体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

サマリー

本プロトコルは、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いて肺炎 連鎖 球菌をユビキチン化する方法を説明し、その後精製されたVCP/p97-UFD1-NPLOC4タンパク質複合体で処理してそのバクテリオリ活性を評価することで、ユビキチン依存性免疫効果の研究を可能にします。

要約

ユビキチネーションは、細胞質免疫において重要な役割を果たした多用途な翻訳後修飾です。宿主細胞への侵入後、病原性細菌は最初にエンドソーム内に閉じ込められ、そこから抜け出して細胞質に逃げ込み、リソソーム分解を回避します。細胞質に入った細菌は宿主E3リガーゼによってユビキチン鎖で素早くタグ付けされ、オートファジーやプロテアソームを含む複数のエフェクター経路を通じて除去の対象となります。細菌の除去における個々の経路の貢献を明確にするために、 体外 再構成は制御された明確なアプローチを提供します。ここでは、肺炎 連鎖 球菌(SPN)をモデル細菌病原体として用い、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いたユビキチン化の詳細なプロトコルを示し、その後精製されたVCP/p97-UFD1-NPLOC4複合体による処理で他の細胞因子に依存しない分解活性を評価する。全体として、この手法は免疫連鎖ユビキチンリガーゼとエフェクターの機能を細胞フリーの文脈で明らかにする可能性を秘めており、未去形の細胞ではこれらのメカニズムの解明が困難となることがあります。

概要

ユビキチン(Ub)は、標的基質のC末端グリシンに共有結合することで修飾し、リジン残基のεアミノ基とイソペプチド結合を形成する、8.6 kDaの小さなタンパク質です。この過程はユビキチン化¹と呼ばれます。この現象は、E1ユビキチン活性化酵素、E2ユビキチン共役酵素、E3ユビキチンリガーゼ1^、2、3を含む一連の計画的なステップによって支配されています。Ubは単量体として、または7つのリジン残基(Linear/M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)を通じて異なる長さの鎖として結合^{できます4。}これらの独特なUb鎖は、プロテアソーム分解、細胞輸送、DNA修復、選択的オートファジーなど、さまざまな細胞機能の分子マーカーとして機能^します。

ユビキチン化の正当な役割は長らく細胞の恒常性維持に関連しており、例えばプロテアソームを介して誤った折りたたみタンパク質を分解したり、特定の貨物を選択的オートファジーに誘導したり^するなどと^{されていますが}、現在ではユビキチンが細菌感染に対する細胞質免疫系の重要な感知機構としても機能していることが明らかになっています。細胞内細菌は、細胞外免疫応答による検出を避け、安全な環境で繁殖するために宿主細胞に侵入することがよくあります^7,8。多くの病原体は分泌系や毒素を利用して、それらを運ぶ液胞を修復不能に損傷し、細胞質に逃げ込んで栄養素を得^ます。細胞質に入った細菌は、特定のE3リガーゼによってポリユビキチン鎖で装飾され、分子的な「死のタグ」として機能し、選択的除去へと導きます。例えば、E3リガーゼSMURF1は結核菌の表面で直接K48連結ポリユビキチン化を開始し、プロテアソー^ム11を介して分解します。パーキンは細菌を含む液胞に蓄積し、K63連結のユビキチン鎖を形成します¹²。一方、ARIH1とLRSAM1はそれぞれK48鎖とK6鎖で細菌の表面を修飾し、細菌の増殖を抑制します^13,14。E3リガーゼの大部分は主に宿主タンパク質基質を標的としますが、一部のリガーゼは微生物成分に対して顕著な特異性を示します。RNF213はサルモネラ・エンテリカ・セロバ・チフィムリウム¹⁵に見られるリポ多糖(LPS)を同定し、ユビキチン化し、SCF^FBXO2複合体はグループA連鎖球菌に存在する細菌糖団をユビキチネーション¹⁶の基質として認識し、異食を促進します。一方、SCF^FBXW7複合体は肺炎連鎖球菌(SPN)の表面タンパク質内のデグロンモチーフを認識します。これには、K48連結ポリウビビキチン鎖による標識を経て、K48連結のUb特異的抗体で確認されたβ-ガラクトシダーゼA(BgaA)および肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)が含まれ、これらはプロテアソーム系を引き寄せ、効果的な細菌除去を可能にすると考えられています¹⁷。

これらの細胞質侵入者をユビキチンで標識する過程はよく理解されていますが、プロテアソーム系がこれほど大きな微生物を除去するその後のメカニズムは依然として疑わしいままです。最近の研究では、宿主AAA+ATPaseであるVCP/p97(バロシン含有タンパク質)がこの過程で重要な役割を果たしていることが明らかになりました。UFD1やNPLOC4などの補因子と協力することで、VCPはポリユビキチンを示す細菌を特定し、細菌膜からユビキチン化されたタンパク質を物理的に抽出して、それらを破壊し、プロテアソーム機構に依存せずに細胞質環境からの除去を助けます¹⁸。

宿主細胞質は複雑な免疫経路のネットワークを含み、並行して機能し、病原体の除去を保証するためにフェイルセーフな役割を果たします。この冗長性は強力な防御に不可欠ですが、個々の^{免疫因子の役割}を特定し検討する努力を複雑にします。この点で、 体外 再生システムは制御された条件下で特定の経路を解析する有用なプラットフォームを提供します。ここでは、哺乳類の細胞溶解物やE1-E2-E3-Ub酵素、そして精製された宿主エフェクター複合体を用いて、SPNのユビキチン化と生存能力喪失の過程を再現する細胞フリーシステムを導入します。この2段階プロトコルでは、まず細菌上のポリウビキチン鎖の結合を促進し、その後VCP/p97によるUFD1およびNPLOC4との結合を評価します。この経路をin vitroで再構成することで、細胞の複雑さを回避し、VCPが病原体を中和する能力を具体的に調査します。この精密なセットアップにより、基質認識、連鎖特異性、エフェクターの作用機序、効果的な応答を開始するために必要な要素の詳細な探求が可能になります。

プロトコル

1. 細胞培養および溶解液の調製

1. A549細胞を解凍し、完全なDMEMと10%胎児用牛血清(FBS)を用いてT25フラスコで培養します。37°Cの加湿環境で5%の_CO2で培養します。細胞を3回通してメンテナンスを行い、その後2×10個の⁶個細胞をT75フラスコに移します。細胞密度が8〜10×^10〜6細胞に達するまで培養を続けます。
2. T75フラスコから細胞を4°Cで、200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl、5%グリセロール(pH 7.4)を含む反応バッファーを使ってスクイプします。120 × g で10分間遠心分離してペレット処理し、その後反応バッファーに再懸浮させて1.5 mL遠心分離機チューブで約0.6 mLの最終体積を得ます。
   注意:サンプル全体を氷で処理する必要があります。
3. 直径2mmの細プローブ(直径2mm)を用いて、振幅40μmで2秒オンオフパルスを2〜2.5分間かけて細胞懸濁液を超音波処理し、混合物を氷上に保ちます。超音波処理サンプルを21,000 × g で45分間遠心分離し、抽出された上澄液を採取し、50倍プロテアーゼ阻害剤カクテルを2〜3回追加します。
   注:溶合液は同日にユビキチン化反応に即座に使用するか、液体窒素で急凍して-80°Cで保存してください。ただし、効果的なユビキチン化のためには、最大でも3日以内に使用することを忘れないでください。溶解液濃度は2〜4 mg/mLの範囲で、ユビキチン化に適しています。

2. 細菌培養

1. 細菌である 肺炎連鎖球菌 (SPN)R6株(血清型II)を、トッド・ヒューイットブロスパウダー(3.7g/100mL)と酵母抽出粉(1.5g/100mL)からなるTHY培地で、37°Cで5%_CO2 を浸して一晩培養します。
   注意:培地が濃い茶色に変わっている場合は、細菌への接種を避けてください。 肺炎連鎖球菌 はバイオセーフティレベル2(BSL-2)病原体に分類されています。認証済みバイオセーフティキャビネットの使用を含む、正しいBSL-2封じ込めプロトコルを遵守し、予防措置を講じてください。
2. 翌日、一晩培養したものを新鮮なTHY培地(1:10)に37°Cで5%_CO2 で接種し、SPNを600nm(外径_600nm)で0.4まで培養します。SPNのグリセロールストック(SPN培養900μLとグリセロール600μL(50%)を準備し、-80°Cで保存します。
3. ユビキチン化実験当日、新しいSPNストックを-80°Cから解凍し、完全に5mLのTHY培地に接種し、OD_{600 nm} が0.4に達するまで培養させます。
   注:細菌培養はOD_{600 nm} の0.4で培養され、これは約10個^の8 SPN細胞/mLに相当します。この相関は、細菌細胞濃度を1倍PBSで連続的に希釈して可算コロニーを得ること、そしてTHYよりも濃縮された培地であるBHI寒天プレートでの斑点検出によってコロニー形成単位(CFU)を列挙することで確立されました。

3. 哺乳類溶解液からの in vitro ユビキチン化アッセイ

1. 約10個の⁷ 個のSPN細胞を取り、反応バッファー(200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl、pH 7.4の5%グリセロール)で少なくとも3回徹底的に洗浄し、細菌を次のバッファーに再懸濁させた後、21,000 × g で5分間遠心分離し、最後に室温で21,000 × g で遠心分離して5分間ペレットで処理します。
2. SPNペレットをA549哺乳類細胞溶解液と精製ユビキチン(350μM)および1 mM ATPで再懸浮させ、27°Cで1〜2時間培養します。
   注意:哺乳類細胞の溶解液の凍結解凍は避けてください。溶解液はユビキチン化アッセイと同じ日に準備するのが最善です。
3. 培養後、1M尿素を含む反応バッファーで1回洗浄し、その後反応バッファーのみで2回洗浄し、最後に1%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。固定後、グリシンを含むPBS(1 mg/mL)で細胞を15分間インキュベートし、その後2回1回のPBS洗浄を行います。
   注:1 Mの尿素洗浄液は非共有結合相互作用を軽く妨害し、共有結合ユビキチン細菌のみを残すために使用されます。その後、残留尿素を除去するために反応バッファーで徹底的に洗浄することが重要です。尿素の存在は 体外 殺菌アッセイに干渉する可能性があるためです。
   ネガティブコントロールとして、反応混合物全体を準備し、氷の上で細菌と培養して酵素活性を抑制します。培養直後にサンプルをすすいで、反応状態を維持するために1%のPFAで固定します。

4. E1-E2-E3酵素複合体からの in vitroユ ビキチン化アッセイ

1. まず、ユビキチン(350μM)、UBE1(400-800 nM)、UbE2C(3-5 μM)、Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 複合体(500 nM)、および2 mM ATP(200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl、pH 7.4の5%グリセロール)からなる反応混合物を準備し、総反応体積を100-150 μLにします。
   注意:すべての酵素は-80°Cで保存してください。 複数の凍結融解サイクルによる活性低下を避けるために、小さなアリコートを作成し、各ユビキチン化反応ごとに新しいアリコートを活用しましょう。
2. このユビキチン酵素含有反応混合物に細菌(10⁷ CFU)を再懸浮させ、27°Cで2時間培養します。 その後、1M尿素を含む反応バッファーで少なくとも3回洗浄し、その後1%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定します。固定後、グリシンを含むPBS(1 mg/mL)で細胞を15分間インキュベートし、その後2回1回のPBS洗浄を行います。
   注意:細胞損失が過剰な場合は、洗浄回数を減らすことができます。

5. ユビキチン化細菌の可視化

1. サンプルを1%PFAで固定した後、3%BSAで27°Cで1時間培養し、その後PBS1回で2回洗浄します。
2. 通常免疫蛍光アッセイで用いられる濃度よりも高い濃度で一次抗体を用いてユビキチン化細菌を再懸浮させます。細菌特異的抗体と抗ユビキチン抗体(1:100)をPBSに希釈し、1%のBSAを含むPBSで27°Cで1時間染色します。
   注意:最適な抗体染色のためには、抗体損失を最小限に抑えるために低タンパク質結合の遠心分離機チューブを使用するか、より高い抗体濃度で最良の結果を得る方法があります。
3. その後、細菌を1xPBSで2回洗浄し、対応する二次抗体(それぞれAlexaフルオ488および555と共役)で27°Cで1時間再懸濁します。
4. ラベル付けされた細菌サンプルをドロップキャストで約10〜20μL塗布し、DAPI有無にかかわらず5〜10μLのマウンティングメディウムに混ぜ、カバースリップを敷いて薄紙で余分な液体を吸収します。最後に、同じ日に共焦点顕微鏡でサンプルを観察します。

6. タンパク質発現と精製

1. 野生型VCP/p97の発現には、VCPを含むpET28aプラスミドを標準的な大腸菌形質転換プロトコル²⁰を用いて大腸菌BL21-DE3株に形質転換します。孵卵コロニーは、ルリアブロス(LB)で37°Cで一晩で変化後形成されました。 翌日、十分に通気性のあるLB入りフラスコに1:50の培養液を接種し、OD_{600 nm}が0.7-0.8に達するまで培養させます。培養に200μMのIPTGを加え、37°Cで5時間培養し、180rpmで振る。SDS-PAGEを使ってタンパク質発現を確認します。
   注:細菌の増殖および発現全段階において、選択圧としてカナマイシン(50 μg/mL)が使用されました。
2. 野生型UFD1の発現には、UFD1を含むpET41bプラスミドを標準的な大腸菌形質転換プロトコル²⁰を用いて大腸菌BL21-ロゼッタ株に形質転換します。孵卵コロニーは、ルリアブロス(LB)で37°Cで一晩で変化後形成されました。 翌日、十分に通気性のあるLB入りフラスコに1:50の培養液を接種し、OD_{600 nm}が0.7-0.8に達するまで培養させます。培養に1 mMのIPTGを加え、37°Cで5時間、180 rpmで振って培養します。SDS-PAGEを使ってタンパク質発現を確認します。
3. 野生型NPLOC4を発現させるには、標準的な大腸菌形質転換法²⁰を用いてNPLOC4を含むpET41bプラスミドを大腸菌BL21-ロゼッタ株に導入します。ルリアブロス(LB)で変化から生まれた菌群を37°Cで一晩孵化させます。 翌日、培養液を1:50の希釈液を十分に通気されたLB入りフラスコに移し、外_{600 nm}での光学密度が0.7〜0.8に達するまで増殖させます。その後、培養に1 mMのIPTGを加え、180 rpmで振った状態で18°Cで16時間の培養を続けます。SDS-PAGE解析を行い、タンパク質の発現を検証します。
   注:大 腸菌 BL21-ロゼッタ株における細菌の増殖および発現全段階において、カナマイシン(50 μg/mL)とクロランフェニコール(20 μg/mL)を選択圧として使用しました。pET28a-p97およびpET41b-NPLOC4の配列は 補足ファイル1に記載されています。
4. タンパク質発現後、細菌細胞を21,000 × g で10分間遠心分離し、ペレットを50 mMのトリス-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-メルカプトエタノール、1 mM PMSF、5%グリセロール、pH 8を含むリシスバッファーに再懸濁します。
5. 細いプローブ(先端径6mm)を用いて1時間、振幅50μm、4°Cで20秒のオン/オフパルスで細胞を超音波処理します。 15,000 g の×で1時間かけてゴミをペレット状に落とし、上清液を採取します。
   注:トータルソニックは1時間(30分オン、30分オフ、20秒のパルス)で行われ、濁ったセルの懸液が半透明になるまでこのプロセスを続けました。細胞残骸がペレット状のまま、溶離液をタンパク質精製カラムに積み込む際に移動しないようにするために、高速遠心分離が必要です。
6. 上清液を0.4μmフィルターに通し、Ni-NTAビーズで充填したカラムにアフィニティ精製を行います。精製バッファー(50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-メルカプトエタノール、5%グリセロール、pH8)で平衡されています。
7. タンパク質豊富なカラムを50 mMトリス-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-メルカプトエタノール、5%グリセロール、pH 8、約400 mLの30-60 mMイミダゾールを含む洗浄バッファーで洗い流し、その後、50 mM Tris-Cl、300 mM NaCl、5 mM β-メルカプトエタノール、5% グリセロール、pH 8、250 mM イミダゾールを含む洗脱バッファーでタンパク質を洗出します。
   注:イミダゾールの濃度や洗浄量は、分析対象のタンパク質によって異なる場合があります。純度を評価するにはSDS-PAGを行うべきです。溶出液がブラッドフォード試薬と陰性反応を示すまで、カラムを徹底的に洗浄することが不可欠です。溶出された部分は標的タンパク質の顕著で濃縮された帯を示し、これが主にサンプルを表し、他のタンパク質の痕跡はほとんど、あるいは全く含まれないはずです。
8. さまざまな分画を集め、SDS PAGで解析して純粋なタンパク質を含む分画を特定し、PD-10カラムを用いて反応バッファー(200 mM HEPES、100 mM MgCl₂、1 M KCl、pH 7.4の5%グリセロール)にバッファー交換を行います。
   注:タンパク質濃度はブラッドフォード試薬(Coomassie Brilliant Blue G-250)を用いて測定してください。すべてのタンパク質は液体窒素で急凍し、-80°Cで保存してください。

7. 体外 細菌殺菌アッセイ

1. VCP/p97 6 μM と NPLOC4 および UFD1 各 1 μM を組み合わせ、約90 μLまで反応バッファーで体積を満たします。この反応混合物を氷上で2時間培養します。
2. p97-UFD1-NPLOC4を含む反応混合物に1〜2 mMのATPを加え、ユビキチン化されたSPN(10⁷ 細胞)と37°Cで2時間結合します。
3. 細菌の生存可能性を評価するために、処理直後に反応混合物の1μlアリコートを取り、連続希釈(1:1、1:10、1:100、1:100、1:1000)を行い、各希釈のうち10〜2μLを脳心臓注入(BHI)寒天プレートに定着させます。この手順を、2時間の培養後に反応から1μLのアリコットを用いて繰り返します。
   注意:より良い結果を得るために、すべての希釈箇所を見極めてください。
4. 0時間と2時間の時間点の間のコロニー形成単位(CFU)を評価してください。細菌の生存率(%)は、2時間のCFUカウントを0時間のCFUカウントで割り、その結果に100を掛けて計算します。
   注:より信頼性の高い結果を得るためには、陰性対照として比較するために、熱変性VCP/p97、UFD1-NPLOC4補因子複合体を欠くVCP/p97、またはATPase欠失型のVCP/p97を陰性対照として使用してください。

結果

本プロトコルでは、哺乳類のA549細胞を利用して、ユビキチン化プロセスを開始するために必要な成分を豊富に含む細胞分解液を生成する方法を詳述しています(図1A)。この溶解液は、濃縮状態であれ、UBE1(E1ユビキチン活性化酵素)、UbE2C(E2ユビキチン共役酵素)、Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7複合体(E3ユビキチンリガーゼ)などの精製成分と置換されていずれも、精製されたユビキチンおよびATPと混合され、細菌の in vitro ユビキチン化を促進します(図1B)).ユビキチン化後のバクテリオリシス応答を評価するために、精製されたVCP/p97およびその補因子UFD1およびNPLOC4を反応に含めます(図1C)。

免疫蛍光を用いることで、哺乳類細胞...

ディスカッション

ここで詳述する 体外 再生システムは、細菌のユビキチン化と排除の分子的な複雑さを探るための堅牢な枠組みを提供しますが、いくつかの重要な制約を考慮する必要があります。ユビキチン化機構(E1、E2、E3リガーゼ、ユビキチン)および宿主エフェクター複合体(VCP/p97、UFD1、NPLOC4)を含む精製タンパク質の超生理的濃度への依存は、病原体のユビキチン化と除去に関する重要なメカニズム的洞察を提供しますが、生細胞内の生理的条件を正確に反映しているとは限りません。

細胞自律免疫系は複数のエフェクタータンパク質とユビキチンリガーゼからなり、これらは並行して感染を排除するためのフェイルセーフ機構として機能します。同様に、VCP/p97は単独では機能せず、他の因子や追加の分解経路の依存下にある可能性があります。我々の 体外 再構築は、細菌のユビキチン化および排除におけるRbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7およびVCP/p97の有効機能を単独で捉えていますが、これらはこれらのエフェクター...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
50Xプロテアーゼ阻害剤カクテル	プロメガ	G6521
6倍-ヒス-ユビキチン	UBPBio	E1100
A549細胞株	ATCC	ATCC CCL-185
アレクサ・フルー488	インビトロジェン	A21202
アレクサ・フルー 555	インビトロジェン	A-31572
抗ユビキチン抗体	エンツォ	BML-PW8810-0100
抗ユビキチンK48特異的クローンApu2抗体	シグマ・オルドリッチ	ZRB2150
ATP	シグマ・オルドリッチ	A6419
BHI	HiMedia	M210
DMEM(高血糖)	HiMedia	AL251
FBS	Gibco(アメリカ起源)	38220090
グリセロール	PureSynth	PSR37325
ヘペス	シグマ・オルドリッチ	H4034-100G
KCl	シグマ・オルドリッチ	P3911
MgCl2	シグマ・オルドリッチ	TC006
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	E6148
pET28a-p97プラスミド	私たちの研究室		プラスミドは要望に応じて提供可能
pET41b-NPLOC4プラスミド	私たちの研究室		プラスミドは要望に応じて提供可能
pET41b-UFD1プラスミド	アッドジーネ	プラスミド #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7	シグマ・オルドリッチ	23-030
肺炎連鎖球菌 R6株	ATCC	ATCC BAA-255	リスクグループ-2病原体はBSL-2施設で取り扱う予定
トッド・ヒューイット ブロスパウダー	HiMedia	M313
UBE1	UBPBio	B1100
UbE2C	UBPBio	C1300
尿素	HiMedia	MB032
酵母エキス粉末	HiMedia	RM027