機械式細胞伸縮バイオリアクターを用いた3Dコラーゲン埋め込みA549/MRC-5肺胞オルガノイドの生成

サマリー

このプロトコルは、細胞外マトリックスのハイドロゲルスキャフォールド上でA549肺胞上皮細胞およびMRC-5肺線維芽細胞からオルガノイドを生成し、その後3Dコラーゲンゲルに埋め込み、細胞伸縮バイオリアクターを用いた機械的負荷曝露を行って肺胞機械生物学を調査する方法を概説します。

要約

呼吸力学や機械的ストレスは肺胞生物学において重要な役割を果たしますが、呼吸器疾患の病因に寄与する要因はしばしば見過ごされがちです。このギャップを埋めるために、私たちは肺胞上皮細胞線維芽細胞オルガノイドに細胞伸縮バイオリアクターを用いて制御された機械的負荷をかけるオルガノイドモデルを開発しました。このプラットフォームは、肺胞組織の空間的組織と多細胞の複雑性を再現し、細胞間コミュニケーションや機械伝達が健康および疾患における組織構造や機能にどのように影響するかを調査することを可能にします。本プロトコルでは、基底膜細胞外マトリックスハイドロゲル中で、A549肺胞上皮細胞株およびMRC-5肺線維芽細胞株を用いて上皮線維芽細胞オルガノイドの生成および培養方法を説明します。オルガノイドは非酵素的に単離され、バイオリアクター内の特殊なプレート内の3Dコラーゲンゲルに埋め込まれます。呼吸悪化時に見られる病的な呼吸パターンを模倣するために正二軸の応力をかける手順を概説します。最後に、細胞特異的マーカーの免疫染色や免疫メディエーター放出をプロファイリングする免疫解析を含む標準的な特徴付けワークフローを提示します。これらの分析は、オルガノイドの構造と機能の評価を支持しています。このプロトコルは、機械的ストレス下での肺胞生物学の研究にユーザーフレンドリーで再現性が高く適応性のあるプラットフォームを提供し、多様な実験目標を満たし肺疾患メカニズムの研究を進展させるためにパラメータを容易に調整できます。

概要

肺胞は呼吸器系の終末嚢であり、ガス交換の主要な部位として機能します。これらは主に肺胞タイプIおよびII型上皮細胞で構成されており、ガス交換、免疫機能、構造的完全性の維持を担い、壁内の線維芽細胞は細胞外マトリックスの恒常性1を維持し^ます。これらおよび他の常駐細胞は、呼吸中に周期的な伸びやせん断応力に継続的に曝露されます^。このような機械的な手がかりは生化学的信号に変換され、細胞構造、分化、コミュニケーションに影響を与える³.

慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの肺疾患では、病理学的機械的負担が観察されます。COPDは進行性疾患で、実質の破壊、慢性炎症、狭窄する^気道の狭窄を特徴とします。この疾患では、肺胞壁の破壊、エラスチンの喪失、線維化による細胞外マトリックス(ECM)の再構築、慢性的な炎症が、これらが肺の^{構造的損傷}に耐える能力を損なうことが複合的に起こります。これにより呼吸中に異質かつ異常な肺胞変形が生じ、疾患の再発時にはさらに悪化^します。

肺胞生物学の研究にはいくつかのin vitroアプローチが用いられていますが、それぞれに顕著な限界があります。2次元共培養システムは細胞間相互作用の研究を容易にしますが、組織構造や細胞外マトリックスの動態を捉えることができず、生理学的な関連性を低下させます。静的3D培養は構造的組織やマトリックス相互作用をよりよく保存しますが、生体内に存在する動的な機械的手がかりは取り入れません。マイクロ流体およびオルガンオンチッププラットフォームは流体の流れや機械的負荷を模倣し、高い生理的忠実度を提供しますが、技術的に複雑でスループットが低く、^{コストも高}くなっていることが多い9。これに対し、ここで示す3D機械的ストレッチオルガノイドモデルは、構造的複雑性、細胞異質性、制御された機械的刺激を既存モデルでしばしば見落とされがちな側面を、生理学的関連性と実験的アクセス性のバランスを提供する再現可能でスケーラブルなプラットフォームを組み込んでいます(^10,11)。

COPDのような疾患に寄与する複雑なメカニズムを理解し、治療標的を発見するために、疾患モデルが確立されています。機械的ストレスは重要性にもかかわらず、COPDなどの肺疾患のメカニズムや病因を研究するために用いられる in vitro 肺胞モデルではしばしば見落とされがちです。このギャップを埋めるために、基底マトリックス内で肺胞上皮線維芽細胞オルガノイドを培養し、3Dコラーゲンゲルに回収・埋め込み、細胞伸縮バイオリアクターを用いた周期的機械的負荷の適用、そして主要な構造的および機能的成果を評価する方法を提案します。これらの3D機械的オルガノイドモデルは、細胞相互作用やヒト肺胞ニッチの微小環境をよりよく捉え、上皮-間葉系^{クロストーク}の研究を可能にします。

バイオリアクターは設定可能なパラメータで等二軸のひずみを適用し、最大30%の伸長と最大5Hzの周波数で生理学的および病理的条件の両方をモデル化します。本研究では、コラーゲンIハイドロゲルに埋め込まれたオルガノイドモデルを作成し、0.4Hzで18%のひみを24時間かけて病理的な呼吸を模倣しました。細胞特異的マーカーの免疫染色や、機械的ストレス後の免疫メディエーター放出を定量化する免疫アッセイを含む標準化された特性評価ワークフローを確立しました。本研究の目的は、機械的ストレス下での肺胞生物学を調査するための生理学的関連性があり、ユーザーフレンドリーかつ適応可能なプラットフォームを提供することです。

プロトコル

すべての工程は無菌技術、滅菌材料、試薬を必要とし、バイオセーフティキャビネット内で実施され、職員のバイオハザードへの曝露や培養物の汚染を減らします。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 細胞培養と細胞株の確立

1. オルガノイド形成前に、標準的な組織培養処理プラスチックフラスコ(T75 cm²)上で、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%胎児用牛血清(FBS)と1%ペニシリン・ストレプトマイシンを補足し、約70%〜80%の合流率までA549およびMRC-5細胞を培養し、以下「完全DMEM」と称します。
2. A549とMRC-5の両方で、2×10⁴ cells/^cm²で種子を投げ、合計体積は10 mLの完全なDMEMです。培養細胞は37°Cで、_CO25 %を含み、湿度を加湿した環境で約70%〜80%の合流に達するまで行います。
3. 最適な成長条件を確保するために、培地は48時間ごとに交換してください。
4. サブカルチャーは、フラスコ内のすべての培地を70%〜80%の合流点で吸引し、温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、その後トリプシンEDTAを4 mL添加します。
5. 37°Cで5分間培養し、明視野顕微鏡でフラスコを観察して完全に剥離させます。完全なDMEMを4mL加えて中和します。
6. トリパンブルー排除計数など、選ばれた技術で細胞数を数えます。
7. セル懸濁液を200 x g で5分間遠心分離します。
8. 上澄液を吸引して円錐形チューブの底に細胞ペレットを残します。細胞ペレットを適切な完全なDMEMの体積に優しくトリチュアして再懸浮させます。
9. 凍結時には、10%のDMSOを含む完全な培地に再懸浮し、1×10⁶ 細胞/mLを得ます。オルガノイド形成には、1×10⁶ 細胞/mLをリ懸濁してください。

2. 3次元肺胞上皮細胞線維芽細胞オルガノイドモデルの成熟の確立と特徴付け

注意:地下室のマトリックスは一晩氷の上で解凍し、これらの作業中は氷の上に保管してください。高温はマトリックスの固化を引き起こすことがあります。

1. 地下マトリックスと高度なDMEMを2:3の割合で混合して準備します。この溶液を24ウェルプレートの各ウェルに300μL加え、各ウェルの底が均一にコーティングされるようにします。プレートを37°Cの加湿インキュベーターで1時間培養し、マトリックスが固まるのを待ちます。
2. 完全なDMEMで5%の基底マトリックス溶液を準備し、これがオルガノイドの培養培地となります。各井戸ごとに、基底マトリックス60μLを完全なDMEM1,140μLに希釈して1.2mLの溶液を作ります。
3. 基底マトリックス混合物が固化している間、ステップ2.2で説明した完全なDMEMで作製された5%基底マトリックス溶液の200μLに、30万個のA549セルと30,000個のMRC-5セルを混ぜます。
4. 2:3の基底混合物が固まったら、A549/MRC-5混合液200μLをゲル状マトリックスにピペットで注入し、24ウェルプレートを再び37°C、5% CO₂で21日間インキュベートして、肺胞オルガノイドの成長と分化を促します。
5. 次の48時間、光学顕微鏡で培養を視覚化してください。この期間中に細胞が集まっているはずです。
6. 5%のベースメントマトリックス/DMEM溶液を48時間ごとに200μLの新鮮な5%培地に置き換えます。ハイドロゲル内に埋め込まれたオルガノイドを乱さないため、吸引前に古い溶液が井戸壁に沿って集まるようにプレートを優しく傾けます。
7. 成熟の3日目、9日目、21日目に、オルガノイドを10倍の対物レンズ倍率で撮影し、各ウェルの代表的な画像または視野を4枚撮影します。3日目、9日目、21日目の初期オルガノイド形態の代表画像は 図1に示されています。
8. 各視野に対して、直径50μmを超えるオルガノイドをすべて数えます。視野の既知の面積を用いて、24孔の板面面積を1.9 cm²と仮定し、フィールドあたりの平均個数から井戸あたりのオルガノイド総数を推定します。
   注:これらの解析はFiji¹³のような画像解析ソフトウェアを使用して行うことができます。
9. オルガノイドの平均直径と面積も測定することで、培養中のオルガノイドの成長特性に関する定量的情報を得ることができます。

3. 3次元肺胞上皮線維芽細胞オルガノイドの採取

注意:オルガノイドの採取は氷上で行うべきです。

1. 熟成21日後、上清液を吸引し、約1〜2mLの氷で冷たいPBSで優しく洗浄します。
2. 冷たいオルガノイド採取液を1〜2mL加え、2〜8°Cで30〜90分間、適度な振る動作で培育します。
   注意:オルガノイドが井戸の底に浮かんでいるのが見えたら、孵化を停止してください。
3. 明視野顕微鏡で解離を監視してください。井戸底部の基底マトリックスが見えなくなり、オルガノイドが懸濁状態になると解離は完了とみなされます。細胞スクレーパーを用いてオルガノイド基底マトリックスのハイドロゲルを優しく取り除き、プロセスを加速させることができます。
4. すべての井戸の内容物を氷の上で50mLの円錐形チューブにまとめます。
5. 遠心分離機で500× g 、2〜8°Cで5分間加熱します。 上清液を吸引し、オルガノイドペレットを氷のように冷たいPBSで1〜2mL洗浄し、再び遠心分離してペレットを得ます。PBSを吸引してください。

4. 3Dコラーゲン埋め込みの肺胞線維芽細胞オルガノイドの確立と機械的ひずみの応用

注意:細胞伸縮バイオリアクターと互換性のあるフォームアンカー付きの円形フォーム培養プレートを使用してください。このプロトコルで使用された培養プレートの成長面積は~6.6 cm²です。

1. 2 mg/mLのコラーゲンIゲルの作動溶液を準備します。溶液にはPBS1×、NaOH11.4 mM、コラーゲンI2 mg/mLが含まれ、最終的な量は滅菌水で調整します。このコラーゲンI溶液を円形フォーム6ウェルプレートのウェルごとに2mL準備します。
2. プレートの周囲にあるフォームアンカーに2 mg/mLのコラーゲンI溶液を1 mL加え、完全に飽和させます。
   注意:フォームアンカーは適切な接着を確保するためにコラーゲンI溶液で十分に浸透させる必要があります。不完全な飽和は、機械的ひみ合いの際にコラーゲンゲルの剥離を引き起こし、目標と比べて有効のひずみが低下することがあります。
3. オルガノイドペレットを2 mg/mLのラット尾コラーゲン6 mLに再懸濁させ、懸濁液1 mLを6ウェル円形フォームプレートの中央にピペットで移します。これにより、オルガノイド浸入コラーゲン混合物が初期のオルガノイドフリーコラーゲンと円形フォームアンカーに加えられて混ざり合うようにします。
   注意:オルガノイド懸濁液を各井戸に加える際には気泡が発生しないように注意してください。
4. コラーゲンIを1時間重合し、プレートをインキュベーター(37°C、5%_CO2)に置きます_。 重合後、ゲルは濁って見えるはずです。
5. 3Dコラーゲン埋め込みのA549/MRC5オルガノイドの上に完全なDMEM2mLを加え、プレートをインキュベーターに戻して24時間保存します。
6. 培養培地をDMEM+1% FBSに置き換え、機械的ひずみ曝露前に一晩培養します。

5. 細胞伸縮バイオリアクターのセットアップと機械的ひずみへの曝露

1. ベースプレートの各ウェルにロードステーションを挿入します。これらは直径25mmの6つのローディングポストを備えており、組織トレインプレートの柔軟な膜が周囲で変形し、3D培養を等二軸のひずみにさらすことを可能にします。
2. 積み込みポストの上部に薄くシリコーングリースを塗ります。
3. 各6ウェルプレートの底部に赤いガスケットを取り付けます。
4. 準備済みのプレートを積み込みポストの上のベースプレートに差し込みます。
5. この装置を37°Cの加湿インキュベーターに移し、5%_CO2 を含み、クイックディスコネクトフィッティングをベースプレートに接続します。ステップ5.1から5.6を繰り返しますが、接続を省略して無負荷コントロールを作成します。
   注意:オプションとして、チューブシーリングストッパーを装着することも可能で、これにより単一のBioFlex井戸の底部に真空圧力を加えるのを防ぎ、同じプレート上で非ひずみ制御培養を生成できます。
6. プレキシガラスシートで覆い、5〜10ポンドほどの重りを加えて密閉を確実にします。
7. エアコンプレッサーを起動し、エアコンプレッサーの排出バルブを開けてください。
8. 真空圧力ポンプを起動し、真空タンクの排水口に接続された圧力貯蔵バルブを開けてください。真空圧は約90 kPaにしてください。
9. バイオリアクターコントローラー近くにある空気圧縮機のインフローバルブを開けてください。ベントポートの圧力を15 PSIを超えないように調整してください。
10. オンボードソフトウェアを起動し、望む巡回機械的ひずみパラメータを設定します。本研究では、0.4 Hzで18%の応進振幅を24時間にわたり用いるレジメンが用いられました。これを設定するには、新しいレギュメンを作成し、最小伸長を0%、最大伸長を18%に設定し、プロトコルを開始します。
11. プレートと膜を観察し、ストレインセッション中ずっと動きが見えるか確認してください。膜は積み込みポストの周りで変形しているはずです。
12. 定期的に水トラップの湿気を確認し、コンピュータ画面で稼働時間、進行状況、適切な形態を観察してください。
13. ストレインレジメン終了後にベースプレートアセンブリを切り離し、ストレス培養を24時間の培養に戻してから下流の特性解析を行います。
14. 起動の逆順に電源を落とし、システムを分解します:空気圧縮機の入水バルブを閉じるかオフし、次に圧力リザーバーバルブ、真空圧力ポンプ、空気圧縮機のアウトフローバルブ、最後にエアコンプレッサーをこの順に切り替えます。
15. 機械的負荷にさらされた後、24時間の培養後に上清液を採取してください。使用まで-80°Cで保存してください。

6. 免疫蛍光 による オルガノイドの形態学的特徴付け

1. オルガノイドコラーゲンゲルモデルをPBSで3回洗浄し、1 mL PBSを優しく加え、室温で5分間培養します。
2. PBSを慎重に吸引し、洗浄を合計3回繰り返します。
3. 4°Cで4%パラホルムアルデヒド2mLを1時間培養してモデルを固定します。
4. 上記の通りPBSでモデルを3回洗います。
5. メスで柔軟なウェルの円形フォームアンカーを優しく切り、コラーゲンジェルを付けてペトリ皿に入れます。
6. 2mLの0.1%トリトンX-100を室温で5分間PBSで培養することで、オルガノイドを透過化します。
7. モデルはPBSで3回洗ってください。
8. 5%牛血清アルブミン(BSA)3 mLを室温で1時間PBSで培養することで、非特異的結合を阻害します。ブロッキング溶液を除去し、次のステップに進みます。
9. モデルを4°Cで一晩、Alexa Fluor 594と1:100希釈した抗ヒトゾヌラ・オクルーデンス-1(ZO-1)、1:1000希釈でAlexa Fluor 488と共役したファロイジン、1:4000希釈の核染色DAPIを含む染色カクテルでインキュベートします。希釈剤は1 mLの1%のBSAをPBSに含んでいます。培養前に4°Cでプレートの縁をテープで貼り付けます。
10. 翌日、染色カクテル溶液を吸引し、モデルをPBSで3回洗います。
11. 共焦点顕微鏡で画像を撮影し、代表的なオルガノイドの5μmスライスを40倍の対物レンズ倍率でZ-スタック撮影します。
12. フィジー画像解析ソフトウェアを使って蛍光強度を解析してください。オルガノイドの面積と平均蛍光強度を正規化し、異なる環境条件間での正確な比較を確保します。

7. ELISAおよび乳酸脱水素酵素(LDH)細胞毒性アッセイによるオルガノイドの機能的特徴づけ

1. 上清液を氷で溶かし、製造元のプロトコルに従い市販のELISAキットを用いてインターロイキン6(IL-6)およびインターロイキン8(IL-8)分泌を評価します。
2. 市販のLDH吸収アッセイを用いて細胞毒性のマーカーであるLDH放出の有無を評価します。
3. 0.5μgから0.5 ngの半対数濃度で組換えLDHタンパク質を用いて標準曲線を作成します。標準曲線を用いて各試料からLDH濃度を補間します。

8. 任意:RNAまたはタンパク質解析のためのサンプル分離

1. 免疫蛍光染色のために4%のパラホルマルデヒドを加える代わりに、RLT1 mLあたり10 μLのβメルカプトエタノールを含む準備済みRLTバッファーを追加します。
2. 各モデルにつき300μLを使用し、ピペットを上下に動かして細胞を完全に剥離・溶解します。
3. 溶解液をRNaseを含まないマイクロ遠心分離管に移し、チューブをドライアイスに置いて素早く凍結させます。長期保存のために-80°Cに移してください。
   注:あるいは、RIPAバッファーを使用してタンパク質抽出を用い、以下の方法を制製することもできます:50 mM Tris-HCl、pH 7.4-7.5;150 mM NaCl;1%はNP-40またはトリトンX-100;デオキシコール酸ナトリウム0.5%;脱イオン水中のSDSは0.1%です。市販のRIPAバッファーも市販されています。
4. 各モデルに200μLを加え、氷の上で5分間ロックし、その後分解液を採取します。
5. 15,000 x g で4°Cで10分間回転させて細胞のデブリを除去し、長期保存のために-80°Cに移します。

結果

細胞株由来の肺胞上皮線維芽細胞オルガノイドを確立し、21日間以上培養しました。この期間を通じて形態学的変化が観察され、3日目、9日目、21日目にオルガノイドの数、面積、直径が評価され、成長と発達を監視しました。井戸あたりの平均オルガノイド数は、3日目と比べて9日目と21日目で有意に減少しました(図2A)。対照的に、平均オルガノイド面積と直径は9日目と21日目に有意に増加し、継続的な成長と拡大を示しています(図2B,C)¹⁰。

図3A,Bは、静的(非ストレス状態)および緊張条件下で、細胞骨格の主要成分であるF-アクチン、上皮細胞の密接合部に局在する足場タンパク質ZO-1、および核¹⁰の免疫染色を受けた肺胞上皮上皮-線維芽細胞オルガノイドモ...

ディスカッション

三次元(3D)肺胞上皮線維芽細胞オルガノイドは、機械的負荷下での肺の構造と機能をモデル化する上で非常に生理学的に重要なプラットフォームを提供します。2次元や3Dの共培養システムとは異なり、オルガノイドは生体内肺微小環境の重要な特徴、すなわち空間的組織、上皮-間葉系のクロストーク、細胞外マトリックス(ECM)相互作用などを保持します¹⁴。喘息、COPD、人工呼吸器による肺損傷などの疾患において、機械的ストレスは気道再構築において中心的な役割を果たします。これらの疾患では、繰り返しの気管支収縮や周期的過膨張により上皮細胞や間質細胞が異常な引張力にさらされます¹⁵。前回の研究¹⁰では、0.4 Hzで18%の等軸斜向ストレインを24時間かけて肺胞上皮線維芽細胞オルガノイドに適用した結果、上皮のタイトジャンクションの喪失(ZO-1発現の低下)、細胞骨格の再編成(F-アクチン再編成)、炎症性サイトカインのアップレギュレーシ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブ	エッペンドルフ	0030 125.215
15 mL円錐形チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	14-959-53A
16% パラホルムアルデヒド	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	28908
2-メルカプトエタノール	ミリポール・シグマ	M3148
50 mL円錐形チューブ	フィッシャー・サイエンティフィック	14-432-22
6ウェル(柔軟な膜)ティッシュトレイン 円形フォームプレート	フレックスセル・インターナショナル	TTCF-5001
A549セル	アメリカタイプ文化コレクション(ATCC)	CCL-171
エアコンプレッサー	カリフォルニア・エア・ツールズ	10020DSPCAD
牛血清アルブミン	ミリポール・シグマ	A9418
バッファRLT	キアゲン	79216
CO2インキュベーター	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
カルトレックスオルガノイド収穫溶液	バイオテクネ	3700-100-01
CyQUANT LDH細胞毒性検査キット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	C20300
DAPI(4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	D1306
ジメチルスルホキシド	シグマ・オルドリッチ	D2650-100ML
ダルベッコ改良型イーグル」s媒体(DMEM)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11965092
EVOS XL コア顕微鏡	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AMEX1200
胎児用牛血清(FBS)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A5209501
フィジー画像解析ソフトウェア	国立衛生研究所
Flexcell FX-6000テンション&ティッシュトレインシステム(Flexlink FX-6000テンションコントローラー、圧力リザーバー、ベースプレート、アクリルウィンドウ、直径25mm円筒形ローディングステーション、ウォータートラップ、FlexSoft FX-6000 V1.0ソフトウェア、各種チューブを含む)	フレックスセル・インターナショナル	FX6000T
ヒト白血球菌-6デュオセットELISA	バイオテクネ	DY206
ヒトインターロイキン-8デュオセットELISA	バイオテクネ	DY208
ライカ DMi8 共焦点顕微鏡	ライカ・マイクロシステムズ	11889122
マトリジェル基底膜マトリックス	コーニング	356237
MRC-5セル	ATCC	CCL-185
パラフィルム	ミリポール・シグマ	P7793
ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/溶連菌)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122
ファロイジン標識プローブ、Alexa Fluor 488	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A12379
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	14190-144
ラットテールコラーゲンI	シグマ・オルドリッチ	C3867
組換えヒト乳酸脱水素酵素タンパク質(活性)	アブカム	Ab93699
RIPA溶解バッファー	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	89901
RNaseフリーマイクロフュージチューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AM12400
T75 cm2培養フラスコ	グライナー	658175
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	X100-5ML
ZO-1モノクローナル抗体(ZO1-1A12)、Alexa Fluor 594	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	339194