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研究記事

マウスにおけるシクロホスファミド誘発骨髄抑制の緩和における建皮聖雪煎じのメカニズム

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DOI:

10.3791/69542

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2026年1月2日

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、建皮聖雪煎じが統合的なネットワーク薬理学と動物実験のアプローチを通じてシクロホスファミド誘発性骨髄抑制をどのように緩和するかを体系的に明らかにし、その多標的メカニズムと補助療法としての潜在力を明らかにしています。

要約

本論文は、建皮聖雪煎じ(JPSXD)が化学療法による骨髄抑制をどのように緩和するかを、ネットワーク薬理学および動物実験を通じて調査することを目的としています。そのために、主要な成分と標的を解析し、タンパク質間相互作用ネットワーク(PPI)およびハーブ成分標的ネットワークを構築しました。Gene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)による主要な経路が特定されました。60匹のC57/BL6マウスを対象に、シクロホスファミド(CTX)誘導の骨髄抑制モデルが確立されました。JPSXDは異なる用量で7日間投与されました。末梢血球計数、サイトカイン(血栓形成素[TPO]、エリスロポイエチン[EPO]、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子[GM-CSF])、胸腺指数、骨髄形態、CD34+細胞、AKT1、JAK2、EGFR発現を評価しました。ネットワーク解析により172種類の化合物と454の標的が特定され、PI3K-AktおよびJAK-STAT経路が強調されました。 in vivoではCTXが白血球およびシグナル伝達タンパク質のレベルを低下させ、JPSXDはカウントを回復し、AKT1、JAK2、EGFRをアップレギュレーションし、胸腺指数(p < 0.05)を改善しました。中用量および高用量のJPSXDはTPO、EPO、GM-CSF、CD34+ 細胞を増加させ、骨髄構造を改善し、高用量が最も強い効果を示しました。結論として、JPSXDは多標的・多経路の調節を通じて骨髄抑制を緩和し、化学療法誘発性白血球減少症の補助療法としての可能性を支持しています。

概要

化学療法は、主にがん細胞の増殖と生存を抑制し、患者の生存を延ばすことで、さまざまな悪性腫瘍治療の基盤となっています。しかし、正常組織を標的とする選択性が低いため、化学療法薬は健康な細胞や組織に深刻な損傷を与え、さまざまな副作用を引き起こすことが多い3.化学療法の最も一般的かつ深刻な副作用の一つは骨髄抑制であり、白血球(WBC)、赤血球(RBC)、血小板(PLT)などの血球の産生が減少するのが特徴です2,4。骨髄抑制は免疫防御系を著しく損ない、感染症、出血、貧血、その他の合併症のリスクを高めます。また、患者の生活の質を著しく低下させ、場合によっては生命に関わることもあります。したがって、化学療法による骨髄抑制の緩和と予防は、患者の化学療法耐性と総合生存率の向上に不可欠です。

現在の骨髄抑制の臨床治療は主に造血因子(顆粒球コロニー刺激因子[G-CSF])、エリスロポイエチン[EPO])および輸血療法を用いています6,7。しかし、これらのアプローチは高コスト、潜在的な副作用、効果の限定を伴うことが多いです。その結果、骨髄抑制の予防と緩和のためのより安全で効果的な方法の探求が主要な研究課題となっています。近年、伝統中国医学(TCM)はがん治療や化学療法による副作用の管理において大きな注目を集めています8,9。多くの中医製剤には、昇雪宝煎じ10、帝皇聖白錠11、銀セン酸12など、補強や免疫調節効果があると考えられており、正常な細胞を保護し毒性の副作用を軽減するだけでなく、抗腫瘍効果も高めています。

煉皮聖雪煎(JPSXD)は、補気養血の治療原理を体現する古典的な中医の方です。この方は思君子煎湯と二知節を組み合わせた高度な改良版であり、複数の薬草の相乗効果を統合して気と血の不足に対処している。この処方は、高麗人参(Ren Shen)、黄芪(黄気)、エピミウム(陰陽火)、白朱(atractylodes)、ヤム(Shan Yao)、サルビア(Dan Shen)、調理地黄(Shu Di Huang)、ドダーシード(Tu Si Zi)、ウルフベリー(Gou Qi Zi)、リグストラム(Nv Zhen Zi)、当帰(Dang Gui)、揚げ大麦(Chao Mai Ya)、揚げ鶏砂肝(Chao Ji Nei Jin)で構成されています。 乾燥みかんの皮(チェンピ)、コイアの種(イー・イーレン)、その他いくつかのハーブ。各ハーブは処方の中で特定の役割を果たし、中医学の主権者、大臣、補助者、導きのハーブの原則に従い、バランスの取れた的確な治療効果を保証します。

四君子煎じは、中医の基礎となる処方であり、気を補強し脾を強化する力で知られています。疲労、食欲不振、免疫力低下など、気や血欠に関連する状態の治療に広く用いられています。現代の薬理学的研究により、思俊子煮込みは免疫機能を高め、造血を促進し、体の自己修復能力を向上させることが示されています15,16。この基盤の上に、JPSXDは血液栄養の効果をさらに高め、より複雑な欠乏症に対応するために追加のハーブを取り入れています。例えば、加工された地黄とアンジェリカは主要な血液栄養のハーブであり、黄耆や高麗人参は相乗効果で気を高め、全体的な活力を高める18。

最近の研究では、JPSXDの抗腫瘍効果の可能性が強調されており、その多成分・多標的アプローチが腫瘍の成長を抑制し、従来のがん治療の有効性を高める可能性が示唆されています(19,20)。この処方は免疫反応を調節し、造血機能を改善する能力があり、化学療法や放射線治療を受ける患者を支援する際に特に価値があります。これらの患者は治療の副作用として気や血液の欠乏を経験しやすいです。さらに、サルビアやエピメディアなどのハーブの加入は微循環を改善し細胞修復機構を強化することが示されており、このフォーミュラの全体的な治療効果に寄与しています22。

現代の薬理学的研究により、JPSXDに含まれる各ハーブは造血機能、抗骨髄抑制、免疫調節、抗酸化に関連する薬理学的活性、さらに微小循環の改善を有していることが示されており、化学療法による骨髄抑制の緩和におけるJPSXDの利用を間接的に支持しています。 表 1は各ハーブの主な薬理学的効果と関連する参考文献をまとめており、造血、抗骨髄抑制活性、免疫調節、抗酸化または微量循環促進特性の調査に焦点を当てています。JPSXDの成分の複雑な相乗効果は、ハーブ間の協力的相互作用と拮抗的相互作用の両方を含み、複数の経路を標的にしてホリスティックな治療効果を目指します。例えば、人参と黄耆が協力して気を補強するのに対し、サルビアと準備された地黄は協力して血液を養い血行を促進します。同時に、乾燥みかんの皮や揚げ大麦などのハーブは消化を調整し、停滞を防ぐため、このフォーミュラのトニング効果が体に効果的に吸収・利用されるようにします。この多面的なアプローチは、症状に対処しながら根本原因を治療する中医学の哲学と一致しています。

結論として、JPSXDは気と血液解毒の原理を体現した、バランスの取れた科学的裏付けのある中医処方です。免疫力の向上、造血促進、抗腫瘍治療の支援などに応用できる可能性が高く、伝統的医療と現代の医療の両方において価値ある追加要素となっています。しかしながら、JPSXDが化学療法による骨髄抑制を緩和する効果を直接評価する高品質な臨床的証拠は依然として不足しています。その基礎となるメカニズムを解明し、臨床応用戦略を最適化するためにさらなる研究が必要です。したがって、本研究は前臨床的メカニズムの観点からJPSXDの潜在的な治療効果の概念実証を提供することを目的としています。

ネットワーク薬理学は、その体系的かつ統合的な性質により、中国医学の有効成分を特定し、その作用機序を解明するために広く用いられています24,25。本研究では、ネットワーク薬理学を用いて、骨髄抑制の文脈でJPSXDが影響する潜在的なシグナル伝達経路と主要標的を解析しました。さらに、関連する指標を評価し、JPSXDが骨髄抑制に与える影響を評価するために、シクロホスファミド(CTX)誘導の骨髄抑制マウスモデルが確立されました。ネットワーク薬理学を通じて特定された主要標的および経路の予備検証も実施されました。これは、ネットワーク薬理学と動物実験を体系的に統合し、JPSXDがPI3K-AKT経路などのシグナル伝達経路の多標的調節を通じて化学療法誘発性骨髄抑制を緩和する分子メカニズムを解明した初めての研究であり、この化合物式の造血保護効果のメカニズムのギャップを埋めています。

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プロトコル

すべての動物実験は、実験動物管理規則および湖南がん病院実験動物センターの倫理ガイドラインに厳格に従って実施されました。この研究プロトコルは湖南がん病院動物倫理委員会(承認番号:KNZY-202416)によって承認されました。研究を通じて、研究者たちは使用される動物の数を最小限に抑え、その苦痛を軽減するためにあらゆる努力をしました。

動物の調理
湖南省スラック景大実験動物有限公司(ライセンス番号:SCXK [Hu] 2021-0002)から合計60匹の10週齢オスのC57/BL6マウスが入手されました。すべてのマウスは湖南がん病院の実験動物センターに収容され、温度23 ± 2°C、湿度50%±10%、12時間の明暗サイクル(8:30-20:30)で収容されました。ネズミは 自由 に食べ物や水を得られました。実験前は、3日間にわたり毎日5分間の扱いで環境に慣れさせていました。順応後、60匹すべてのマウスは体重順に層分けされ、コンピュータ生成の乱数表を用いて6グループ(n=10)にランダムに割り当てられました。グループは、ブランク対照、モデル、生理食塩水(NS)対照群、高用量JPSXD(40 mg/kg)、中用量JPSXD(30 mg/kg)、低用量JPSXD(20 mg/kg)で構成されていました。ランダム化の結果、グループ間で平均体重の有意な差は認められませんでした(p > 0.05)。ランダム化配列は、バイアスを最小限に抑えるために、後の実験手順に関与しない研究者によって生成・実行されました。

材料の準備
安全性と廃棄物処理:本研究では、非常に毒性の高い化学療法薬であるCTXが使用されました。すべての手順は、有害化学物質の安全管理規則およびバイオセーフティレベル2の検査室基準に厳密に従って実施されました。具体的な予防措置として、全職員が使い捨ての防護服、ニトリル手袋、N95防臭マスク、防護ゴーグルを着用することが含まれていました。CTXの準備と投与はクラスIIのバイオセーフティキャビネット内で行われました。CTX注入溶液の調製は、エアロゾルの発生を防ぐために専用の機器を用いてフルームフード内で行われました。鋭利器やCTXに汚染された注射器や手袋などは、刺し穴に強い鋭利器容器に捨てられました。その他の汚染物質(例:寝具、動物組織)は、10%次亜塩素酸ナトリウムに24時間浸けて不活化され、その後認定医療廃棄物処理業者によって焼却されました。CTXの流出が発生した場合、その部分は直ちに吸収性の綿で覆われ、1%チオ硫酸ナトリウム溶液で中和されました。この出来事は安全監督者に報告されました。

薬剤および試薬:CTX注射はドイツのBaxter Oncology GmbHから入手(バッチ番号:HJ20160467)。JPSXDは湖南がん病院の中医科によって作成されました。この薬草は、パナックス・ジンセン、アストラガルス・メンブラナセウス、エピミウム・ブレヴィコルヌム、アトラクティロデス・マクロセファラ、ディオスコレア・オポシタ、サルビア・ミルティオリザ、レフマニア・グルティノサ、キュスクタ・チネンシス、リシウム・バルバルム、リグストラム・ルシダム、アンジェリカ・シネンシス、フライドモルト、鶏砂肝の裏地、乾燥みかんの皮、コワシッドで構成されており、古典的な適合度の比率に従って組み合わせました。.煮込み液は最終濃度3kg/L(すなわち3 g/mL)まで濃縮されました。ガベージ前には、各用量群に必要な濃度を得るためにNSで濃縮液を希釈しました:高用量群は4 mg/mL(40 mg/kg)、中用量群は3 mg/mL(30 mg/kg)、低用量群は2 mg/mL(20 mg/kg)26。ガベージ体積は体重10gあたり0.1 mLと計算され、最終投与量はマウスあたり0.2〜0.25 mL(体重範囲20〜25 gに基づく)となりました27。

ELISAキット:マウスのグラヌロサイト-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、EPO、および血栓生成素(TPO)用の市販ELISAキットが使用されました。検査前に血清サンプルをPBSバッファー(pH 7.4)で1:5希釈しました。標準は1井戸あたり100μLで再構成されました。

二次抗体:HRP結合ヤギ抗ウサギ用IgGをTBSTバッファー(5%無脂肪ミルク、0.05%Tween-20を含む)で1:5000(最終濃度:0.04 μg/mL)希釈しました。溶液は新たに調製され、室温で1時間培養されました。

ウェスタンブロットの一次抗体は、GAPDH(ウサギ多クローナル)、AKT(ウサギ多クローナル)、JAK2(ウサギモノクローナル)、EGFR(マウスモノクローナル)を用いました。すべての抗体は5%BSAを含むTBSTバッファーで希釈されました:GAPDH(1:1000)、AKT(1:1000)、JAK2(1:800)、およびEGFR(1:800)。培養容量は膜あたり100μLでした。

組織固定液:PFA粉末をPBS(pH7.4)に溶かして4%パラホルムアルデヒド溶液を製製しました。ティッシュは24時間固定されていました。

ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色溶液:ヘマトキシリン溶液(0.1%ハリスヘマトキシリン)およびエオシンY溶液(0.5%)が標準病理プロトコルに従って調製されました。染色時間はヘマトキシリンが5分、エオシンが3分でした。

免疫蛍光遮断バッファー:ブロッキングにはヤギ血清10%とBSA1%を含むPBSバッファーを使用し、30分間の培養期間を経ました。

免疫蛍光用抗体希釈バッファー:免疫蛍光用一次抗体(CD34+、TPO、EPO、GM-CSF)を、製造元の推奨希釈比(1:200)に従い、1% BSAを含むPBSバッファーで希釈し、最終濃度2.5 μg/mLを得ました。培養容積は1組織切片あたり50μLでした。

動物モデルの誘導
60匹のマウスを6つのグループ(n=10組)にランダムに分けました:ブランクコントロール、モデル、高用量、中用量、低用量、そしてNS対照群です。白対照群を除くすべてのマウスに、骨髄抑制モデルを構築するためにCTX(20 mg/kg)を1日1回、連続して腹腔内注射を受けました。すべてのモデルマウスは、最終注射後24時間で白血球<1.8×109/L、PLT<85 × 10⁹/L、骨髄核細胞の減少>55%を示しました。このプロトコルは確立されたCTX誘導骨髄抑制モデルと一致しています29,30。注射後、マウスは活動量、被毛の見た目、体重の変化など、一般的な状態を毎日モニタリングしました。モデリング開始から実験終了まで、電子天秤を使って毎日同じ時間に体重を記録していました。体重変化率は、(最終体重/初期体重)×100%と計算され、JPSXDの一般的な生理的状態と潜在的な保護効果を評価するために行われました。注射後、マウスは個別に換気されたケージ(IVC)に収容され、それぞれCTX汚染者と明確にラベル付けされました。寝具は2日ごとに交換され、使用済みの寝具はすべて上記の有害廃棄物対策プロトコルに従って処分されました。

胃内投与
高用量、中用量、低用量のマウスは、それぞれ40 mg/kg、30 mg/kg、20 mg/kgの用量でガベージ(漏食)でJPSXDを受け取りました。生理食塩水対照群には同量のNSが投与されました。ガベージ溶液はそれぞれ4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mLの濃度で調製され、体重10 gあたり0.1 mLの容積で投与されました。すべてのマウスは7日間連続で1日2回ガゲージングされました。生理食塩水対照群には、マウス1匹あたり0.2〜0.25mLのNSが投与されました。ブランク群とモデル群には処理が行われませんでした。嘔吐中に咳や苦しみがなかったことは、正しい投与方法を示しました。

血液採取と血清調製
CTX注射後3日目 に、尾部静脈から0.2mLの血液を採取し、完全自動血液分析装置を用いて末梢血球数を測定してモデル確立の成功を評価しました。JPSXDの最終ガバジから24時間後、ランダムに選ばれたマウス(グループあたりn=10)の眼窩洞から血液を採取しました。血液の一部は完全な血球計数分析に使用され、残りは血清調製のために処理されました。サンプルは3,000 x g で4°Cで15分間遠心分離されました。 上澄んだ淡黄色の上層(透明で淡黄色)は血清として採取され、-80°Cで保存され、その後のELISA検査および肝腎機能検査に備えました。血清層は血球層から明確に分離されており、溶血や濁度の兆候はありませんでした。測定された血液学的パラメータには、WBC、RBC、PLT、ヘモグロビン(Hb)レベルが含まれていました。

肝臓および腎機能評価
完全自動化生化学分析装置を用いて血清肝機能マーカーであるアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)および腎機能マーカーである血尿素窒素(BUN)、クレアチニン(Cre)を測定しました。すべての手順は機器の標準動作プロトコルに従って行われました。具体的には、100μLの血清を対応するアッセイキット(ALT、AST、BUN、CRE)と混合し、37°Cで5分間培養しました。吸収は340nmで測定されました。各サンプルは重複して検査され、平均値を分析に用いました。

オルガン指数の計算
JPSXDの最終ガベージ投与から24時間後、マウスは徐進式二酸化炭素(CO2)吸入(流量:20%チャンバー容積/分)で安楽死させ、その後副次的な方法で子宮頸部脱臼を施しました。安楽死直後、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺は腹側中央切開から無菌的に採取されました。臓器は周囲の結合組織や脂肪から優しく剥離され、氷のように冷たい生理食塩水(NS)で洗浄されて残留血液を除去しました。臓器は標準圧力(3回の優しく押さえる)であらかじめ計量された濾紙で吸い取り、室温(22 ± 1°C)で校正済み電子天秤(精度:±0.1 mg)で即座に計量されました。

すべての処置は、自己溶解を最小限に抑えるため、事前に冷却されたステンレス製トレイ上で行われました。臓器指数は、JPSXDが主要臓器に与える影響を評価するために、臓器重量(mg)を体重(g)で割って算出しました。各組織の一部はウェスタンブロット解析用に予約され、残りのサンプルは4%PFAに固定されて後続の組織学的評価が行われました。

エリサ
TPO、EPO、GM-CSFの血清濃度は、製造元の指示に従ってELISAキットを用いて測定されました。サンプル洗浄や試薬再構成を含むすべての遠心分離工程は、室温1,000 x g の5分間実施されました。洗浄工程はPBSTバッファー(PBS含有0.05%トゥイーン-20)を用いて行われ、1ウェルあたり300μLの洗浄液を加えて3回繰り返しました。洗浄後、井戸の底に残留液体は一切残りませんでした。色の発達の後、明確な青色の沈殿が見られました。反応終了後、マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸収を測定しました。

H&E染色
安楽死後、胸腺と大腿骨を摘出しました。胸腺は重さを量って胸腺指数(胸の重量[mg]/体重[g])を計算しました。計量後、胸腺の一部はウェスタンブロット解析に使用され、残りは大腿骨とともに4%のPFAで固定されました。大腿骨サンプルは段階的にエタノール脱水(70%、80%、95%、100%、それぞれ1時間)を受けました。適切な脱水は、柔らかく変形のない均一な白色の外観で示されました。石蘭油埋め込み組織ブロックは、高精度タングステンカーバイドブレード(タイプH31)を装着した回転式マイクロトームを用いて厚さ4μmで切片されました。切断は0.5%ゼラチン溶液を含む40°Cの水浴に浮かせてしわを除去し、顕微鏡スライドに装着しました。すべての切片は形態が整っており、滑らかな縁を持ち、光学顕微鏡下でも均一な半透明性を示し、最適な切片品質を確認しました。H&E染色が行われ、その後水性マウンティングメディウム28で取り付けられました。染色後、核は青色に、細胞質はピンク色に見え、逆立顕微鏡による顕微鏡観察では細胞構造が明確に見えました。組織形態学的解析はソフトウェアを用いて実施されました。H&E染色された各断面に対して、200倍倍率で3つのランダムフィールドが選ばれました。ソフトウェアは、関心領域を手動で区切った後、単位面積あたりの核化細胞数を自動的に定量化し、結果は平均±標準偏差(x̄ ± s)で表現されました。

ウェスタン・ブロット
胸腺組織(50 ± 2 mg/サンプル)は、100 mg 組織/1 mLバッファーの正確な比率で氷冷RIPAバッファーで均質化され、モーター式ペレットペストルホモジナイザーにRNaseフリーペストルを装着しました。氷上で15回のパルス(1秒パルス/2秒の停止)で均質化を行い、その後30分間氷上で孵化し、10分ごとに渦を巻きました。ホモジネートは12,000 x g で4°Cで20分間遠心分離し、得られた上澄液をタンパク質定量のために採取しました。上清液は透明で、沈殿物や脂質層がなかった。タンパク質濃度はBCAタンパク質アッセイキットを用いて測定し、標準的な曲線範囲は0〜2000 μg/mLでした。ウエスタンブロットは胸腺組織におけるAKT1、JAK2、EGFRの発現レベルを評価するために行われ、GAPDHを内部対照として用いました。電気泳動および膜移動後、タンパク質マーカー(10-200 kDa)は明確なバンドを示し、ターゲットバンドは期待される分子量(AKT1: 60 kDa、JAK2: 130 kDa、EGFR: 170 kDa、GAPDH: 37 kDa)と一致しました。

ウェスタンブロットバンドのデンシトメトリック解析はソフトウェアを用いて実施されました。分析前に、帯を目視で検査し、にじみや拡散がないか確認しました。解析手順には、画像インポート後にターゲットバンド領域を手動で選択し、ソフトウェアによる自動エッジ検出、その後バンドに隣接する領域を用いて局所的な背景差し引きでグレー値を補正する手順が含まれていました。次に、ターゲットタンパク質と内部対照群のグレーバリュー比を計算し、相対定量化を行いました。使用された正規化の公式は以下の通りです:

ターゲットタンパク質の相対発現 = (ターゲットバンドのグレー値−局所背景) / (内部制御のグレー値−局所背景)

免疫組織化学
大腿動脈切片に対して免疫組織化学染色が行われました。スライスは0.1%のトリトンX-100で10分間透過し、その後30分間ブロッキングしました。一次抗体は4°Cで一晩インキュベートされ、二次抗体は室温で1時間インキュベートされました。染色後、光学顕微鏡下で低背景で非特異的な染色がない明確な陽性信号が観察されました。スライドはDAPIを含むアンチフェード媒体で装着され、核は青く染色されました。次にCD34+、TPO、EPO、GM-CSFの発現を評価しました。免疫組織化学画像はデジタル病理ソフトウェア(バージョン2.1.0)を用いて解析されました。分析前に、画像が過剰露光や信号劣化がないことが確認されました。分析手順32には以下が含まれていました:

モデル選択:事前学習済みの骨髄断片モデル(U-Netベース)を用いて組織領域33を自動的に特定しました。
しきい値設定:陰性対照群に基づいて陽性信号の閾値を定義しました。染色強度が背景平均を3標準偏差上回る領域は陽性と分類されました。
ROI定義:ソフトウェアは各フィールドを500 μm×500 μmグリッド領域に自動的に分割し、単位面積あたりの正セル数(正セル数/フィールド面積)を計算しました。
データエクスポート:細胞密度が正の統計的報告を自動的に生成しました。

統計解析
統計解析はSPSSソフトウェア(バージョン22.0)を用いて実施されました。データはx̄ ± sで表されました。グループ間比較前には、正常性はシャピロ・ウィルク検定で評価され、分散の均質性はレヴェーン検定で評価されました。正規分布(p > 0.05)と分散均質性(p > 0.05)の両方が確認された場合、一方向ANOVAを用いてグループ比較を行いました。事後多重比較は最小有意差(LSD)法を用いて実施されました。タイプI誤差の制御のために、すべての事後P値はボンフェローニ補正を用いて調整され、調整p <0.05は統計的に有意とみなされました。

データが正規性または分散均質性の仮定(どちらの検定でもp ≤0.05)を満たしなかった場合、Kruskal–Wallis検定を適用し、その後にBonferroni補正を用いた事後解析のためのDunn検定が適用されました。すべての統計グラフと可視化はGraphPad Prism(バージョン9.0)を用いて生成されました。有意水準はα = 0.05に設定されました。報告されたすべてのp値は調整済みの値です。外れ値はグラブス検定(α = 0.05)を用いて特定され、実験誤差が明確に起因する場合のみ除外されました。残りのすべてのデータは最終解析に含まれました。結果はx̄ s± sとして示されます。

ネットワーク薬理学の手法論
本研究では、JPSXDが化学療法による骨髄抑制を緩和する可能性のあるメカニズムを探るためにネットワーク薬理学的アプローチを用いています。まず、JPSXDの化学成分および対応する標的を中国医学システム薬理学データベース・分析プラットフォーム(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)から取得しました。スクリーニング基準は以下の通りに設定されました:経口バイオアラビリティ(OB)≥30%および薬物類似性(DL)≥0.18。TCMSPデータベースに含まれていない化合物については、SwissTargetPredictionプラットフォーム(https://www.swisstargetprediction.ch/)を用いてターゲット予測が行われました。

選定された化合物がJPSXDの主要なバイオアクティブ成分をカバーしていることを確実にするため、中華人民共和国薬典34を参照しました。具体的には、各ハーブの同定および分析セクションをレビューすることで、ジンセノシド、アストラガロシドIV、イカリイン、サルビアノル酸などのマーカー化合物を特定しました。これらの化合物は一般的に品質管理マーカー35として用いられ、明確な化学構造と定量的要件を持っています。正確性のため、我々は薬局書の一般通知および付録を照合し、命名規則や分析方法(例:高性能液体クロマトグラフィー、HPLC)を確認しました。分析により、スクリーニング基準(OB≥30%、DL≥0.18)が、ジンセノサイドのRg1およびRb1(パナックス高麗人参由来)、アストラガロサイドIV(黄耆膜由来)、イカリイン(エピミウム・ブレヴィコルヌム由来)などの主要な薬理成分を含む主要な薬理成分を含む化学式36のコア化合物を効果的に捉えていることが確認され、選定された化合物は代表的であり、JPSXDの気と血液の強化に関与する主要な有効成分を含んでいることを示しています効果。

その後、骨髄抑制に関連する遺伝子標的をGeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)から取得し、結果をスプレッドシートにダウンロードしました。関連スコア≥44の遺伝子を選定し、さらなる解析を行いました。薬物標的と疾患関連遺伝子の交差部分はベン図を用いて可視化され、重なり合う遺伝子はSTRINGデータベースにインポートされました(https://string-db.org/)。生物は人間に設定され、相互作用源は実験とデータベースに限定され、最低必要な相互作用スコアは0.7>。その結果得られたタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークはトポロジカル特性を解析し、コアターゲットを特定し、Cytoscape 3.10.2を用いて可視化しました。

特定されたコアターゲットに基づき、DAVIDデータベース(https://david.ncifcrf.gov/)を用いてGene Ontology(GO)および京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮解析が実施されました。パラメータは以下の通りに設定されました:カウント≥5、EASEスコア≥0.05、 p値<0.01。リッチ結果はMicrobios Letterプラットフォーム(http://www.bioinfo-cloud.org/)を通じて可視化されました。経路解析により主要なシグナル伝達経路と調節マーカーがさらに明らかにされ、JPSXDが化学療法による骨髄抑制を緩和する可能性のあるメカニズムが明らかになりました。

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結果

ネットワーク薬理学解析
有効化合物および標的の同定
まず、JPSXDの各ハーブの主要マーカー化合物を特定し、包括的な選択を確実にしました。具体的には、関連するハーブ(例:パナックス・ヒンセン、アストラガルス・メンブラナセウス、アンジェリカ・シネンシス)の薬局記載を参照し、処方内の15種類のハーブ成分すべての公式マーカー構成要素のリストを作成しました。これには、ヒンセノサイドのRg1、Re、Rb1(パナックス高麗人参由来)、アストラガロサイドIV(アストラガルス由来);イカリン(エピメディアより);サルビアノル酸B(サルビア・ミルティオルリザ由来);カタルポール(レフマニア・グルティノサ由来);リグスティリド(Angelica sinensis由来);アトラクチルレノリド(Atractylodes macrocephala

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ディスカッション

がんの発生率が世界的に増加する中、医療界は二重の課題に直面しています。がんそのものの治療だけでなく、特に骨髄抑制が一般的で重篤な副作用であるという二重の課題です。本研究は、ネットワーク薬理学と動物実験を組み合わせて、マウスにおけるCTX誘発性骨髄抑制の緩和におけるJPSXDの役割と潜在的なメカニズムを体系的に調査しました。結果は、JPSXDが多標的・多経路の調節機構を通じて骨髄抑制の症状を改善する可能性を示唆し、TCMが複数の成分と標的を活用する独自の利点を強調しています。

ネットワーク薬理学解析では、JPSXDに含まれるカエンフェロール、ゴミシンB、リコアグロカルピン、リコアグロイソフラボンなどの主要化合物が特定されました。これらの化合物は過去の研究で抗炎症作用、抗酸化作用、造血効果など多様な薬理活性を示しており<...

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開示事項

著者たちは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は、湖南省伝統中医学管理局が資金提供する「統合西洋伝統中国医学フォーカス-DCAモード介入による高齢消化器系悪性腫瘍患者術後感染予防」プロジェクトの資金提供を受けており、プロジェクト番号はA2023053です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4%パラホルムアルデヒド(PFA)シグマ・オルドリッチP6148
AKT(パン)ウサギmAb細胞シグナル伝達技術#4691
自動マイクロプレートワッシャーバイオテック(アジレント)ELx405
BC-2800vet 自動血液分析装置マインドレイBC-2800vet
クライオスタット・ミクロトームサーモフィッシャー・サイエンティフィッククライオスター NX50
シクロホスファミド注入バクスター・オンコロジー GmbH該当なし(バッチ:HJ20160467)
E100顕微鏡ニコンE100
EGFR抗体(A-10)サンタクルーズ・バイオテクノロジーSC-373746
埋め込み機械ライカEG1150
EPO(マウス)ELISAキットR&DシステムズMEP00B
GAPDHウサギ多クローナル抗体プロテインテック10494-1-AP
GM-CSF(マウス)ELISAキットR&DシステムズMMC00B
ヤギ抗ウサギIgG HRP結合ジャクソン免疫研究111-035-003
H&E染色キットシグマ・オルドリッチHT10
高速冷蔵遠心分離機サーモフィッシャー・サイエンティフィックソーヴァルST 16R
ハイスループット組織グラインダーサービスバイオKZ-II
免疫組織化学ペンベクター研究所H-4000
JAK2ウサギmAbアブカムAB108596
建皮聖雪煎湯(JPSXD)湖南がん病院薬局カスタム配合
マイクロプレートリーダーバイオテック(アジレント)シナジーH1
生理食塩水バクスター2B1324X
ロータリーミクロトームライカRM2016
ティッシュプロセッサーライカASP300S
TPO(マウス)ELISAキットR&DシステムズMTP00B
ボルテックスミキサーサービスバイオMX-F

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