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方法論記事

中脳動脈閉塞と行動抑制を組み合わせたラットにおけるYi-Nao-Jie-Yu処方薬の脳卒中後うつ病への効果

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DOI:

10.3791/69537

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2026年1月9日

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1School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 2Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3Capital Medical University Yanjing College, 4School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 5Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、中脳動脈閉塞(MCAO)と慢性的な軽度ストレス、行動抑制、隔離住宅を組み合わせることで脳卒中後うつ病(PSD)のラットモデルを確立し、行動検査を用いてイーナオジエユー(YNJYP)処方薬の治療効果を評価することを説明しています。

要約

脳卒中後うつ病(PSD)は、脳卒中の一般的で治療可能な合併症であり、うつ症状や身体症状が患者の回復や生活の質を損なう特徴です。本研究は、中脳動脈閉塞(MCAO)と行動抑制および隔離住宅を組み合わせたプロトコルを説明し、ラットのPSDモデルを確立し、Yi-nao-jie-yu処方薬(YNJYP)が成体PSDラットの神経新生に与える治療効果を評価します。モデル確立のために、脳卒中群、PSD、塩酸フルオキセチン群(FXT)、YNJYP群のラットにMCAOが施されました。内頸動脈から中大脳動脈(MCA)へ単繊維縫合を挿入し、2時間の虚血状態にわたり再灌流しました。MCAO後の7日目からは、PSD、FXT、YNJYPグループのラットは1日2時間、カスタムT字型プラットフォームに単独で拘束され、7日間拘束されました。行動評価には、強制泳法(FST、絶望症用)、ショ糖消費試験(SCT、無快感症用)、オープンフィールド試験(OFT、探索行動用)が含まれていました。脳卒中後4週および8週間時点で、PSDラットはFSTでより長く不動時間が見られ、SCTにおけるスクロース選好度が低いことが脳卒中ラットより低かった(P < 0.01)。YNJYPはこれらのうつ様行動を逆転させ(P < 0.01)、FXTと同等の効果を示しました。このプロトコルは、厳密な実験とデータ分析によって支持され、PSDモデルとYNJYPの治療可能性の妥当性を確認しています。

概要

脳卒中後うつ病(PSD)は脳卒中の一般的で治療可能な合併症であり、患者のリハビリテーション過程や生活の質に大きな影響を与えます。PSD患者は身体機能障害だけでなく、気分の低下や興味の喪失などの精神的な障害にも直面します。これにより神経機能の回復が大きく妨げられ、死亡率も増加します。現在、PSDの病因は複雑で、神経生物学的、神経伝達物質の不均衡、炎症反応など複数の側面が関与しています。効果的な介入方法を深く探求する緊急の必要性があります。

この手法の全体的な目的は、中脳動脈閉塞(MCAO)と慢性軽度ストレス(CMS、主に行動抑制)および隔離住宅を組み合わせることで、人間の状態を密接に模倣した信頼性が高く再現可能なラットモデルを確立し、このモデルをイーナオジエユー処方薬(YNJYP)のような治療法の評価に活用することです。この技術開発の理由は、初期の虚血性損傷とその後の慢性心理的ストレス(PSDの発症機序における重要な要素として認識されている)を、単一の標準化されたモデルに統合する必要性にあります。広範なCUMSパラダイムのみに依存する代替方法と比べて、このプロトコルは脳卒中患者がよく経験する動き制限を模擬する特定の行動抑制を用いることで、より焦点を絞り再現可能なアプローチを提供します。3,4,5。

このモデルは、齧歯類におけるPSDの誘導および評価に関する詳細かつ実践的な枠組みを提供し、前臨床研究における標準化の必要性に応えることで、より広範なPSD文献に貢献しています。脳虚血と脳卒中後ストレスの病態生理的複合的影響を研究したり、PSDの新規介入を選別したい研究者は、モデル作成、ストレス適用、行動評価の明確な手順を明確に示しているため、このプロトコルが適切と考えるかもしれません。

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プロトコル

この動物研究プロトコルは北京中医薬大学動物ケア利用委員会によって承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 準備

  1. 体重300〜320gの特異病原体フリー(SPF)オスSprague-Dawley(SD)ラット216匹を入手します。
  2. 実験の1週間前にラットを飼育環境に慣らします。
    1. 居住環境は23±度、3°C、湿度45%±湿度5%、12時間の明暗サイクル(午前8時に照明、午後8時に消灯)に保ちます。
    2. ケージにつき5匹のラットを飼い、無菌の標準的な餌や水を自由に提供できます。
      注意:使用する動物の数を最小限に抑え、穏やかな取り扱いと最適化された手順(例:呼吸抑制を防ぐ調整可能な拘束具)によって苦痛を軽減してください。

2. 中大脳動脈閉塞(MCAO)手術

注:このステップは、Bedersonら6から修正したMCAO/再灌流(MCAO/R)モデルの確立について説明します。

  1. ラットを手術の準備をしろ。
    1. 手術前にラットを一晩(12時間)断食させ(水分制限なし)。
    2. ラットには1%ペントバルビタールナトリウム(50 mg/kg)の腹腔内注射 で 麻酔を行います。
      注:追加の鎮痛剤は投与されず、麻酔剤としてはペントバルビタールナトリウムのみが使用されました。
      注意:ペントバルビタールナトリウムは管理麻酔薬です。取っ端は排気フードに入れ、手袋とゴーグルを着用し、機関の規則に従って施錠されたキャビネットに保管してください。
  2. 手術部位を確保し準備しろ。
    1. 麻酔をかけたラットを仰向けにして手足を矯正します。
    2. 首の毛を剃り、適切な消毒剤(例:エタノール75%)で皮膚を消毒します。
  3. 首の血管を露出させて準備してください。
    1. 首の皮膚に2〜3cmの中央線切開を入れ、皮下腺と筋膜を鈍く剥離します。CCAの枝によって形成される総頸動脈(CCA)、内頸動脈(ICA)、外頸動脈(ECA)を分離します。
    2. CCAを見つけて、その下に2本の縫合糸を予備として置き、1本の心臓端近くを結紮し、CCAの分岐部付近でもう1本と生きた結び目を結びます。
    3. 動脈クランプを使って分岐部近くのCCAの遠位端を閉じます。
    4. ECAを見つけて縫合糸で結紮してください。
  4. 縫合糸を挿入してMCAを閉鎖します。
    1. CCAの近位端の結紮部位と動脈クリップのクランプ部位の間に壁に慎重に切開を開け、その切開部に特殊なネジプラグ(モノフィラメント縫合)を挿入します。
    2. 動脈クリップを開き、フォークからICAにねじプラグを挿入し、わずかな抵抗を感じてから停止します(図1)。
      注意:縫合糸の長さ(18 mm± 2 mm)は、安定したMCA閉塞のために非常に重要です。ラットの体重(300〜320g)に応じて少し調整してください。
  5. 虚血と再灌流を誘発します。
    1. 虚血を2時間維持してください(ストップウォッチで厳密に計測してください)。
    2. 2時間後にMCAの血流を回復するために優しく縫合糸を抜き、余分な縫合糸を切断して動脈クリップを外します。
  6. 手術部位を閉じて回復経過観察。
    1. 切開部を無菌生理食塩水で洗浄し、その後皮下組織と皮膚を縫合します。
    2. ラットを意識を取り戻すまで、25±1°Cに維持する回復ケージに入れます。出血や苦痛を24時間監視してください。
  7. 偽作戦グループを設立しろ。
    1. 手順2.1-2.3と同じ首郭郭清と血管曝露を行います。
    2. 縫合糸をCCAに5mmだけ挿入し、すぐに取り除きます。MCA閉塞なしで切開部を縫合してください。

3. 動物のグループ化

  1. 神経学的スコアリングのために、ラットをランダムに6つのグループ(当初は各グループにn=36個)に分けます。
    1. 脳卒中群:MCAOのみで、行動抑制や薬物治療はなし。
    2. PSDグループ:MCAO + 行動抑制 + 隔離住宅、薬物治療なし。
    3. FXT群:MCAO + 行動抑制 + 隔離住宅 + フルオキセチン塩酸塩ガベージ。
    4. YNJYP群:MCAO + 行動抑制 + 隔離住宅 + Yi-nao-jie-yu 処方(YNJYP)ガヴェッジ。
    5. ブランクグループ:手術は行われていません。
    6. シャム手術群:中脳動脈の閉塞なし。
  2. スコア0または4のラット、または手術後に死亡したラットは除外します。
    1. MCAOから24時間後にLonga7 神経学的スコアリングを行い、適格なラットを選定します。
    2. 5点ロンガスケールを用いましょう:0=赤字なし;1 = 尾で持ち上げられたときの前肢の屈曲;2 = パレティック側に向かって円を描く歩行;3 = パレティック側に向かって落ちること;4 = 意識喪失または歩行不能。

4. フルオキセチン塩酸塩(FXT)およびYNJYPの投与

  1. YNJYPとFXTを準備してください。
    注:YNJYPには6種類の中国薬用成分が含まれています:紫菜(Acanthopanax senticosus roots)30g、玉錦(Curcuma longa rhizomes)10g、五為子(Schisandra chinensis 果実)15g、Zhizi(Gardenia jasminoides 果実)10g、Danshen(サルビア・ミルティオリザ 根)15g、そして川雄(Ligusticum chuanxiong )です根茎)15g(北京中医薬大学第三附属病院薬学部提供)。先行研究8に基づき、胃内投与量は9.92 g/(kg·d)と判明しました。
    1. フルオキセチン塩酸カプセルを蒸留水に溶かし、使用時に0.233 g/Lの濃度を得ます。成虫用量に7倍を基に、ラット用量を2.33 mg/(kg·d)と設定しました。
  2. ガヴェッジ で 薬を投与する。
    1. MCAO後の1日目からガベージを開始し、実験終了まで続け、すべてのグループで朝に一貫して実施されます。
    2. FXT群には2.33 mg/(kg·d)でFXT、YNJYP群には9.92 g/(kg·d)、および脳卒中群およびPSD群には0.9%の生理食塩水(10 mL/kg)を投与します。
      注意:1mLのガベージ針を使用してください。誤嚥を防ぐために、針は胃(気管ではなく)に挿入するようにしてください。

5. 慢性的な軽度ストレス(行動抑制)と隔離住宅の結合

  1. MCAO後の7日目から行動抑制と隔離住宅を始めてください(急性脳卒中期を避けるため)。
  2. カスタムのT字型拘束プラットフォームを準備してください。
    1. プラットフォームは、基座(20 cm × 10 cm × 2.8 cm)と拘束部分(22 cm × 6.6 cm)で構成されています。
    2. 拘束部には、ラットの頭部や四肢を固定するためのスロットと、異なるサイズのラットに合わせるための3本の調整可能なストラップが含まれています(図2、 図3、 図4)。
      注:プラットフォームは陳3 号と天4号から改良されており、脳卒中患者のパレティック姿勢を模した前肢スロットが追加されています。
  3. 毎日の自制を行いましょう。
    1. 概日リズムのバイアスを避けるために、毎日ランダムに2時間のウィンドウ(例:午前9時から11時、午後2時から午後4時)を選びます。
    2. スロットとストラップで各ラットをプラットフォームに固定します。もがくのを防ぐために締め付けを調整し、呼吸抑制はしない。
    3. 7日間連続で2時間連続で抑制を保つこと。
  4. 家鼠が孤立している。
    1. 行動抑制の開始時に、PSD、FXT、YNJYPグループのラットをグループ飼育(ケージ5匹)から単一ケージに移す。
    2. 行動抑制が完了するまで(MCAO後14日目)単独住宅を維持してください。

6. ショ糖消費試験(SCT)

注:MCAO後2週、4週、8週ごとに各グループから6匹ずつランダムに選出します。すべてのラットをSCT、OFT、FST(自由回転)の順に検査してください。

  1. ラットをテストに備えろ。
    1. 断食し、テストの24時間前からラットに水を与えないようにしましょう。
    2. 検査室の温度(23 ± 2 °C)と照明が住宅環境に合っていることを確認してください。
  2. テストを実施してください。
    1. 各ケージに150mLのボトルを2本入れます。1本は水道水、もう1本は1%ショ糖溶液です。
    2. 1時間の自由飲水後、ショ糖溶液と水の摂取量を記録します。
  3. ショ糖の好みを計算してください。
    1. 公式を使いましょう:ショ糖の好み(%) = (消費されたショ糖溶液の体積 ÷ 総消費体積)× 100%。
    2. 飲みながら2本のボトルの位置を入れ替えて、位置バイアスを解消しましょう。

7. オープンフィールドテスト(OFT)

注意:FSTに使われた2週、4週、8週の各グループから同じラットを選びます。テスト前24時間は断食し、ラットの水分を断ち切って生理的条件を一貫させてください。

  1. 野外装置を準備しろ。
    1. 黒い四角い箱を使い、床を25の等しいグリッドに分けてください。
    2. 試験室は静かで薄暗い場所に保ちましょう。
  2. テストを実施してください。
    1. 各ラットを箱の中央のグリッドに置き、5分タイマーをスタートさせます。
    2. 水平活動(新しいグリッドで足の4分の3が交差した格子の回数)と垂直活動(足の4分の2が床から離れている後ろの動き)を手持ちのカウンターで手動で観察して記録します。
    3. 中央グリッドで過ごした時間とグルーミングの頻度を記録し(追加の行動分析のために任意)。

8. 強制泳ぎテスト(FST)

注意:FSTに使われた2週、4週、8週の各グループから同じラットを選びます。テスト前24時間は断食し、ラットの水分を断ち切って生理的条件を一貫させてください。

  1. 試験装置を準備しろ。
    1. ガラスの円筒に適量の水を入れ、水位が高くしてネズミが足で底に触れて自分を支えられないようにします。
    2. 水温を25±1°Cに調整してください。
  2. テストを実施してください。
    1. ラットをそれぞれシリンダーに入れて5分間泳がせます。
    2. 5分間の総動けなさを記録してください。
    3. 「動かされない」とは、受動的な浮遊(鼻を水面上に保つための最小限の動き)、「活動」とは手足をパドルで叩くことや壁を引っ掻くことを指します。
  3. 検査後にラットのケアをしてください。
    1. 5分後にネズミをシリンダーから取り出し、タオルで乾かし、低体温症を防ぐために加熱ランプ(30±2°C)で30分間置いてください(図5)。

9. 統計分析

  1. 平均±標準偏差(平均±標準偏差)でデータを整理します。
  2. SPSSバージョン20.0ソフトウェアを使ってデータを分析してください。
  3. パラメトリック検定を行う前に、データの正規性(シャピロ・ウィルク検定を用いて)および分散の均一性(レヴェーン検定を用いる)を検証します。各グループのデータは正規分布に従い、分散の均質性を満たします。
    1. グループ間の標本平均を比較するには、一方向分散分析(一方向ANOVA)を用い、最小有意差(LSD)検定および学生-ニューマン-キュールズ検定(SNK)を組み合わせて行います。分散が不等な場合はウェルチ検定を用いましょう。
  4. 統計的有意をp < 0.05に設定します。

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結果

本研究では関連検出のために合計5つの実験群が設置されました。各グループの行動データを統計的に分析した結果、実験4週目に、PSD群ラットのFSTにおける不動時間が脳卒中群ラットと比べて有意に長くなり、両群間の差は統計的に有意(P < 0.01)であったことが判明しました。同時に、SCTにおけるPSD群ラットのショ糖嗜好は脳卒中群ラットよりも有意に低く、実験の4週目および8週目における両グループ間の違いは統計的に有意でした(P < 0.01)。これらの行動指標の変化に基づき、本研究におけるPSDラットのモデリングは成功したと判断できます(特定のデータ解析は 図6に示されています)。

PSDラットに対するYNJYP介入の結果、この化合物がラットのうつ様行動に有意な改善効果を示しました。具体的には、YNJYPは実験の4週目および8週目におけるPSDラットのFSTでの不動時間を短縮でき、統計的検証の結果、介入されたラットと介入なしのPSDラットの差は統計的に有意であ...

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ディスカッション

ラット脳虚血モデルの構築過程では、結紮法、開頭切開法、窒息法、ワイヤー閉塞法など、さまざまなモデリング手法があります。結紮、開頭切開、窒息の3つのモデリング法と比較して、ワイヤー閉塞法は顕著かつ独自の利点を示します。これらの利点は主に、低侵襲的な操作性、時間・空間制御の精度、そしてモデル1,2,3の信頼性という三つの重要な側面にあります。

まず、手術の侵襲的な性質の観点から、縫合法は他の方法と大きく異なります。縫合法を用いてラットの脳虚血モデルを確立する場合、ラットに対して開頭切開や広範な血管解離・結紮手術は必要ありません。具体的な手術方法は、ラットの首に小さな切開を入れ、頸動脈系を通して縫合糸を挿入して標的血管の閉塞を実現することです。この手術法は、手術自体がラットに与える身体的外傷を大幅に減らし、術後感染のリスクも大幅に減らし...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

蘇元凱と孫永浩が原稿を執筆し、結果の解釈や討論部分も含めて担当しました。輝陵田は実験を行い、データを分析しました。寧定と新王が原稿を審査した。楊子彤と趙景耀はデータ検索に貢献しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
成虫のオス・スプラグ・ドーリーネズミバイタルリバー実験動物技術、北京、中国いいえ。SCXK2012-0001300–320 g
フルオキセチン塩酸カプセルパテオン・フランス、江蘇省、中国0943A
YNJYPの顆粒北京中医薬大学第三附属病院薬学科自家製
オープンフィールドテスト用のオープンボックス自家製 -
ナトリウムペントフェノバルビタールシグマ・コーポレーション・オブ・アメリカP3761-5
閉塞糸北京沙東バイオテクノロジー有限公司2838-A4
強制泳ぎ実験用の水タンク自家製 -

参考文献

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