      2. 機能2(高エネルギーHDMSE):イオン移動度分離を伴う衝突エネルギー上昇時の断片イオンスペクトルを記録します。
   2. 関数2では、トラップ領域の衝突エネルギーを4 eVに設定します。
   3. トランスファー領域の衝突エネルギーを20 eVから45 eVに増幅し、制御されたペプチド断片化を実現します。
   4. 各関数のスペクトル取得時間を0.9秒、インタースキャン遅延を0.024秒に設定します。
   5. 全イオンクロマトグラム(TIC)を監視し、検査中一貫した機器応答を確認します。
   6. 生データをプロテオミクス解析ソフトウェア(例:Progenesis QIまたは同等)にインポートします。
   7. デフォルトのアライメント参照または手動選択した参照ランを使ってクロマトグラムをラン間で整列させます。
   8. キュレーションされたデータベース(例:UniProt Human - レビュー済みエントリーのみ)を用いてペプチドとタンパク質を特定します。
   9. 以下の検索パラメータを設定してください:
      酵素:トリプシン
      固定修飾:カルバミドメチル化(C)
      可変修飾:酸化(M)
      ペプチド耐性:計器の解像度による
      カットラインを逃す回数:1回
      偽発見率(FDR):≤ 1%
   10. 正規化をすべての タンパク質に正規化 する方法を用いて行います。
   11. ろ過閾値を適用します:≥タンパク質あたり2ペプチド、≥1個のユニークなペプチド、フォールド変化≥1.5、調整p値<0.05。
       注意:これは一般的な実験室の安全指針であり、必ず機関のEHS(環境衛生・安全)規則および地域の法的要件に従ってください。
5. 品質管理
   1. NaI規格を用いて、質量精度を確認するために事前および事後の校正チェックを行います。
   2. 解析中、ロック質量基準が安定していることを確認しましょう。
   3. レプリケート注射を評価し、保持時間、ドリフト時間、スペクトル強度の再現性を確認します。
      注意:ヨウ化ナトリウムは刺激物です。取り扱い時は手袋を着用し、吸入や皮膚への接触を避けてください。
      注意:廃棄物処理の指針については 補足ファイル1 を参照してください。血漿サンプルを扱う際は、タンパク質分解を防ぐために、常に寒冷環境や氷の上で作業してください。生物サンプルやバッファーを扱う際は、ニトリル手袋、白衣、目の保護具を着用してください。4°Cまで冷えた冷蔵遠心分離機を用いて遠心分離を行います。 使用するすべての遠心分離チューブや注射器は無菌で適切にラベルを貼り、交差汚染を防ぐようにしてください。バッファーの準備には必ずプロテオミックグレードの水を使用してください。

結果

血漿サンプルはスピンカートリッジを用いて、アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、抗トリプシン、フィブリノーゲン、α2-マクログロブリン、α1酸糖タンパク質、IgM、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、補体C3、トランスチレチンの14種類の高存在量タンパク質を選択的に除去しました。この枯渇ステップは、下流プロテオミクス解析における低存在比バイオマーカーの検出向上に極めて重要でした。各プラズマサンプル(8〜10 μL)は希釈され、0.22 μmのスピンろ過で精製され、制御された遠心分離条件下で親和性カートリッジを通過しました。低存在比のタンパク質豊富血漿を表すフロースルー画分(F1およびF2)がプールされ、さらなる処理が行われました。プールされたフロースルー試料は、質量分析ベースのプロテオミクスとの適合性を確保するため、50 mMの重炭酸アンモニウム(pH 7.2-7.4)とのバッファー交換/脱塩処理が行われ、5 kDaスピン濃縮器を用いました。このプロセスは3回繰り返され、導電率測定で確認された干渉塩や小分子の99%以上の除去を実現し...

ディスカッション

生物学的マトリックスとしてのプラズマの本質的な複雑さは、プロテオミクス解析にとって大きな課題となっています。タンパク質濃度の膨大なダイナミックレンジと、少数の高存在比の種が優勢であることが、臨床的に重要な低存在比タンパク質の検出を覆い隠すことがあります。本研究では、中程度および低存在量のタンパク質を選択的に濃縮し、サンプル間の分析一貫性を維持するために設計された多段階の標準化されたパイプラインを用いてこれらの欠点を緩和しました。プラズマプロテオミクスのワークフローの各ステップは、技術的ノイズの管理、感度の向上、全身性炎症性疾患およびその他の臨床的に重要な疾患のプロテオミクスカバレッジを強化するために最適化されました。

免疫枯渇はパイプラインの初期段階として、実質的に最も豊富な14種類の血漿タンパク質を枯渇させます。除去の有効性は比較SDS-PAGE解析で検証され、全体のタンパク質濃度の著しい減少とフロースルー分数からの強い帯状の除去が明らかになり、アルブミン、免疫グロブリン、その他の高存在量成分の枯渇が確認されまし...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5 kDa分子量カットオフスピン濃縮器	アジレント・テクノロジーズ	5185 以降;5991	バッファー交換や塩分除去に使用されます。5kDaを超えるタンパク質を保持します
重炭酸アンモニウム(ABC)	シグマ・オルドリッチ	品番:T6567	トリプティック消化に使用
バッファーA、エクイル/ロード/ウォッシュ	アジレント・テクノロジーズ	5185-5987
バッファB洗脱	アジレント・テクノロジーズ	5185-5988
冷却遠心分離機	CPR-30プラス冷蔵遠心分離機	該当なし	低温でのタンパク質サンプルの遠心分離に使用されます
DTT	シグマ・オルドリッチ	CAS番号:3483-12-3	トリプティック消化に使用
電気泳動装置	バイオ・ラッド	1658004	SDS PAGEでの使用
IAA	シグマ・オルドリッチ	CAS番号:144-48-9	トリプティック消化に使用
IMS T-Wave	水域	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMoreMi xturesandMolecules-720004176.pdfのキャラクター化	イオン移動分離(IMS)
インフィニットMプレックスマルチモードリーダー	テカン		マルチプレートリーダー
LC-MSシステム	水域	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
MassLynx 4.1 SCN781ソフトウェア	水域	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	質量分析ソフトウェア
マルチプルアフィニティ除去スピンカートリッジ ヒューマン14(MARS Hu-14)	アジレント・テクノロジーズ	5188以降;6560	アルブミン、IgG、IgA、トランスフェリンなど14種類の高存在量血漿タンパク質を枯渇させるために使用されました。
nanoACQUITY UPLCシステム	水域	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
ナノロックスプレー	水域	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
オペロン FDU-7003	オペロン	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	スピード真空冷凍乾燥器
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモ・サイエンティフィック	23225	比色測定法を用いたタンパク質濃度の定量に使用されます
プロテオミクスのためのプロジェネシスQIとnbsp;	水域	V4.2
R-8C BL 実験室遠心分離機、固定角度ローター、12 &15mL	レミ		遠心分離機
SYNAPT G2 ハイビジョンMS	HDMSEシステム、ウォーターズ・コーポレーション	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	ハイブリッド四重極IMS直交加速度飛行時間分析器(OA-Tof)質量分析計
全回復バイアル	水域	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
トリプシン	シグマ・オルドリッチ	品番:T6567	トリプティック消化に使用