このプロトコルにより、ヒトの胎盤の基底部十座および絨毛膜から原発HLA-G+の絨毛膜(EVT)の精製、特徴解析、培養が可能になります。一次EVT培養は96時間の生存能力を維持し、サンプルマッチした母体免疫細胞との共培養や、その後のフローサイトメトリクスおよび分子分析を可能にします。
この記事について
サマリー
要約
ヒトの母体・胎児インターフェースは、母体免疫細胞と胎児絨毛外栄養芽細胞(EVT)が直接細胞に接触し、免疫寛容を確立・維持する独特の免疫学的環境を表しています。EVTは、HLA-G、PD-L1、PD-L2などの容容性分子の発現を特徴とする独特の免疫表現型を示し、これらは母体の免疫応答の調節に重要な役割を果たします。さらに、ヒトEVTは母体のNKおよびT細胞によって直接認識され、それらの活性化を促進するHLA-Cを発現します。重要なのは、研究用動物モデルにはHLA-CやHLA-Gのオルソログが存在せず、マウスの栄養圏細胞はMHC発現を欠いていることです。したがって、生理学的および病理学的条件下で胎盤組織からのヒトEVTの表現型および機能的特性を調査することは、妊娠維持および胎盤炎症の病態生理のメカニズムを解明するために不可欠です。これらの原因は、妊娠前症、早産、胎児成長制限、胎盤アクリタに関連する胎盤炎症の病態生理です。本プロトコルは、健康な胎盤組織から、また早産および子癇前症後の原発性ヒトEVTの分離と特徴付けのための包括的な方法論を示しています。これには以下が含まれます:(1) 胎盤および絨毛膜組織の剥離;(2) 酵素的消化および単細胞懸濁液の調製;(3) FACSソートによるEVT浄化;(4) 高次元フローサイトメトリーによる表現型の特徴付け;および(5)母体免疫細胞との短期 in vitro 培養および共培養(最大96時間)。免疫学的機能検査やタンパク質・遺伝子発現解析などの後継応用に適した高純度で実用性の高いEVTの獲得に重点が置かれています。このプロトコルの実装により、EVTおよび母体免疫細胞の相互作用、そしてそれが健康な妊娠と複雑な妊娠の両方に与える影響の理解を深めるための、堅牢で再現性の高いプラットフォームが提供されます。
概要
ヒトの胎盤は、栄養圏幹細胞、合胞栄養圏、絨毛細胞栄養圏、絨毛外栄養圏(EVT)の4つの大きなカテゴリーを含み、それぞれ異なる機能と表現型特徴を持っています。その中でも、EVTはHLA-G、PD-L1、PD-L2、B7ファミリーのメンバーなどの免疫抑制分子の高い発現や、多型HLA-C 1,2,3,4,5,6など、独自の免疫学的特徴を示します。EVTは母体のデシデュアル組織、螺旋動脈、筋層に深く侵入し、母体免疫細胞と直接接触します7。EVTは、妊娠中の免疫耐性を維持するために制御が必要な母体TおよびNK細胞との相互作用の重要な媒介体である多型HLA-Cの顕著な発現を特徴としています。EVTで発現する唯一の古典的MHC分子として、HLA-Cは母体の記憶T細胞への抗原提示を可能にし、免疫保護を支持します8。しかし、いくつかの研究で、EVTはCD8 T細胞およびNK細胞の調節CD4 T細胞および耐容性状態を直接的に増加させ、細胞傷害や免疫拒絶から身を守ることが示されています 9,10,11,12,13。さらに、いくつかの研究では、子癇前症、早産、流産後に得られた胎盤の免疫学的変化が、健康な対照群と比較して報告されています 14,15,16,17,18,19,20,21.これらの免疫学的変化にはいくつかの可能性があり得ます。例えば、i) 既存の母体T細胞異常;ii) EVTの免疫抑制機能の障害;またはiii) 両細胞間の相互作用の障害。基礎となるメカニズムの推進力を明確にするために、母体免疫細胞とEVT相互作用の評価を可能にする生前外実験モデルシステムが不可欠です。
ここで紹介する手法とアプローチは、従来の栄養圏系統、栄養圏幹細胞モデル、オルガノイドを利用する既存の方法に比べていくつかの利点があります。最も重要なのは、古典的な栄養圏細胞株および栄養圏幹細胞モデルは、一次性EVTの本質的特徴、すなわちMHC発現プロファイル3,5,22,23を再現していないことです。第二に、ヒト栄養圏幹細胞(hTSC)および複数の分子阻害剤を含むオルガノイド培養の複雑な培地要求が免疫細胞の機能と表現型に直接影響し、EVTと免疫細胞相互作用の適切な評価を妨げています(22,24,25,26,27)。.最後に、分化後のhTSC培養の細胞多様性と胎盤オルガノイド構造の内側から外側に向く性質により、生体内での関連性を欠く栄養圏タイプとの免疫相互作用が可能となり、研究の明確さが低下しています(22,27)。
ここでは、ヒトの胎盤組織から一次HLA-G+ EVTを精製する方法を説明し、免疫細胞集団の有無にかかわらず最大96時間の培養を可能にします。この培地には、EVTや免疫細胞の機能に影響を与えつつ、その生存能力を維持する分子阻害剤が存在しません。このアプローチは、健康で複雑な妊娠におけるEVTと免疫細胞の相互作用を直接体 外 で研究するための貴重なプラットフォームを提供します。母体・胎児免疫寛容の主要な推進要因の発見や、胎盤炎症を解消するための治療的標的の特定に寄与すると期待されています。
プロトコル
シンシナティ小児病院の機関審査委員会は、この研究プロトコル(承認番号#2021-0336)を承認し、米国法に基づく生命倫理的配慮、個人情報の取り扱い、感染性病原体の取り扱い、インフォームドコンセント手続きの要件を満たしています。各検査室は実験開始前に、国家の研究ガイドラインに準拠した承認を得る必要があります。
このプロトコルは、従来のプロトコル2,28を改良し、2,28を改良し、最大96時間の生存能力を維持する一次HLA-G+ EVTの培養に焦点を当てています。HLA-G+ EVT様細胞株の確立についてはHamiltonら2、母体デクリンパ球のマッチングについてはIkumiら28を参照。
1. 実験室の設置(0日目)。
注意:サンプルの取り扱いにはクラスIIのバイオセーフティ(BSL2)キャビネットを使用してください。
- 39°Cと37°Cの水浴を2つ設置します。 37°Cの加湿CO2 インキュベーターを設置します。
- PBSを1回、ウォッシュ培地A、洗う培地B、EVT培養培地A、B、C(表1 および 表2)を準備します。
- 10 mg/mLのDNase I溶液15 mL(表1)と0.25%トリプシン/EDTA500 mLを37°Cの水浴で解凍します。
- 液体廃棄物の収集のために、生物殺菌剤/殺菌剤溶液(例:10%漂白剤)を入った容器をBSL2キャビネットに入れます。固形廃棄物用のBSL2キャビネットにバイオハザードバッグ付きの廃棄物容器を設置します。
- 吸収パッド、無菌解剖工具(湾曲先端ピンセットと6 1/2インチハサミ)、無菌金属フィルター、チューブラック、BSL2キャビネット内に無菌50mL円錐管を用意してください。
- 50mLの円錐形チューブを3本(それぞれ1xPBS入り2本、ウォッシュメディウムA入り1本)を準備し、解開時の胎盤組織片の採取に用いてください。
2. サンプル採取(0日目)
注意:妊娠24週から42週の間に帝王切開で得られた膜を持つヒト胎盤を使用してください。経膣分娩ではEVTが少なくなることがあります。
- 胎盤の処理は、理想的には分娩後1〜2時間以内に、出生後1〜2時間以内に、生存可能な細胞の産出を最大化するために、すぐにBSL2キャビネットで処理を開始します。胎盤は常に室温に保ちましょう。
- 胎盤を検査し、必要に応じてその大きさ、重さ、粗い形態的外観を記録します。
3. 組織剥離(0日目)
- 膜剥離
- 胎盤を胎児側(臍帯挿入部分が見える)に向けて置きます。羊膜(胎児側に最も近い膜)を、側膜からへその緒挿入部位に向かって手動で剥がして除去します。羊膜を切り取って捨てる。
- 絨毛膜を胎盤の基部から上へ2インチのストリップに切り、膜帯は胎盤に取り付けたままにします。
- 脈絡膜の膜を、双指の端を上向きに装着し、無菌の湾曲先端鉗子で母体円毛膜を優しく擦り取ります。
注意:効率的に作業し、絨毛膜を乾燥させないようにしてください。 - 絨毛膜を50mLの円錐形チューブに20mLのウォッシュメディウムAを投与します。
- 20 mLのPBSを含み、50 mL円錐形チューブでデシドゥア・パレエタリスを採取し、Ikumiらによるリンパ球単離のプロトコルに従います。
- 50 mLのチューブ内で絨毛膜をハサミで切り、< mm2の小さな破片にします。
注意:切断後の沈殿膜の総量は理想的には30mLです。 - ウォッシュMedium Aを捨て、PBSで何度か洗い流して上澄みが透明になるまで続けます。
- 胎盤剥離
- 胎盤を母体側を上に向けて置き、血栓を取り除きます。胎盤基礎板の断片(長さ2cm、幅2cm、深さ0.5cm)を無菌ハサミで切断し、壊死、石灰化、または虚血部分は避けます。
- デシドゥア・ベースサリスの断片を絨毛(胎児側)を上に向けて指に置きます。ハサミで細部絨毛を慎重に除去し、薄膜2〜3mmの膜を除去し、薄い絨毛層だけが残ります。
- 20mLのPBSを含む円錐管にデキドゥア基底組織を採取します。デキドゥア・バサリスを<2 mm2の小さなかけらになるまで刻みます。
注:沈着した組織の総量は、理想的にはチョップ後の15mLです。 - PBSは捨て、デシデュアル基底部をPBSで数回洗浄し、上澄液が透明になり血が見えなくなるまで続けます。
- 15 mLの組織懸濁液を2本の50 mL円錐形チューブ(各チューブに7.5 mL)に分割しました。
注:基底嚢胞からのリンパ球分離プロトコルは、このプロトコルとは異なります。Hamiltonらに記載されたプロトコルを参照してください。
4. 組織消化(0日目)
- セクション3の絨毛膜とデシドゥア基底の最終洗浄後、すべてのチューブにPBSを1回充填し、200× g で遠心分離機で1分間処理し、上清液を流出します。
- 組織消化酵素カクテルを準備します(表1)。温かい組織消化酵素カクテル150mLを300mLのガラス瓶に加え、次に30mLの絨毛膜をボトルに加えます。
- 温かいDMEM/F2020と温かい組織消化酵素カクテル80mLを300mLのグラスボトル2本に加え、各ボトルに7.5mLのデシドゥアバサリスを加えます。
- 絨毛膜入りのボトルは39°Cの水浴で、デキドゥア・バサリス入りの2本は37°Cの水浴で孵化します。15分間の孵化中は、最初の消化期に3〜4分ごとにすべてのボトルを振ってください。
- 消化後、消化組織を金属のふるい(メッシュサイズ40)でろ過します。洗い流しとゼラチン状物質を溶かすために、ウォッシュミディウムBを組織に加えます。
- 細胞懸濁液を100μmフィルターで50mLチューブにかけ、組織タイプと消化数をラベル付けしてろ過します。
- 2回目の消化では、未消化組織を300mLの培地ボトルに戻し、ステップ4.2で説明した組織消化酵素カクテルを加え、ステップ4.2から4.6を繰り返します。
注意:すべての基底手腕組織は1つの300 mLボトルに移されます。 最初の消化と2回目の消化後に得られた細胞は分けて保管してください。 - 細胞懸濁液を650× g で8分間回転させ、上清液を捨てます。
- 同じ組織タイプと消化数のペレットを1本のチューブにまとめます(ただし、最初の消化と2番目の消化は別々に)。ウォッシュメディウムBを最大25mLまで充填します。
5. フィコル密度勾配(0日目)
- 組織の種類と消化番号をラベル付けした50 mL円錐形チューブ4本を準備します。チューブに12mLのフィコルを注ぎます。
- セルサスペンションを慎重にフィコルに積み込んでください。800× g で20分間(室温)ブレーキなしでチューブを遠心分離します。
- 遠心分離後、Ficoll-培地界面の細胞層を組織の種類と消化数でラベル付けした清潔な50 mL円錐形チューブに慎重に移します。
注意:無菌転送ピペットを用いて界面を乱さずに慎重に層を採取してください。 - チューブにウォッシュメディウムBを入れ、650 × gで遠心分離機で8分間加熱します。
- 上澄液を捨て、残りの培地(約0.5 mL)で細胞ペレットを再懸浮させます。必要に応じて、表現型解析のために細胞懸濁液の約10%を分離し、90%を細胞選別に使用します。細胞数を数えて細胞数と生存率を判断します。
6. EVTの分類(0日目)
- 再懸浮した細胞ペレットを組織タイプと消化番号がラベル付けされた無菌FACSチューブに入れます。抗CD45-BV785(1:100)、抗HLA-G-APC(1:125)、抗エグフラ1-BV711(1:160)(表3)を加えます。暗闇の中、室温で20分間培養します。
- ウォッシュメディウムBを1mL加え、650× g で遠心分離して8分間調理します。
- 上清液を廃棄し、ウォッシュ培地Bで細胞ペレットを再懸濁させ、約1×10個6 細胞/mLの懸濁液を作ります。
- 細胞を40μmの細胞ストレーナーでろ過し、細胞選別直前に図1Aに記載されたゲート戦略に従い、CD45-HLA-G+EGFR+EVTを1 mLの培養培地Aと共にチューブに選別します。
注:栄養圏の最適な生存可能性を確保するには、ジェット空中セルソーター(例:ビッグフットやモフロー)を100μmノズルと組み合わせて使用してください。流体系ソータ(例:DB S6やSony Nano)は栄養圏の生存能力を低下させる可能性がありますが、磁気細胞ソーティング戦略(例:EasysepやMACS)は生存率は保つものの純度が低く、培養物内で気孔細胞の過剰増殖を引き起こすことがあります。 - 選別した細胞でFACSチューブを遠心分離し、上清液を廃棄し、細胞ペレットをEVT培養培地Bで再懸浮させます。
注意:次のセクションで細胞の選別中に培養皿を準備します。
7. 二次アッセイのための一次HLA-G+ EVT培養(0日目から1日目)
- 平底96ウェル培養プレートのウェルに、室温で20 μg/mLのフィブロネクチン50 μL(表2)を45分間塗布します。
- フィブロネクチンを除去し、EVT培養培地Bを用いた細胞懸濁液をウェルに加えます。培地/ウェルあたり200 μLあたり0.5個×10個5基底 EVTセル、1.0個×10個5絨毛膜 EVTセル/200 μLの培地/ウェルを目標にしてください。細胞培養プレートを加湿CO2 インキュベーターで37°C(0日目)で12〜18時間キュベートします。
- 1日目に培地Bを取り出し、細胞を1xPBSで優しく洗浄し、さらに(共)培養のためにT細胞有無にかかわらずEVT培養培地Cを加えます(節8参照)。
8. 活性化されたT細胞と原一次HLA-G+ EVTの共培養(0日目から4日目)
- 3人のドナーからのCD8+T細胞の刺激(0〜1日目)
- HLA-G+ EVTの選別中(0日目)、サンプルペアの母体血液または無関係の血液提供者から末梢血液免疫細胞集団を分離し、参照のヒトCD8+ T細胞濃縮カクテル(材料 表参照)を用いて、その後フィコル密度勾配遠心分離法(FACS選別法)を用います。
- リンパ球細胞培養培地内で、必要に応じて抗CD3/28ビーズやサイトカイン(例:IL2、IL15、IL12、IL18)でT細胞またはNK細胞を前刺激します。
- 活性化されたT細胞を用いた共培養EVT(1〜4日目)
- リンパ球の数を数え、0.5 × 106 / mL濃度のリンパ球培養培地で細胞懸濁液を作ります。一次EVTウェルに1×10個の5 個リンパ球を追加します(EVT培養培地の体積C:リンパ球細胞培養培地=1:1)。プレートは加湿CO2 インキュベーターで37°Cで24〜72時間培養します。
- フローサイトメトリー解析のためのリンパ球採取と、サイトカイン解析のための上清液採取。
- トリプシン化を用いてEVTを採取し、4日目にフローサイトメトリー解析のためにFACSチューブにEVTを収集します(第9節参照)。
9. 一次HLA-G+ EVTの表現型
注意:直ちにフローサイトメトリー染色を行い、EVTおよび必要な溶液は常に室温で保管してください。
- FACSチューブを一次EVTで650 × g で7分間遠心分離し、上清液を廃棄します。
- カスパーゼ3/7の染色液(表3)を細胞ペレットに加え、優しく混ぜます。
- 抗体で細胞を染色し(表3)、優しく混ぜてさらに20分間(合計30分の培養)培養します。
- EVT培養培地Cを1 mL加え、チューブを650 × g で遠心分離して7分間処理し、上清液を廃棄します。
- 細胞ペレットを0.4 mLの細胞EVT培養培地Cで再懸濁します。7-AAD染色液(5 μL/細胞懸濁液)をチューブに加え、すぐにフローサイトメーターで分析します。
結果
期待セルの収率
15 mLのデシドゥア・バサリスから、期待されるHLA-G+ EVTは、最初の消化で106 細胞×0.1-0.3、2回目の消化で106 細胞×0.1-0.6(合計0.2-0.8 ×10 6 細胞)を得ます。絨毛膜30 mLからの期待されるHLA-G+ EVT収量は、最初の消化で106 細胞×0.4-1.0、2回目の消化で106 細胞×0.4-1.5(合計0.8-2.5 ×6 細胞)です。分離株中のカスパーゼ3/7-7-AAD-生EVTの割合は90〜95%と予想されています。
一次HLA-G+ EVT培養
系統マーカー(HLA-G、HLA-C、EGFR)および細胞死マーカーのフローサイトメトリー解析により、このプロトコルは選別されたEVTをプレート化してから4日目(96時間後)まで有効な一次EVT培養を提供したことが示されました(図1B-D)。一次絨毛膜およびd. basalis HLA-G+ EVTの代表的な光学顕微鏡画像は、培養24時間、48時間、72時間後に示されます(図2A-F)。
一次HLA-G+ EVTとT細胞の共培養
このプロトコルにより、胎盤からの隔離後96時間で一次性EVTの生存率が向上し、前回の報告1、2、10と比較して改善されました。したがって、母体と胎児の界面における急性炎症を模倣する、前刺激リンパ球との共培養後のEVT応答の解析を可能にします。EVTは細胞外フローサイトメトリー染色により、多型HLA-CおよびPD-L1、PD-L2、PVR(CD155とも呼ばれる)、B7H3、HLA-Eなどの免疫抑制共抑制分子を発現します(図3A,B)。EVTはHLA-CおよびPD-L1、PD-L2、HLA-Eの発現を増加させましたが、プロトコルセクション8(図4A、B)に従い、活性化リンパ球と共培養した際にはPVRおよびB7H3の発現は増加しませんでした。さらに、7AADおよびカスパーゼ3/7染色(図4C,D)でEVT死亡の増加は観察されませんでした。
図1。培養後のEVT細胞選別およびフローサイトメトリーのゲーティング戦略。(A) decidua basalis EVTおよび絨毛膜 EVT を選別するための代表的なゲート戦略。R1はフォワードサイド散乱図におけるライブセルゲートです。R2はCD45+白血球の排除ゲートです。R3はHLA-G+EGFR+EVTゲートです。R4は7-AAD-カスパーゼ3/7-ライブEVTです。R4ゲートは必ずしもソートに必須ではありませんが、ここでは一次エスベリットの実現可能性を示すために示します。(B) 96時間のin vitro培養後のHLA-G+EGFR+EVTの代表的なフローサイトメトリープロット。(C,D)カスパーゼ3/7-7-AADの頻度は、選別中(0日目)および培養96時間(4日目)に生体EVTで現れます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2。in vitro 培養中のEVTの形態学。 (A)24時間、(B)48時間、(C)72時間の培養後の絨毛膜性EVTおよび(D)24時間、(E)48時間、(F)72時間後の脊髄膜低下部EVTの代表的な光学顕微鏡画像。スケールバー=50μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3。一次EVTの免疫表現型。 (A) 細胞外フローサイトメトリー染色(0日目)で決定された一次EVTにおけるHLAおよび共抑制分子の代表的なフロープロット。(B) ペア線プロットでは、0日目にd. basalisのEVT(青)および絨毛膜のEVT(緑)の各マーカーの完全な染色がIgG制御の生MFIを示している。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4。活性化リンパ球の有無にかかわらず、一次EVTの免疫表現型(4日目)。(A) 活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず、72時間培養後のEVTの代表的なフロープロット(4日目)。(B) ペアリングプロットでは、活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらずEVTのMFIが示されます。青いプロットは基底楔骨EVT、緑のプロットは絨毛膜のEVTを表します。(C) カスパーゼ3/7-7-AAD-生EVTの代表的なフローサイトメトリープロット(活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず)。(D) ペア線プロットは、活性化された第三者リンパ球の有無にかかわらず、カスパーゼ3/7-7-AAD-ライブエベトの周波数を示します。青いプロットは基底楔骨EVT、緑のプロットは絨毛膜のEVTを表します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
表1。組織の解剖と消化のための重要な試薬。1、2、24も参照してください。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
表2。EVT培養およびT細胞との共培養のための主要試薬。1、2、24も参照してください。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
表3。選別およびフローサイトメトリー解析のための主要な抗体および試薬。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
ディスカッション
プロトコルの重要なステップ
有効なEVTを得るためには、分娩直後に胎盤から細胞分離を開始し、分離から選別までのすべての手順を室温で行うことが重要です。EVTはリンパ球に比べて大きく接着性が高いため、詰まりを防ぐために以下の注意点を取るべきです:i) 細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通してから選別すること、ii) DNaseを含む培地を使用、iii) 細胞懸濁液の過剰集中を避ける(理想的には10⁶細胞あたり~×1個)、iv)ノズルサイズは少なくとも100μmの使用。ジェットインエアソーター(例:ビッグフット、MoFlo)は、流体力学ベースのセルソーター(例:BDソーター、ソニーナノ)と比べて、より高い実用的なエヴァーティブ(VLT)を達成します。
方法の改良とトラブルシューティング
基底十尾椎胚の初消化後の過剰または過少消化
底落骨組織の消化効率は胎盤によって異なります。過剰に消化された組織は大きく粘着性のある集合体を形成し、金属の篩を通過するのが困難です。通常、10〜30mLのウォッシュメディウムBを加えることで、ろ過時にこれらの集合体を分散させるのに役立ちます。それでも問題が解決しない場合は、組織に直接1〜2mLのDNaseを加えます。最初の消化で消化過多になった場合は、組織消化酵素カクテルの濃度を80%から70%に減らして2回目の消化に移してください。最初の消化のろ過後、残留組織の体積は約半分以下に減らす必要があります。残留組織量が変わらない場合は、組織消化酵素カクテルの濃度を80%から90〜100%に増やし、2回目の消化で調整してください。絨毛膜組織は一貫して胎盤をまたぐ消化されます。したがって、組織消化酵素カクテルの濃度調整は一般的に不要です。
上記のプロトコルで説明したものよりも大きな組織体積の消化に対して
絨毛膜30mL以上、または底底西翼組織15mL以上の消化の場合は、組織消化酵素カクテルを含む追加のボトルを使用してください。1本のボトルで組織の容量を増やすと消化不良になりがちです。
手法の限界
胎盤は経膣分娩でEVT収率が低いと予想されます。EVTは凍結融解ストレスに敏感で、その生存可能性や機能を大きく制限するため、選別前後にクリオ保存はできません。したがって、このプロトコルには停止点は含まれていません。
既存の手法と比較したこの手法の重要性
以前、組織培養培地Bとコラーゲン被覆プレートを用いて、期期胎盤からHLA-G+ EVT様細胞株を確立するプロトコルを報告しました。しかし、培地およびコラーゲン中のいくつかの阻害剤は共培養系におけるT細胞機能に影響を与える可能性があります。組織培養培地Bを用いていない他の以前の報告では、共培養中のT細胞の評価は認められましたが、細胞の変動性のためEVTは評価できませんでした。現在のプロトコルの利点は、培養培地の影響を最小限に抑えつつ、実用的な一次エベロジー培養を可能にする点です。このプロトコルは、EVTの免疫機能と周囲の免疫細胞への応答による機能変化を検証する実験的プラットフォームを提供します。この分野はこれまで十分に研究されていません。
開示事項
本研究に利益相反はありません。
謝辞
シンシナティ小児病院医療センターリウマチ科のシェリー・ソーントン氏とリウマチ科のリサーチ・フローサイトメトリー・コアの皆様、フローサイトメトリーと細胞選別にご協力いただき、心より感謝申し上げます。胎盤資料収集に尽力した参加病院のすべての看護師および医師;ティルブルグの研究室メンバー全員とCCHMC免疫学教員の有益な議論に感謝します。この研究はNIH R01HD116852(T.T.)の支援を受けました。シンシナティ児童研究財団(T.T.);バローズ・ウェルカム基金次世代妊娠賞 #NGP10115(T.T.);そしてMarch of Dimes Ohioの共同助成金(T.T.)も受賞しました。S.T.はJSPS KAKENHI助成金番号22KK0287および25K12697によって支援されています。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 15 mL Centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-955-238 | |
| -20 °C freezer | どの供給業者でも | ||
| 37 °C 5% CO2 Incubator | どの供給業者でも | ||
| 4 °C fridge | どの供給業者でも | ||
| 50 mL Conical Centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-955-240 | |
| 55 mM β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| 6 ½” scissors | どの供給業者でも | ||
| 7-AAD Viability Staining Solution | Biolegend | 420403 | |
| -80 °C freezer | どの供給業者でも | ||
| A83-01 | REPROCELL | 04-0014 | |
| AF700, mouse, IgG1 k Isotype Control | Biolegend | 400144 | |
| APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype Control | Biolegend | 400524 | |
| B7H3 PE/Dazzle594 | Biolegend | 351012 | |
| BD FACSymphony A5 SE Cell Analyzer | BD Biosciences | ||
| Bigfoot Spectral Cell Sorter | Thermo Fisher | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| BSL2 biosafety cabinet | どの供給業者でも | ||
| BV605 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 562652 | |
| BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control | Biolegend | 400105 | |
| BV785 Mouse IgG1, κ Isotype Cotrol | Biolegend | 400170 | |
| CD45 BV785 | Biolegend | 304048 | |
| Cell dissociation sieve | Millipore Sigma | CD1-1KT (mesh size 60) | |
| Cell strainers 40µm, 70µm, 100µm | Thermo Fisher | 22363547; 22363548; 22363549 | |
| CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent | invitrogen | C10423 | |
| Centrifuge | どの供給業者でも | ||
| CHIR99021, 3mM | Sigma-Aldrich | SML 1046-5MG | |
| Curved tip tweezers | どの供給業者でも | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | VWR Life Science | 97063-136 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11320-033 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher Scientific | 11131D | |
| EGF, Human, Recombinant, Animal Free | PeproTech | AF-100-15-1MG | |
| EGFR1 BV711 | Biolegend | 352920 | |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software | |
| Ficoll Paque Plus | Cytivia | 17144003 | |
| FlowJo Software | FlowJo | https://www.flowjo.com/ | |
| HLA-C PE | BD Biosciences | 566372 | |
| HLA-E PE/Cy7 | Biolegend | 342608 | |
| HLA-G APC | abcam | AB40915 | |
| Human AB serum | Corning | 35060CI | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL) | Sigma-Aldrich | C1063 | |
| Human fibronectin (1mg/mL) | Corning | 354008 | |
| Human recombinant IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| ITGA6 APC/cy7 | Biolegend | 313627 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A0278 | |
| magnet separator | promega | Z5342 | |
| Newborn Calf Serum (NCS) | gibco | 16010-159 | |
| PD-L1 AF700 | invitrogen | 56-5983-42 | |
| PD-L2 BV750 | Biolegend | 345528 | |
| PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype Control | Biolegend | 400126 | |
| PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype Cotrol | Biolegend | 400176 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline 10X Solution | ThermoFisher | BP399-4 | |
| PVR BV605 | BD Biosciences | 748276 | |
| Research grade FBS | Thermo Fisher Scientific | FB12999102 | |
| RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell | 15023 | |
| SB431542. 10 mM | Apex-Bio | A8249 | |
| Shaking water bath 37 °C | どの供給業者でも | ||
| Tryple Express 1x No Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
| VPA | Sigma-Aldrich | P4543 | |
| X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-380Q | |
| Y27632 | Sigma-Aldrich | 688000-1MG |
参考文献
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- Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
- Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
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