骨髄間質細胞の移動をガイドするマイクロスケールの剛性勾配を持つ基板の微細加工

サマリー

このプロトコルは、ソフトリソグラフィーによる二重層ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板の製造について詳しく説明します。この方法は、柔らかい平らな最上層と組み合わせた剛性下層の幾何学的に変調された微細構造を利用して、マイクロスケールの効果的な剛性勾配を生成し、トポグラフィーの干渉なしに細胞メカノバイオロジー研究を可能にします。

要約

細胞が機械的シグナルにどのように反応するかを理解することは、組織の発達と病気の進行に関与するメカニズムを解明するために非常に重要です。しかし、既存の in vitro 細胞培養基質は、交絡するトポグラフィーの手がかりを排除しながら、細胞スケールで生理学的剛性勾配を再現できないことがよくあります。本研究では、二重層ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板を利用した分離剛性モデルを提示する。この基板は、リッジアンドグルーブの微細構造を特徴とする剛性のある下層の上に吊り下げられた柔らかく平らなトップフィルムで構成されています。最上層は、細胞接触面で均一なトポグラフィーと化学的性質を維持しながら、下にある構造の剛性の変化を効果的に伝達します。剛性の変調は、等間隔に配置された交互の隆起と溝の幅を変化させることによって実現されます。走査型電子顕微鏡により、平面の形態と一貫した接触トポグラフィーが確認されました。原子間力顕微鏡は、剛性の変化が微細構造に依存することを実証しました:20 μmパターンの場合、弾性率は隆起で約950 kPa、溝で約850 kPaでした。50 μmパターンの場合、これらの値はそれぞれ約1070 kPaと950 kPaでした。マウス初代骨髄細胞は基質上によく付着して広がり、50μmパターン(61.49%、p < 0.05)でより硬い隆起領域に向かって核局在を好むことを示し、それによって機械的勾配の効果的な細胞知覚を確認しました。要約すると、このプロトコルは、マイクロスケールの剛性勾配で細胞培養基質を構築するための再現性のある方法を提供し、化学的またはトポグラフィーの干渉を最小限に抑え、細胞の機械形質導入の研究を可能にします。

概要

細胞は、外部微^{小環境1,2,3}内の機械的刺激を感知して応答する能力を持っており、これは接着、遊走、増殖、分化などのさまざまな細胞プロセスを調節するために重要です⁴。In vivoでは、組織微小環境の機械的特性は有意な空間的不均一性を示し、骨と筋肉の接合部などの生理学的状況と腫瘍内などの病理学的状態の両方でマトリックス剛性の変動が観察されます^5,6,7。これらの機械的要因の包括的な調査は、細胞の挙動を支配する調節メカニズムを理解するために不可欠です。これらのメカニズムは、組織の発達、疾患の進行、再生と修復のプロセスなどのプロセスにおいて極めて重要です^8,9。

この複雑な機械的微小環境をin vitroでシミュレートするために、ヒドロゲルまたはエラストマーが広く使用され、架橋の程度または成分比^{3、10、11、12、13}を調整することにより、さまざまな剛性を持つ基板を作成します。ただし、これらの方法は、生理学的条件を正確に模倣する連続的なマイクロスケールの剛性勾配を再現できない離散的な剛性変化をもたらすことがよくあります^{13、14、15、16、17}。最近の研究では、光学架橋(例えば、フォトマスクを使用してUV曝露を調節する)¹⁸、マイクロ流体マルチチャネル混合^19,20、および剛性勾配を構築するための拡散駆動手段²¹などの技術が調査されています。残念ながら、これらのアプローチは技術的に複雑であり、メッシュサイズ²²、膨らみ^23、24、地形²⁵などの追加の変数が発生する可能性があります。外乱因子の導入は、剛性に対する細胞応答の解釈を複雑にします。マイクロピラーアレイまたは市松模様を支持構造として利用する二層PDMSシステムは、剛性勾配^26,27を持つ細胞培養基質を作成するために採用されている。これらのアプローチは、化学的に均質な膜の下にある個別の下層支持体に依存して等方性剛性変調を実現し、細胞の接着と拡散を調査するための貴重なプラットフォームを提供します。しかし、生体内の天然細胞微小環境は、その機械的特性においてしばしば高度に異方性である^28,29。この指向性のある機械的シグナル伝達は、基本的な生物学的事象に大きな影響を与えると仮定されています。したがって、現在のバイオファブリケーション戦略は、細胞負荷基質内のマイクロスケールの剛性勾配と空間的不均一性を正確に模倣することに依存し、生体内で観察される微妙な細胞硬さ相互作用を再現する能力に限界があります。

以前の研究では、細胞が細胞に直接接触していない場合でも、硬い物体の有効剛性を知覚できることが実証されています³⁰。この研究に基づいて、細胞内および単細胞メカノセンシングに関連するサイズ範囲に合わせて、5〜50μmの範囲の空間スケールで制御された剛性勾配を生成する新しい二層ポリジメチルシロキサン(PDMS)細胞培養基質を紹介します。基板は、調整可能な幾何学的微細構造を特徴とする剛性PDMS下層と、細胞接触面として機能する均一で平らな柔らかいPDMS上層の2つの異なる層で構成されています。この設計により、一貫した表面化学的性質とトポグラフィーを維持しながら、下部構造形状の変化のみによる機械的変調が可能になります。その結果、剛性信号を他の物理的および化学的手がかりから効果的に切り離し、剛性変調のためのより生物学的に関連するシステムを提供します。

従来のヒドロゲルベースの基板とは対照的に、当社のアプローチにより、膨潤、メッシュサイズ、または表面トポロジーによる干渉を受けることなく、単一変数の機械的研究が可能になります。基板は、標準的なソフトリソグラフィを使用して簡単に製造でき、再現性が高い³¹。また、高解像度顕微鏡と互換性があるため、マイクロスケールの剛性の手がかりに対する細胞応答のライブタイムイメージングや定量的研究に特に適しています。この原稿は、完全な製造プロトコルを示し、パラメータ制御戦略を詳細に説明し、代表的な細胞培養実験で基質の有用性を実証します。最終的に、このアプローチは、マイクロスケールの剛性勾配に対する細胞応答を調査するための堅牢でアクセスしやすい in vitro ツールを提供します。

プロトコル

初代マウス骨髄間質細胞(mBMSC)をマウスの脛骨および大腿骨から単離しました(No.WP20230204武漢大学動物実験センター倫理委員会によって承認されました)。

1. 金型の準備をマスターする

注:私たちのプロトコルは、この研究中に使用されたエポキシベースのネガフォトレジストに固有のものです。

1. 2つのきれいなシリコンウェーハ(50.8±0.2mm、<100>配向、525±25μm)をホットプレートに数分間置き、脱水します。
2. ホットプレートからシリコンウェーハを1枚取り出し、室温まで冷やしてからスピンコーティングを進めます。3〜5mLのフォトレジストをウェーハ中心に塗布します。
3. 20 μmの特徴高さを得るには、次のスピンプロトコルを適用します:7.1 × gで10秒間スピンし、続いて410 × g で30秒間スピンします。30 μmの特徴高さを得るには、次のスピンプロトコルを適用します:7.1 × gで10秒間スピンし、続いて170 × g で30秒間スピンします。メスを慎重に使用して、スピンコーティング中に形成される可能性のあるエッジビーズを取り除きます。
4. 次の方法でソフトベイクします:ホットプレートを95°Cに設定し、ウェーハをホットプレートに13分間置きます。ウェーハをホットプレートから取り出し、急激な温度低下を避けて室温まで自然に冷まします。
5. フォトレジストでコーティングされたウェーハ上のフォトマスクを整列させ、総線量120 mJ/cm²のUV光にさらします。
6. 露光後焼成は、2つのホットプレート(65°Cと95°C)を使用して、フォトレジストでコーティングされたウェーハを65°Cのホットプレートに1分間置いてから、95°Cのホットプレートに移し、5分間放置します。ウェーハをマイクロファイバー組織のスタック上に移動し、室温まで冷却します。
7. PGMEAを充填したペトリ皿に移してウェーハを現像し、ウェーハ全体を現像液に沈めます。手動撹拌で開発を加速します。
   注:PGMEAは可燃性であり、目や気道を刺激します。専用容器に「可燃性有機廃棄物」として処分します。
8. 現像後、現像液からウェーハを取り出し、イソプロパノールで洗浄します。サンプル表面近くのイソプロパノールに乳白色の流れが形成された場合(現像が完了していない)、サンプルを現像液に再度浸漬して、現像プロセスを完了します。現像したサンプルをイソプロパノールで、サンプル表面近くに乳白色の流れが形成されなくなるまで洗浄します。完全に現像したら、ウェーハを150°Cのホットプレートに15分間置いて、フォトレジストをハードベイクします。
9. 次のソフトリソグラフィプロセスのためにウェーハをフッ素化します:ウェーハを真空下で酸素プラズマに30秒(100 W)さらして表面を活性化し、真空デシケーターに入れます。30 μLのトリクロロ(1H、1H、2H、2H-トリデカフルオロ-n-オクチル)シランを真空デシケーター内に置いたスライドガラスに滴下します。デシケーターを2分間排気し、真空状態を30分間維持します。ウェーハを90°Cで1時間焼成して、シラン化プロセスを完了します。
   注意: プロセス全体を通して、周囲の相対湿度を60%未満に厳密に制御してください。過剰な水分はシランの急速な加水分解を誘発し、白色の不揮発性ポリシロキサン沈殿物を生成する可能性があります。沈殿物はシラン蒸気分布の均一性を損ない、シラン化に失敗します。トリクロロ(1H、1H、2H、2H-トリデカフルオロ-n-オクチル)シランが水と激しく反応し、有毒なHClヒュームを放出するため、フード内で処理を行います。フッ素・塩素化有機廃棄物として処分する前に、希アルカリで中和してください。シラン化プロセスは90%の成功率を達成します。

2. 製造

注:二重層ポリジメチルシロキサン(PDMS)基板の製造に使用されるソフトリソグラフィープロセスは、2つの異なるステップに分けることができます:1)構造化された下層と最上層の両方の調製、2)2つのPDMS層の結合。全体の製造歩留まりは80%以上です。

1. PDMSの準備
   1. 構造化下層については、プレポリマーと硬化剤を重量比10:1の割合で混合し、真空下で脱気してPDMS前駆体を調製します。1.5 mLのPDMS前駆体(10:1)をSU8マスターモールドに流し込み、表面全体を覆い、真空下で脱気し、30分間休ませます。慎重にオーブンに移し、90°Cで1時間硬化させます。構造化されたPDMS下層をマスターモールドから離型します。
   2. 最上層については、プレポリマーと硬化剤を重量比30:1で混合し、真空下で脱気することにより、PDMS前駆体を調製します。PDMS前駆体をフッ素化シリコンウェーハに流し込みます。9 μmの厚さを得るには、次のスピンコーティングプロトコルを適用します:7.1 × g で10秒間スピンし、続いて2,300 × g で60秒間スピンします。
   3. スピンコーティング後、周囲光の下でPDMSフィルムを目視検査して均一性をチェックし、特に縞、気泡、不均一なエッジの蓄積などの目に見える欠陥がないか調べます。フィルムがウェーハ表面全体にわたって一貫した反射率で均一に透明に見える場合は、次のステップに進みます。そうでない場合は、新しいウェーハでスピンコーティングプロセスを繰り返します。コーティングされたウェーハを水平面に置き、PDMS膜厚を均一にします。慎重にオーブンに移し、90°Cで3時間硬化させます。
      注:厚さ9.11±0.34μmのフィルムが得られました。
2. ボンディング
   1. パターン化された面を下に向けて構造化されたPDMS下層(10:1)をPDMS最上層フィルムに置き、界面で気泡がなく2つの層間の良好な接触を確保します。
   2. アセンブリをオーブンに移し、90°Cで3時間硬化させます。
   3. マイクロファイバーティッシュのスタック上でアセンブリを室温まで冷却します。最終的な二重層構造をウェーハから切り離し、さらに使用するためにペトリ皿に保管します。
      注: 剥離中に最上層と下層の間に気泡が形成される場合は、通常、2 つの層間の接着が不完全であることを示しています。スピンコーティングの前にPDMS前駆体の徹底的な脱気を保証し、PDMS下層を完全に接触させる前に、フィルム表面にほこりや汚染物質がないことを確認します。スピンコーティング、組み立て、硬化中にシリコンウェーハが水平であることを確認します。ウェーハのシラン化が不均一になったり、PDMSの厚さが不均一になったりすると、膜の引き裂きが発生することがあります。この問題を解決するには、シラン化中の環境湿度を60%RH以下に厳密に制御します。シラン化プロセスは90%の成功率を達成します。

3. 特徴付け

1. 走査型電子顕微鏡(SEM)
   1. 鋭利な刃でサンプルを切断し、きれいなエッジを取得します。
   2. 導電性カーボンテープを使用してサンプルを90°および0°のSEMステージに取り付け、それぞれ断面および表面の特性評価を可能にします。
   3. サンプルを120秒間金でスパッタコーティングして、SEMイメージング品質を向上させ、サンプルのSEM画像を収集します。
2. 原子間力顕微鏡(AFM)
   注:弾性率の定量的ナノメカニカルマッピングには、ScanAsyst-Airプローブを選択してください。
   1. AFMカンチレバーチップを視野の中央に配置します。光学レバーシステムを位置合わせして、レーザースポットをカンチレバーの端に配置します。
   2. PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping(PeakForce QNM)測定の前に、AFMカンチレバーを校正して、次の重要なパラメータを決定します。 カンチレバースプリング定数:0.40135 N/m;たわみ感度:28.993 nm/V (剛性基準サンプルで力曲線を実行することによって決定)。 チップ半径:~21 nm (既知の弾性率を持つ参照サンプルに対して相対法を使用して校正)。
   3. スキャンパラメータリストのスキャンパネルで、次の初期スキャン設定を構成します。50 μm間隔の周期的なストライプを特徴とするサンプルの場合、スキャンサイズを70 μmに設定します。スキャンサイズを50μmに設定し、20μm間隔の周期的な縞模様を特徴とするサンプルに設定します。[サンプル/線] と [線] を 256 に設定します (256 x 256 ピクセルの画像になります)。
   4. 顕微鏡で[Engage Settings]を開き、Engageパラメータで機器のデフォルトのPeak Force Engage設定値を設定します。
   5. ワークフローツールバーの「エンゲージ」アイコンをクリックし、自動アプローチ中のリアルタイム信号の監視を続行します。
   6. ScanAsyst Auto Control が [Individual] モードに設定されていることを確認します。 PeakForce Setpointを適切な値に調整して、目的の変形範囲を達成します。最上層の場合、PeakForceセットポイントは0.020 nNです。構造化アンダーレイヤーの場合、ピークフォース設定値は5 nNです。
   7. 上から下または下から上へのボタンをクリックして、スキャンを開始します。
   8. フォースカーブの監視と補正: フォースカーブが歪んでいるように見える場合、または同期の問題(不規則な形状、一貫性のないベースラインなど)が観察された場合は、 フォース モニターウィンドウ内を右クリックして自動 設定 を選択すると、フォースカーブのアライメントと感度が自動的に修正されます。
   9. 弾性率計算チャネル設定内で、弾性率の計算のために力曲線の引き込み部分をあてはめるDMTモデルを選択します。
   10. キャプチャボタンをクリックすると、高解像度のトポグラフィーとナノメカニカル特性マップを取得して保存できます。
   11. AFM画像処理および解析ソフトウェアを使用して取得後の分析を実行します。保存したAFMデータファイルを開き、サンプル表面の領域を選択して弾性率値を抽出します。ソフトウェアに組み込まれている統計分析ツールを使用して、最上層と下層の両方の平均弾性率、標準偏差、および分布プロファイルを計算します。処理されたモジュラスマップと定量データをエクスポートします。
   12. サンプルあたりのAFMスキャン数:サンプルごとに3つの独立したフルエリアスキャンを実行します。各スキャンは、サンプルの構造的特徴サイズに一致する領域、つまり50μm間隔の周期的なストライプを持つサンプルの場合は70μm×70μm、20μm間隔のストライプを持つサンプルの場合は50μm×50μmをカバーしていることを確認します。下地構造(10:1 PDMS)と最上層フィルム(30:1 PDMS)の弾性率測定では、データの信頼性を確保するために、次のサンプリング戦略を実装します。
       1. 最上層フィルム(30:1 PDMS):2つの重複しない5 μmスキャン×5 μmスキャンで構成される各測定で、モジュラスを2倍独立して測定します。
       2. 基礎となる構造(10:1 PDMS):2つの異なる周期的なストライプ構成(20 μmと50 μmの間隔)を考慮して、各構成でモジュラスを2倍独立して測定します。

4. in vitro 細胞培養実験

注:PDMSは疎水性材料であり、細胞培養前に細胞接着を促進するためにコーティングする必要があるため、細胞の種類に応じて適切なコーティング方法を選択する必要があります。初代細胞を細胞実験に使用する場合は、倫理的承認を得る必要があります。

1. ポリ-D-リジン(PDL)コーティング
   1. アルコール浸漬により基材を10分間滅菌する。次に、PBSで3 x 5分間洗浄します。
   2. PBSを用いてPDL(分子量150,000〜300,000 Da)を0.1 mg/mLの濃度で溶解する。24ウェルプレートサイズの基質の場合、1 mLのPDL作業溶液を加え、37°Cのインキュベーターに4時間入れて、基質表面を完全にコーティングします。
   3. コーティングが完了したら、PDL作業溶液を除去し、PBSで3回洗浄して残留PDLを除去します。基質を後続の細胞実験に使用します。コーティングをすぐに使用しない場合は、乾燥させて4°Cで保管してください。
      注:コーティングが成功すると、位相差顕微鏡下で均質で特徴のない表面が得られ、目に見える結晶沈殿物や乾燥アーティファクトはありませんでした。結晶化または不均一なコーティングの兆候がある基板は廃棄されました。
2. 初代マウス骨髄間質細胞(mBMSC)の単離と培養
   1. マウスの脛骨と大腿骨から初代マウス骨髄間質細胞(mBMSC)を単離します。
   2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1%抗生物質-抗真菌薬、および1%ピルビン酸ナトリウムを添加したα-MEMからなる増殖培地で細胞を培養します。
   3. ステップ4.1.3で得られた基質に5,000細胞/^cm2 の密度で継代3で細胞を播種し、細胞間接触による潜在的な交絡効果を最小限に抑えます。
3. 免疫蛍光染色とイメージング
   1. 16時間培養(37°C、5%CO₂)の後、細胞を室温で10分間4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBSで3回洗浄します。次に、細胞を0.1%Triton X-100で室温で15分間透過処理し、PBSで3回洗浄します。
   2. 細胞骨格の可視化のために、ファロイジン(1:500希釈)を使用してF-アクチンを室温で20分間染色し、十分なPBSで3回洗浄して残留色素を除去します。
   3. 細胞核の同時染色で基板をマウントします。DAPIを含むグリセリンを一滴塗布して細胞を覆います。その後、カバーガラスを基材の上に慎重に置き、マニキュアで余白を密閉します。泡はできるだけ避けてください。
   4. 倒立蛍光顕微鏡を使用して、細胞の形態と核の位置をキャプチャした蛍光画像を取得します。

結果

フォトリソグラフィは、平行なリッジアンドグルーブの微細構造を特徴とする再利用可能なシリコンマスターモールドを製造するために使用されました。溝幅(畝幅は溝幅と同じ)をそれぞれ20μmと50μmとする2つのデザインを作成しました。各パターン領域は 7 mm × 7 mm で測定されました。シリコン金型の精度と再利用性により、基板製造を繰り返すプロセスが大幅に簡素化されました。次に、マスター金型を使用して、PDMSの微細構造を複製しました。硬質PDMS配合物をシリコンに対して成形して下層を作成し、その後、その上に薄く柔らかく平らなPDMSフィルムで接着し、二層システムを作りました。

図1は、剛性勾配を含む中央の正方形の領域を含み、剛性制御として機能する平坦な領域で囲まれた、製造された二重層基板を示しています。SEM画像は構造移動の忠実度を確認し、勾配領域に平らで地形的に特徴のない上面を明らかにしました(図2)。この設計により、基質上で培養された細胞は、地形の手がかりによ...

ディスカッション

この研究は、地形的に均一な特徴のない表面を維持しながら、局所的な剛性変動を導入するように設計された二層PDMSベースの基板を設計するための新しいアプローチを提示します。このアプローチにより、表面化学的性質とトポグラフィーを一貫した状態に保ちながら、下部構造形状の変化のみによる機械的変調が可能になります。その結果、剛性信号を他の物理的および化学的手がかりから効果的に切り離し、剛性変調のためのより生物学的に関連するシステムを提供します。

この研究では、剛性変調は、剛性の下部のPDMS層の形状を調整することによって達成され、上部の薄くて柔らかいPDMS層は、さまざまなセルタイプやイメージングシステムとの幅広い互換性を保証するフラットな接触界面を保証します。完全に架橋されたヒドロゲルまたは離散的な剛性レベルのバルクPDMS基板に依存する従来の方法と比較して、このアプローチはより高い空間分解能と連続性を提供します。これにより、単一の基板上に複数の剛性領域が可能になり、実験の比較可能性が向上し、バッチのばらつきが最小限に抑えら...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4% パラホルムアルデヒド	サービスバイオ・テクノロジー	G1101
アセトン	上海アラジン	10000418
アンチ・アンチ	ギブコ	15240-062	抗生物質-抗菌薬
DAPIを用いたアンチフェードマウントメディウム	ビヨタイム・バイオテクノロジー	P0131	グリセリンをDAPI で投与;
細胞培養プレート	巣	702001	24井戸
デシケーター	四川樹保(グループ)有限公司	913354-30SN	内径=180mm
胎児用牛血清	ハイクローン	SV30208.02
逆転蛍光顕微鏡	オリンポス	DP74
イソプロパノール	上海アラジン	80109218	GC≥99.7%
マスクアライナー	四川南光真空技術有限公司	H94-37
MEMアルファ改造	ハイクローン	SH30265.01
ナノスコープ解析	ブルーカー	バージョン3.0	AFM画像処理および解析ソフトウェア。
オペラフェニックスプラス高コンテンツイメージングシステム	パーキン・エルマー	2400L23248	10倍の対物レンズ装備
PGMEA	蘇州ナノマイクロテクノロジー有限公司	171011-1	現像液 ネガフォトレジスト;スペック:UL;パーセント:最低99.7%
ファロイディン	Uelandy	YP0052L	594-ファロイジン
リン酸塩緩衝生理食塩水溶液	ハイクローン	SH30256.01
プラズマクリーナー	プラズマ技術(ドイツ)	フレクト 10
ポリ-D-リジン	ビヨタイム・バイオテクノロジー	ST508	CAS番号27964-99-4
走査型プローブ顕微鏡	ブルーカー	ディメンションアイコン	PeakForce定量ナノメカニカルマッピング(PF-QNM)やポイント&シュートランプ実験ワークスペースを含むナノスコープ制御ソフトウェアを使用しています。
窒化物レバー上のシリコンチップ	ブルーカー	スカナシスト・エア	プローブは単一のV字型のAl反射コーティングされたカンチレバーを特徴としています。k=0.4 N/m(名目上)、f0=70 kHz。
シリコンウエハ	深圳厳格科技有限公司	-	50.8 & plusmn;直径0.3mm、(100)の方位、525以上;25 & mu;厚さm(m)
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	11360-070
スピンコーター	中国科学院マイクロエレクトロニクス研究所	KW-4A
SU-8 3025	蘇州ナノマイクロテクノロジー有限公司	-	ネガフォトレジスト;72.3%固形物;粘度4400;密度 1.143g/ml
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	ダウ・ケミカル社	01673921
トリクロロ(1H,1H,2H,2H-トリデカフルオロ-n-オクチル)シラン	上海アラジン	78560-45-9
トライトン X-100	バイオフロックス	1139ML100	透水性には0.1%のトリトンX-100
トリプシン-EDTA	ギブコ	25200-072	0.25% トリプシン-EDTA(1倍)
真空オーブン	メマート(ドイツ)	VO 200