バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

Summary

このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。

Abstract

涙液脂質は涙膜の安定性と眼表面の健康に不可欠です。涙液組成の変化は、マイボーム腫機能障害や脂質異常などの眼および全身疾患と関連している可能性があります。涙脂質のプロファイリングは、疾患診断や管理のためのバイオマーカー発見に役立つ可能性があります。しかし、一般的な涙液採取法には明確な制約があります。シルマーストリップは眼表面との接触面積が大きいため眼の刺激や不快感を引き起こすことが多い一方、微小毛細血管チューブ採取は操作者によるばらつきにより再現性が低いことがあります。特に異なる担当者によって実施された場合です。これらの制限はリピドームデータの正確性と一貫性を損なう可能性があります。本研究は、涙脂体学に最適化された低侵襲フェノール赤糸(PRT)を用いたサンプリング法を導入します。PRTの薄い構造は眼の刺激リスクを最小限に抑え、迅速かつ穏やかな涙の蓄積を可能にします。この使いやすく実行しやすい方法は、涙液量が減少したり異物感覚に耐性が低い被験者に適しており、操作者による変動を減らすことでより再現性の高いサンプル採取を可能にします。PRTで採取された涙脂質は、最適化されたメタノール/メチル三乙-ブチルエーテル(MTBE)相分離プロトコルを用いて抽出され、高解像度のLC-Orbitrap-IQX MS/MSとLipidSearchソフトウェアで解析されました。ワークフローでは、特定の脂肪酸由来生成イオンによって特徴づけられる700種以上のユニークな涙脂質種が特定されました。これらの結果は、PRTベースのサンプリングが涙液リピドーム解析において強力な脂質回収を提供することを示しています。この低侵襲かつ再現性のあるアプローチは、臨床および実験的な涙液脂質研究の実用的な基盤を提供します。最終的には、バイオマーカーの発見や疾患のモニタリングも促進する可能性があります。

Introduction

涙膜は病原体から眼表面を保護し、眼の恒常性を維持する最外層の障壁です。^1,2。一方、涙膜内の脂質層は涙液の蒸発を防ぎ、涙液の安定性を維持する重要な要素です。^3,4。涙脂組成の調節障害は、ドライアイ症(DED)、マイボーム腺機能障害(MGD)、アレルギー性結膜炎5,6,7,8など、さまざまな眼疾患と関連しています。その結果、涙リピドミクスの詳細な特性評価は、これらの^眼疾患の分子病理をより包括的に理解するための重要かつ注目される研究方向となっています。

ティアリピドミクスアプローチは臨床的に重要な役割を果たしますが、ティアリピドミクスにおける重要な課題は、標準化され再現性のある収集および解析ワークフローを確立することです。現在のティアサンプリング法、シルマーストリップ、微小毛細血管チューブはそれぞれ独自の制約を持っています。シルマーストリップは眼表面との接触面積が大きく、しばしば眼の刺激や反射の裂傷を引き起こす^9,10。比較すると、微細毛細管の採取は操作者の技術に大きく依存し、異なる人員によって行われると結果が一貫性に欠けることがあります^。さらに、これらのサンプリングツールの不適切な使用は眼表面損傷のリスクも伴います。これらの制限は、下^{流データの正確}性や再現性を損なう^{可能性があります。}さらに、複雑な取り扱い手順を必要とする涙液採取方法は、その利用性や標準化を異なる検査室や臨床環境間で制限することがあります。したがって、非侵襲的で堅牢かつ再現可能な涙液収集および処理ワークフローを確立し、自然な涙脂質プロファイルを保存する必要性が急務です。

最近の研究では、プロテオミクスおよび代謝学的応用における下流のLC-MS/MSワークフロー解析におけるフェノールレッドスレッド(PRT)の有用性が強調されています^14,15。PRTは涙を採取する手段として本質的な利点を持っています。その薄い構造、低侵襲性、単純なサンプリング手順により、技術的な複雑さを最小限に抑え、操作者依存の変動を減らしつつ、ほとんどの被験者に良好に耐えられる^14,16。しかし、PRTベースの涙液脂質分析専用の標準化されたワークフローはまだ確立されていません。

このプロトコルは再現可能な涙脂質学のための統合ワークフローを導入します。脂質分析に適したユーザーフレンドリーなPRTベースの涙液採取法、定義された溶媒対サンプル比と保存制御を持つ最適化されたメチルテルト-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール脂質抽出プロトコル(^17,18)、そして高解像度LC-MS/MSを用いた修正脂質同定法です。この標準化されたアプローチにより、下流バイオマーカーの発見や疾患の特徴付けのための一貫したティアリピドミクスプロファイリングが可能になります。また、涙液量が少ない、または異物感覚に対する耐性が低い被験者に特に適しています(図1)。

図1:ヒト涙リピドミクスにおけるフェノール・レッドスレッド(PRT)ベースのワークフローの概説。PRTアプローチを用いる被験者から涙液を採取し、不快感を最小限に抑えつつ安定したサンプル採取が可能です。試料処理には、連続的なMTBE/メタノール二相抽出、SpeedVac媒介濃度、および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)用の涙液脂質抽出物の再構成が含まれます。リピドミックプロファイルはその後、LC-MS/ MSで 取得され、LipidSearchソフトウェアを用いて注釈と同定が行われます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Protocol

この研究は香港理工大学の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。被験者は参加前に書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. フェノール・レッドスレッド(PRT)を用いたヒト涙液の採取

1. サンプル汚染を防ぐために手袋を着用し、作業台を消毒してください。
2. PRTパッケージが密封されていて期限切れでないか開ける前に必ず確認してください。
3. 曲がったフックの反対側の端で糸を持ったまま持っておきます。PRTの曲がったフック半分には必ず触らないでください。
4. 被験者に上鼻の方向を見るように促します。
5. 被験者の下まぶたを優しく下ろし、曲げたフックを被験体の外眼角近くの側頭側頭瞼結膜に位置させてPRTを挿入します(図2)。

図2:涙液収集中のフェノール赤糸の位置。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. 被験者に目を優しく閉じ、頭を少し前に傾けてPRTが顔の皮膚に触れないように促します。
   注:涙を吸収すると徐々に赤い染料の前線が誘導され、pH感受性フェノールレッドによるPRTのサンプル領域を示します。リピドーム分析に必要な十分な涙液を確保するために、通常2分以内に50 mmのPRTに相当する涙液の収集が望ましいです。
7. 被験者の下まぶたを優しく下ろし、サンプル化されたPRTを取り出します。サンプリングされた領域に触れないようにしてください。
8. PRTの採取部位の長さを記録し、滅菌鉗子の助けを借りてPRTを新しいサンプルチューブに移します。
   注意:サンプルされたPRTの長さが<50mmの場合は、被写体に1〜3分間休んでもらい、同じ目で再度採集してください。各サンプルPRTを別のサンプルチューブに移します。
9. サンプルチューブには適切にラベルとキャップを貼ってください。
10. 手袋と鉗子はメタノールでしっかり洗浄し、紙拭きで涙の残留物や汚染物を除去し、その後乾かしてください。
11. もう片方の目についてもステップ1.2-1.10を繰り返します。
12. サンプルチューブをパラフィルムで密封し、すぐに-20°Cで一時保存、-80°Cで長期保存します。不要な凍結・解凍のサイクルを避け、サンプリングされたPRTを光から守りましょう。

2. サンプリングPRTの処理

1. PRTを処理する前に、マイクロハサミをメタノールで事前に洗浄してください。
2. PRTの曲がったフックエンド(すなわち最初の3mm)は廃棄します(図3)。

図3:フェノールレッド糸(PRT)の物理的外観。(A) 曲がったフックの端を持つ未使用PRT。(B) PRTを切断し、脂質抽出のために採取した 。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. PRTのサンプル領域(フェノールレッド染料の前面より上)を2mmの片に切り、これらの片をクリーンな1.5 mL有機溶媒耐性マイクロ遠心分離機チューブに移します。

3. サンプルPRTからの脂質抽出のためのMTBE/メタノール二相分離

注意:MTBEとメタノールは可燃性かつ揮発性です。換気の良い場所や排気フードで使用してください。炎や火花は避けてください。手袋と白衣を着用してください。手を取った後は必ず手を洗いましょう。

1. サンプルを氷の上に置いてください。
2. 各サンプルに232μLの氷冷メタノール(MSグレード)を加え、15秒の渦を流します。
3. サンプルを予冷の超音波洗浄剤で15分間ソニック処理します。
4. 各サンプルに774μLのMTBE(HPLCグレード)と194μLの脱イオン水を加え、15秒間ボルテックスします。サンプル中のMTBE:メタノール:水の体積比は4:1.2:1(v/v/v)であるべきです。
5. サンプルを予冷の超音波洗浄液で再度15分間超音波処理します。
6. サンプルをサーモミキサーで4°Cで8時間キュベートし、1,200rpmで振る。
7. 混合物を室温で10分間置きます。
8. 生成された混合物を10,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
9. 遠心分離後、混合物は2つの相に分離されます(図4)。
   注意:相分離が完了した後、サンプルの2つの異なる層を検査してください。上部有機相(MTBEリッチ)は透明でわずかな乳白色の不透明度を持ち、下部水相はフェノール赤色指示剤の存在により黄色い色合いを示します。 図4に示すように、これらの位相特性が観測された場合のみ進行してください。

図4:MTBE-メタノール水を用いた脂質抽出の相分離:上部有機相と下部水相。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

10. 脂質を含む上部有機物分率700μLを慎重に採取し、事前に冷却された新しい1.5mLマイクロ遠心分離機チューブに移します。
11. 残留MTBEやメタノールを含む下部水相は有害化学廃棄物として廃棄してください。廃棄物はラベル付きで密封された容器に収め、機関の有害廃棄物プロトコルおよび地域の規制に従って処分してください。溶剤を排水口に流し込まないでください。
12. 脂質抽出物は冷蔵のSpeedVac濃縮器で4°Cで4時間乾燥させます。
    注意:完全な乾燥を確実にするために、2時間から定期的に試料の乾燥度を確認してください。サンプルが完全に乾燥するまで必要に応じて乾燥時間を延長してください。
13. 乾燥脂質抽出物は短期保存は-20°C、長期保存は-80°Cで保存します。

4. 抽出された涙脂質の再構成(LC-MS/MS分析用)

1. 乾燥脂質抽出物を、50μLの氷冷メタノール(MSグレード)/クロロホルム(HPLCグレード)混合物(1:1、v/v)を溶媒として再構成し、その後、予冷の超音波洗浄器で15分間超音波検査を行います。
2. 再構成した脂質抽出物を14,000 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。
3. 上清液40μLを慎重にオートサンプラーのガラスバイアルに移し、ガラスインサートを取り付けます。
4. バイアルは切り離さない中隔の開口キャップでしっかり蓋をしっかり閉め、LC-MS/MS分析の準備をします。

5. LC-MS/MSによるサンプル取得

1. 液体クロマトグラフィーでは、カラムチャンバーとサンプラーの温度をそれぞれ50°Cと4°Cに設定します。
2. 各注入ごとに、5μLの試料を逆相LCカラム(C18;1.7μm、100mm×2.1mm)に積み込み、24分間隔勾配で0.3mL/minの流量で脂質を分画します。
   1. 移動相Aは、60:40アセトニトリル(MSグレード):水(v/v)に5 mMのアンモニウムホルマテ(MSグレード)、0.1%(v/v)の蟻酸(MSグレード)、移動相B(90:10イソプロパノール(MSグレード):アセトニトリル(v/v)と5 mMのアンモニウムホルマテ、0.1%(v/v)の蟻酸を含む混合物から構成されます。
   2. 以下の勾配を用いてください:0-2分:40% B;2〜2.5分:40%B;2.5〜3分:58% B;3〜18分:99%B;18〜20分:99%B;20-20.1分:40%B;20.1〜24分:40%B。
3. オービトラップ質量分析計では、正モードにスプレー電圧を+3.5 kV、負モードで-2.5 kVに設定します。
4. シースガス流量を45 Arb、補助ガス流量を10 Arbに調整します。
5. スイープガス流量を2Arbに設定してください。
6. イオン転送チューブの温度を300°C、蒸気化器の温度を320°Cに設定します。
7. データ依存取得(DDA)モードを使用してください。
8. MS1では解像度を120,000、スキャン範囲を100-2000 m/z、標準AGCターゲット、自動注入時間、動的排除を6秒に設定、強度閾値を5.0e4に設定します。
9. MS2では、解像度を15,000、オートスキャン範囲、標準AGCターゲット、動的注入時間、1.6 m/zのアイソレーションウィンドウ、衝突エネルギータイプを高エネルギー衝突解離(HCD)、正規化衝突エネルギー(NCE)を15、30、40の段階的な数値に設定します。
10. LipidSearchソフトウェアや他の対応プラットフォームで生データを解析してください。

Results

複合涙液サンプルは、2週間間隔を空けて3回の独立した訪問(R1、最古バッチ;R2、R3はそれぞれ2週間後に連続して採取しました。厳格な基準(信号対雑音比≥100、グレードC以上、イオン強度≥30,000)を用いた脂質検索を用いて、それぞれR1-R3で773種、890種、1,025種のユニークな脂質種を同定しました(図5A)。陽イオンモードでは、26.0%がグレードA(すなわち脂質クラスと特定の脂質に属するすべての脂肪酸鎖が完全に同定され、338種類の脂質)、13.2%のB級(脂質クラスの完全な同定および脂肪酸鎖の部分的同定)、60.8%のグレードC(脂質クラス特異的イオンまたは脂肪酸由来生成イオンイオンが検出)の1,302種が同定されました。負イオンモードは、8.2%がAグレード(21種類の脂質)、22.9%がBグレード、68.9%がCグレードである257種のユニークな脂質種を特定しました(図5B)。統合解析により、両モードで合計1,559種のユニーク...

Discussion

PRTベースの涙採取と脂質抽出の利点
ここで紹介するPRTベースのティアリピドミクスワークフローは、包括的な涙脂質プロファイリングのための低侵襲かつ実用的なサンプリング方法を提供します。長時間の接触と大きなサンプル量を必要とするシルマーストリップと比べて、PRTサンプリングは迅速で2分以内に完了可能、涙液量が減少したり眼感度が高い人など多様な集団に良好に耐えられ、高解像度のLC-MSリピドミクスと互換性のある涙液サンプルが得られます^14,20.微小毛細血管チューブ採取は時間がかかり、正確な技術的取り扱いや操作者の専門知識が必要ですが、PRTベースのサンプリングはほとんど訓練で済み、臨床現場でも高い再現性と使いやすさで容易に実施できます¹⁴。脂質抽出法に関しては、MTBE/メタノールベースの相分離はクロロホルム毒性を回避しつつ、ほとんどの脂質クラスにおいて従来のフォルチ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトニトリル(ACN)、LC-MSグレード	RCIラボスキャン	LM1005
アクイティUPLC CSH C18カラム	ウォーターズ・コーポレーション	186005297	130Å, 1.7 µm、2.1 mm × 100 mm
アンモニウム・ホルマテ、LC-MSグレード	シグマ・オルドリッチ	55674
オートサンプラーガラスバイアル	ウェル・リッチ・サイエンティフィック	2ML-9-V1002	2mL クリアグラス 12*32mm フラットベース 9-425 ネジねじバイアル(ラベル付き)
青色の9-425 オープントップリブ付きスクリューキャップ;	ウェル・リッチ・サイエンティフィック	9-SP1003	9mm、白PTFE/赤いシリコンSepta 1mm
クロロホルム、HPLCグレード	独山試薬	1271
エッペンドルフ・セーフロックチューブ、1.5 mL	エッペンドルフ	30120086
蟻酸(FA)およびnbsp;LC-MSグレード	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A117-50
ガラスマイクロインサート	ウェル・リッチ・サイエンティフィック	2ML-N2002	250 & マイクロ;Lインサート、クリアガラス、円錐形ベース、ポリスプリング、サイズ:5.8×28.5mm
イソプロパノール、LC-MSグレード	RCIラボスキャン	LM1162
LipidSearchソフトウェア	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	OPTON-30879	バージョン5
メタノール、およびLC-MSグレード	RCIラボスキャン	LM1115
フェノール・レッドスレッド (PRT)	天津景明新技術開発有限公司	20192160086
冷蔵遠心分離機	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	75007200
冷蔵式CentriVap遠心式濃縮器とCentriVap冷蔵トラップ	ラブコンコ	16108335
スクリューキャップマイクロチューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	3488
三ブチルメチルエーテル(MTBE)、HPLCグレード	独山試薬	1070
サーモサイエンティフィック ダイオネックス アルティメイト 3000 HPLC	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	ULTIM3000RSLCNANO
サーモサイエンティエント オービトラップ IQ-X トライブリッドMS	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	FSN05-10001
サーモミキサーC	エッペンドルフ	5382000015
超音波洗浄器	クレスト超音波	P500D-45
ボルテックスミキサー	ベンチマーク	BV1003