ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過処理の生細胞イメージング

サマリー

このプロトコルは、リソソーム膜の完全性と酸性化の変化を検出する蛍光プローブを利用して、ネクロプトーシス中のリソソーム膜透過性をモニタリングするための生細胞イメージング法を説明しています。

要約

制御された壊死の一種である壊死症は、細胞膜の破裂で最高潮に達します。私たちの研究室と他の研究室は、リソソーム膜透過処理 (LMP) が、膜破裂に先立つこのプロセスの初期かつ重要なイベントであることを発見しました。迅速なLMPは、強力なリソソーム酵素、特にプロテアーゼをサイトゾルに放出し、細胞死を積極的に促進します。生細胞イメージングは、ネクロプトーシス中のLMPをリアルタイムで検出するための非常に貴重なツールを提供します。いくつかの蛍光色素は非常に効果的です:(1)pH感受性のLysoTracker色素は、リソソームpHの変化を追跡します。蛍光シグナルの低下は、リソソーム pH 勾配の喪失を示しており、リソソーム機能不全の主な兆候であり、LMP の前駆体または直接的な結果である可能性があります。(2)フルオレセイン標識デキストランビーズは内在化され、リソソームに蓄積します。細胞質ゾルへのそれらの放出は、LMPと貨物の漏れを完全に知らせます。ここでは、ネクロプトーシス誘導後にデキストラン蛍光がサイトゾルに拡散し、リソトラッカー蛍光が徐々に失われることを観察しました。したがって、生細胞イメージング方法により、研究者はリソソーム機能不全のタイミングと程度を正確に追跡できるようになり、ネクロプトーシスのメカニズムのより包括的な理解に貢献し、潜在的な治療介入を明らかにすることができます。

概要

ネクロプトーシスは、多くの炎症性疾患、神経変性疾患、肺疾患、肝臓疾患、および心臓疾患に関与するカスパーゼ非依存性の調節された細胞死の形態です^1,2,3。この経路は、受容体相互作用プロテインキナーゼ1(RIPK1)の活性化で最高潮に達する複雑なカスケード反応によって媒介され、受容体相互作用プロテインキナーゼ3(RIPK3)は、相同型RIP相互作用モチーフ(RHIM)ドメイン^4,5,6を介して相互作用します。次に、RIPK3は、混合系統キナーゼ様タンパク質(MLKL)を動員してネクロソーム^7,8を形成します。RIPK3によるMLKLのリン酸化は、そのオリゴマー化とその後の重合につながります。その後、MLKLポリマーは細胞膜に移動し、最終的に細胞膜の破裂と細胞死を引き起こします9,10,11。しかし、MLKLポリマーが膜コンパートメントに移動し、膜破壊を誘発するメカニズムは完全には理解されていません。

リソソームは、細胞物質の分解とリサイクルを担う細胞小器官です。その内腔には、高分子の消化に関与するプロテアーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、および加水分解酵素があり、それによって細胞の恒常性を維持します^12,13。したがって、リソソームの完全性と適切な機能の維持は、効果的な細胞クリアランス、ストレスへの適応、および細胞全体の生存を確保するために不可欠です14,15,16。最近の研究では、ネクロプトーシスとリソソーム膜透過処理(LMP)との関連が示されています17,18,19。

私たちの最近の観察は、LMPが細胞膜の最終的な破裂に先立って、ネクロプトーシスプロセスの初期かつ重要なイベントであることを示しています¹⁹。具体的には、リソソーム膜上のMLKL重合により、迅速なLMPが誘導され、強力なリソソーム酵素、特にカテプシンBを含むプロテアーゼがサイトゾルに放出されます。これらのプロテアーゼは、重要なタンパク質を切断して細胞死を促進します。重要なことに、CTSB活性を阻害すると、細胞死を強力に防ぐことができます^19,20。このデータは、LMP が壊死性肺壊死経路の重要な調節因子であることを示唆しています。したがって、ネクロプトーシス中のLMPのタイミングをモニタリングすることは、分子メカニズムを理解し、潜在的な治療標的を特定するために不可欠です。

免疫染色、透過型電子顕微鏡(TEM)、またはフローサイトメトリーなどの多くの従来のLMP検出法は、固定サンプルを必要とするか、エンドポイント情報のみを提供するか^{21、22、23、特に}急速な壊死症の進行の文脈において、リソソーム破壊の動的プロセスを捉えることができない。対照的に、生細胞イメージング法では、壊死中のLMPを高解像度でリアルタイムに視覚化できます。このプロトコルでは、2つの相補的なリソソームマーカーを組み合わせ、HT-29細胞にネクロプトーシスを誘導して、リソソーム膜の完全性をリアルタイムで分析しました¹⁹。この技術は、ネクロプトーシスだけでなく、特に疾患またはリソソーム標的治療薬の使用において、リソソームの完全性が損なわれる他の形態の細胞ストレスにおいても、潜在的にLMPを研究するための堅牢で適応性のあるプラットフォームを提供します^24,25,26。

プロトコル

1. 細胞培養 - 0日目

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(P / S)を添加した2 mLのDMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)に5,000個の細胞を無菌ガラス底皿でプレートします。
2. 細胞を37°Cで5%CO₂ とともに一晩インキュベートします。

2. デキストランビーズローディング - 1日目

1. 2.5 mg/mLのストック溶液を20 μLを加えて、10%FBSおよび1%P/Sを添加した新鮮なDMEMでデキストラングリーンビーズを25 μg/mLに希釈します。
2. 古い培地を取り出し、10%FBSおよび1%P/Sを添加した2mLのビーズ含有DMEMと交換します。
3. 細胞を5%CO₂ とともに37°Cで24時間インキュベートし、ビーズのリソソームへの内在化を可能にします。

3. リソトラッカー染色 - 2日目(実験日)

1. 10%FBSおよび1%P/Sを添加した2 mLの新鮮なDMEMに2 μLの1 mMリソトラッカーストック溶液を加え、1 μMの最終濃度を得ることにより、染色培地を調製します。古い培地をこの染色液に交換します。
2. Life Technologies²⁷ の分子プローブからの使用ガイドラインに規定されている推奨インキュベーション時間 (30 分から 2 時間) に従って、37 °C で 5% CO₂ で 2 時間インキュベートします。私たちの実験では、HT-29細胞で2時間インキュベートすると、デキストランビーズとの強い共局在を伴う堅牢な涙点染色が得られ、安定した色素蛍光が示されました。
   注:生細胞イメージングの30分前に共焦点顕微鏡の電源を入れてください。

4. 共焦点顕微鏡のセットアップ

1. 共焦点システムコンポーネントを次の順序でオンにします:PC顕微鏡;スキャナーの電源;レーザー出力;レーザー放出;ライカパワー。
2. 環境制御をオンにします。キューブ - 温度コントローラー。ブリック - CO₂ ガスミキサーコントローラー。CO₂ および O₂ の供給を開きます。
3. ガスパラメータを設定します。
   1. 温度コントローラー(立方体)を37°Cに設定します。
   2. ガスおよび湿度コントローラー(レンガ)を5%CO₂ および95%湿度に設定します。
4. 図1に示すように、イメージングチャンバーを組み立てます。
5. 共焦点対物レンズを設定します。
   1. 63x/1.40 NAの油浸対物レンズを使用してください。
   2. 励起レーザーを488 nm(緑色蛍光色素)と555 nm(赤色蛍光色素)に設定します。
   3. 488 nmレーザーの場合はハイブリッド(HyD)検出器を選択し、555 nmレーザーの場合はPMT検出器を選択します。
      注:蛍光クロストークは、共焦点ソフトウェアで事前定義されたゲートを使用することによって最小限に抑えられ、チャネル間にクロストークがないことを確認しました。

5. 染色後の準備(LysoTrackerインキュベーション後)

1. 2 mLのPBSで細胞を3回注意深く洗浄します。
2. 10%FBSと1%P/Sを添加した2 mLの新鮮なDMEMを加えます。
3. イメージングする前に、対物レンズに浸漬油を1滴塗布してください。
4. 皿を顕微鏡ステージに取り付けます。
5. レーザーの強度と背景を調整します。
   1. レーザー強度を最大 3% まで調整しますが、5% 以下に調整します。
   2. 顕微鏡ソフトウェアで検出器ゲインを調整して、信号を最適化します。
   3. 背景を最小化するには、コントラストバーを調整します。
6. コントロール条件として機能する未処理細胞(T/S/Z添加前)のベースライン画像を取得します。
7. プレートを層流フードに戻し、100 ng/mLのTNF-α(T)、500 nMのSMAC模倣物(S)、および100 μMのZ-VAD-FMK(Z)を含む、10%FBSおよび1%P/Sを添加したDMEM1 mLを加えます。
8. 共焦点顕微鏡でイメージングを続けます。
   注:T/S/Zは、標準プロトコルよりも高い濃度で意図的に添加されました。この選択は、LMPと細胞死を加速し、リアルタイムイメージングで初期イベントをより確実にキャプチャできるようにするために行われました。

6. 画像取得設定

1. 取得ソフトウェアで、パラメータを次のように設定します:モード:xyt;フォーマット:512 x 512;速度:400;ズーム:3;ライン平均:1;ラインの蓄積:3;フレームの蓄積: 1;時間間隔:3分;所要時間:8時間;オートフォーカスを有効にします。
2. [ 開始 ] をクリックして、タイムラプスの取得を開始します。

結果

このプロトコルに記載されている手順により、共焦点顕微鏡を使用して生細胞画像を取得し、LMPをリアルタイムで監視できます。 図1 は、細胞プレーティングから画像取得までの実験プロトコルの概略図を示しています。0日目に、5,000個のHT-29細胞をプレーティングし、37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベートしました。24時間後(1日目)、細胞をフルオレセイン標識デキストランビーズ(25 μg/mL)とともに、同じ条件下でさらに24時間インキュベートした。これらのビーズはエンドサイトーシスとリソソームへの輸送によって内在化され、そこで蓄積して明るい涙点として現れます。2日目(実験日)に、細胞をpH感受性LysoTracker色素(1 μM)で37°Cおよび5%CO₂で2時間処理しました。LysoTrackerは、後期エンドソームやリソソームなどの酸性コンパートメント内に濃縮され、強い蛍光を示します。イメージングの30分前に、プロトコルのステップ4で説明されているように、共焦点顕微鏡システムの電源がオンになり、温度、ガス、湿度コントローラーを含む安定化されました。 図2に示すように、イメージングチャンバーを組み立てました。488 nm (緑) と 555 nm (赤) のレーザーが使用されました。

LysoTrackerでインキュベートした後、細胞をPBSで3回注意深く洗浄し、10%FBSと1%P/Sを添加した2mLの新鮮なDMEMを添加しました。プレートを顕微鏡に移し、63x/1.40 NAの油浸対物レンズに1滴の浸漬油を塗布しました。次に、ステップ5.5で説明したように、レーザー強度とバックグラウンドレベルを調整して、イメージング条件を最適化しました。プロトコルの。私たちの最初の画像では、リソトラッカーとフルオレセイン標識デキストランの安定した涙点の存在が確認され、無傷のリソソームが示されました(図3)。ベースライン画像は T/S/Z の前に取得され、コントロールとして使用されました。車両は適用されませんでした。

初期イメージングおよび顕微鏡設定を確立した後、プレートを層流フードに戻し、100 ng/mL TNF-α(T)、500 nM SMAC模倣物(S)、および100 μM Z-VAD-FMK(Z)を含む10%FBSおよび1%P/Sを添加した1 mLのDMEMを添加しました。イメージングは、プロトコルのステップ6で概説したイメージング取得パラメータを使用して、共焦点顕微鏡で続行されました。 図3、 補足ムービーS1、 および 補足ムービーS2に示すように、T/S/Z処理細胞におけるLysoTracker蛍光の漸進的な低下は、リソソーム変化の初期指標として機能しました。この損失に続いて、リソソームからサイトゾルへのフルオレセイン標識デキストランの流出(点状からびまん性へのシフト)が起こり、LMPを示します。8時間で、ほとんどすべてのリソトラッカーシグナルが消失しましたが、多くの細胞は細胞質ゾルの緑色シグナルを伴う緑色の涙点を保持しており、リソソームのpH勾配の喪失が完全なLMPと貨物の放出に先行することを示唆しています。

図1:実験プロトコルの概略図。(BioRender.com 年に作成)最初に、5,000個の細胞をプレーティングし(0時間)、24時間インキュベートしました。その後、デキストランビーズ(25μg/mL)を添加し、さらに24時間インキュベートした。48時間で、LysoTracker(1μM)を添加し、2時間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し(ステップ1)、続いて10%FBSおよび1%P/Sを添加した2mLの新鮮なDMEMを添加しました(ステップ2)。顕微鏡設定を調整し(ステップ3)、細胞をTNF-α(T)、SMAC模倣物(S)、およびパンカスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMZ(Z)(ステップ4)で処理し、生細胞画像取得(ステップ5)を行いました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:イメージングチャンバーのセットアップの図。 (A)サンプルホルダー、(B)ガスインキュベーションチャンバー、および(C)上蓋。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:T/S/Z処理前後のHT29細胞の代表的な画像。 細胞をリソトラッカーレッドビーズとデキストラングリーンビーズで染色し、TNF-α(T)、SMAC模倣物(S)、およびパンカスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMZ(Z)で処理しました。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足動画S1:デキストラングリーンビーズでインキュベートし、T/S/Zで処理したHT29細胞のタイムラプス。 細胞応答を評価するために、細胞を6時間以上監視しました。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足動画S2:LysoTracker redでインキュベートし、T/S/Zで処理したHT29細胞のタイムラプス。 細胞応答を評価するために、細胞を6時間以上監視しました。 このムービーをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、LysoTrackerとフルオレセイン標識デキストランビーズの両方の組み合わせにより、リソソームのpHと貨物の放出をリアルタイムで同時にモニタリングできることを実証しました。代表的な結果(図3、 補足ムービーS1、 および 補足ムービーS2)は、未処理の細胞が両方のマーカーに対して安定した涙点シグナルを維持することを確認しています。対照的に、T/S/Z 処理は、LMP と一致して、リソトラッカー強度の進行性の低下と、デキストランの涙点からびまん性サイトゾル分布へのシフトを示します。

このプロトコルの重要な最初のステップは、画像取得用のセルを選択することです。以前のデータは、T/S/Z 処理により HT-29 細胞の約 80% が 24 時間以内に死滅し、残りの 20% が¹⁹ 時間生存することを示しています。実験の開始時にはLMPが存在しないため、細胞は最初に形態と、LysoTrackerビーズとデキストランビーズの両方に対する二重陽性シグナルに基づいて選択されます。この方法では、どの特定の細胞がLMPを受けるかを予測することはできませんが、監視対象集団の約60%が8時間のイメージング期間中に最終的にLMPを示すことを一貫して観察しました。もう一つの課題は、シーケンシャルイメージングの固有の性質に起因しています。3分ごとの画像取得中に発生するセルのZ位置のわずかなドリフトにより、実験全体にわたって同じ涙点信号の連続追跡が妨げられます。さらに、細胞は移動し、T / S / Z処理に応答して形態学的変化を起こします²⁸。その結果、イメージング期間を通じて個々のリソソームのダイナミクスを追跡することは不可能です。長期の生細胞イメージングでは、細胞死のメディエーターとしての光毒性の潜在的な寄与が重要な考慮事項です。長時間のセッション中の継続的な興奮は、活性酸素種を生成し、細胞生存率を損なう可能性があり²⁹、真の壊死反応を妨げる可能性があります。この影響を最小限に抑えるために、レーザー出力を低く、露光時間を短くしました。さらに、細胞死プロセスをスピードアップするために、T/S/Zを5倍濃縮して投与しました。ただし、観察されたリソソームの変化に対する光誘発ストレスの寄与を完全に排除することはできません。

この生細胞イメージングプロトコルの重要な利点は、リソソームのpH変化とLMPをリアルタイムでモニタリングし、TEM、フローサイトメトリー、免疫染色などのエンドポイント分析では見逃される動的イベントをキャプチャできることです。TEMは高解像度の構造的洞察を提供しますが、LMPの時間的進行を捉えることはできません。アクリジンオレンジ再配置アッセイ³⁰やガレクチン-パンクタ形成³¹などの代替生細胞法も、リソソームの完全性をモニタリングするための貴重なツールですが、単独で使用する場合はそれぞれ制限があります。アクリジンオレンジアッセイは、酸性細胞小器官から細胞質ゾルへの色素の再分布を報告しており、これはリソソームのpH変化と膜透過処理の両方の影響を受けるため、貨物の放出と直接相関しません。同様に、ガレクチン-涙点形成は、管腔糖鎖のサイトゾルへの曝露を反映し、したがってリソソーム膜の損傷を示します^31,32が、部分透過処理と完全なリソソーム破裂を区別しません。

このプロトコルの中核的な強みは、LysoTracker とデキストラン ビーズを組み合わせることにあり、これによりリソソームの酸性化と貨物の漏れを同時に調査できます。これにより、リソソーム機能と構造的完全性の両方について独自の二重の読み出しが得られます。LysoTracker のフェージングはリソソーム pH の変化の指標として機能しますが、デキストランの放出はリソソーム含有量の物理的漏れを直接報告します。これら2つのマーカーを一緒に使用することで、部分的および完全なLMPの両方の検出を大幅に強化します。したがって、この生細胞イメージング戦略は広く適用できます。研究者は、薬理学的または遺伝的摂動を含むさまざまな実験条件下でのリソソームの完全性を研究するために、他の細胞型やさまざまな蛍光プローブでの使用に適応させることができます。この機能は、ネクロプトーシスのメカニズムの理解を深め、潜在的な治療介入を特定するための鍵となります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HT-29細胞	ATCC	HTB-38	大腸がん細胞
35mmガラス底皿	マテック・コーポレーション	P35G-1.5-14-C-GRD
CO2インキュベーター	PHCBI	MCO-170AICUVL
共焦点顕微鏡	ライカ	SP8WLL
デクトラングリーンビーズ	サーモフィッシャー	D1820	デキストラン、フルオレセイン、10,000MW、アニオン、リシン固定可能
ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム(DMEM)	コーニング	10-013-CV
胎児用牛血清(FBS)	Cytiva	SH30910.03
ライソトラッカー レッド DND-99	インビトロジェン	L7528
油浸式HF	電子顕微鏡科学	16915-01
ペニシリンおよびストレプトマイシン(P/S)	シグマ・オルドリッチ	P4333
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	コーニング	21-040-CV
スマック模倣(S)	BV6、ApexBio、カタログ	B4653	最終濃度、1 mM
ブリック	ライフイメージングサービス	13685	ガスミキサーCO2コントローラー
キューブ	ライフイメージングサービス	CBO2A	温度制御チャンバー顕微鏡
腫瘍壊死因子α(TNF-&α; - T)	ペプロテック	30001A100UG	最終濃度、20 ng/ml
z-VAD-FMK(Z)	ApexBio	A1902年	最終濃度、20 mM