このプロトコルは、レーザーキャプチャーマイクロディセプションを用いて、腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のために、グリオーマサンプルから高品質な新生血管組織を十分に調製することに成功し、従来の主に血管新生因子に焦点を当てた研究の限界を克服し、グリオーマ血管新生の大規模なプロテオミクスプロファイルを提供しました。
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この記事について
サマリー
要約
膠腫は中枢神経系の原発悪性腫瘍であり、発生率と死亡率が顕著です。腫瘍血管新生はグリオーマの病態生理の特徴であり、腫瘍環境において重要な出来事です。腫瘍新生血管形成の異常な構造は、栄養供給源であると同時に、腫瘍細胞が血流に侵入することを可能にする転移性門路という二重の役割を果たしています。抗血管新生療法はがん分野で注目されている話題です。これまでの研究の多くは腫瘍血管新生の活性化因子および抑制因子に焦点を当てています。しかし、これは腫瘍血管新生の明確化に限られ、非常に限定的な範囲にとどまっています。異常なタンパク質発現や翻訳後修飾は、膠腫における血管の異常な形態に寄与します。このプロトコルでは、レーザーキャプチャ顕微解剖(LCM)を用いて、膠質腫組織から十分な量の新生血管組織を単離・精製し、同位体標識による定量的プロテオミクス解析で、対照群と比較して神経質腫新生血管組織の発現に差異のあるタンパク質を同定しました。これらのデータは、腫瘍血管新生の病理学的メカニズムの解明、抗血管新生治療標的の発見、腫瘍血管新生ベースのバイオマーカー構築に重要な科学的基盤を提供します。
概要
膠腫は、神経細胞に構造的および代謝的支援を提供するグリア細胞に由来する非常に異質な中枢神経系(CNS)腫瘍であり、組織学的にはアストロサイトトーマ、少突起膠腫、室膜外腫の各サブタイプに分類されます。WHOのグレードシステムによると、グリオーマグレードIおよびIIは低グレードのグリオーマ(LGG)であり、成長速度が遅く、長期的な安定性が期待されるもので、解剖学的部位に基づいて外科的切除が可能なことが多いです。対照的に、グレードIIIおよびIVは高グレードの膠腫(HGG)で、主に未分化かつ悪性で、非常に侵襲的な行動と悪い予後を示します。現在の治療法は依然として限られており、ほとんど効果がありません。最大限安全な切除と術後の放射線治療・化学療法の組み合わせは予後を中程度改善しますが、腫瘍のびまんな浸潤増殖や境界の不明瞭さにより、根治的切除を妨げる顕著な制限と毒性が依然として存在します4,5。ヒトグリオーマ、特に高グレードのグリオーマは、血管が非常に多い悪性腫瘍であり、その成長、増殖、侵襲は異常な新生血管化に大きく依存しており、これはグリオマ悪性腫瘍の重要な特徴です。標的腫瘍血管新生研究は、治療的画期的な科学的価値を有しています。
血管新生は基本的に、特定の刺激下での内皮細胞の増殖、移動、分化を含み、研究は調節因子に焦点を当てています:(i) 誘導因子(血管内皮成長因子(VEGF)8、バソリン(VASN)9、低酸素誘導因子1(HIF1)10、形質転換成長因子β(TGF-β)11、エンドカン12、血小板由来成長因子(PDGF)13、表皮成長因子(EGF)14;および(ii)アンジオスタチン15、エンドスタチン16、血小板活性化因子受容体1(TSP-1)17、およびメタロプロテイナーゼ組織阻害剤(TIMP)18。第I相、第2期、第III相脳腫瘍臨床試験では、ほとんどの抗血管新生薬が血管新生における中心的役割を持つVEGFシグナル伝達を標的としており、その例としてVEGF遮断19,20,21を通じて新生血管形成を阻害するモノクローナル抗体ベバシズマブが挙げられます。しかし、最近の第II/III相試験では、ベバシズマブ併用ロムスチンを投与された進行性膠芽腫患者に対し、ロムスチン単独と比較して有意な全体生存利益は認められませんでした(19,20,21,22)。重要なのは、抗VEGF療法が血管異常を改善する一方で、直接的な腫瘍細胞毒性がなければ血管新生を抑制し、治療抵抗性を引き起こす可能性があることです。したがって、単一または少数の血管新生調節因子を標的にするだけでは根本的な治療は達成できません。効果的な戦略は、血管新生の抑制と血管経路を通じた腫瘍の浸潤および転移の遮断を同時に行う必要があります。膠腫におけるタンパク質の診断および予後価値は確立されていますが、悪性膠腫治療は数十年にわたり限定的な進展しか見られていません。
プロテオミクスは、発現プロファイル、翻訳後修飾(PTM)、相互作用を含む生物サンプル内のすべてのタンパク質を、質量分析(MS)に基づく手法(トップダウン(TDP)およびボトムアップ(BUP)アプローチを用いてグローバルに分析できます。ハイスループットMSは、1回のランで数万個のタンパク質を同定できるため、腫瘍メカニズムの研究や治療的標的同定に不可欠です。タンパク質の豊富さとそのPTMは、膠質腫組織や血液およびその誘導体23、24、25、脳脊髄液26、尿27などの液体生検で同定できます。腫瘍血管では、異常なタンパク質発現とPTMが病理的な血管変化を引き起こします。神経膠腫新生血管形成におけるタンパク質変異はプロテオミクスで同定可能であり、これが神経質腫新生血管形成の信頼できるプロテオームプロファイリングのプロトコル開発を推進しています。
しかし、新生血管組織はグリオーマ全体の構成要素の一つに過ぎません。新生血管組織をグリオーマ組織全体から単離・精製することは、グリオーマ血管新生の正確な定量的プロテオミクス解析の重要なステップです。レーザーキャプチャマイクロディセクション(LCM)28,29,30,31は、新生血管組織を全グリオーマ組織から分離・精製する効果的なアプローチです。定量的なプロテオミクスのために十分な量の新生血管組織タンパク質を得るのは非常に困難です。2007年、研究チームはLCMを用いてグレードIVの神経質腫から新生血管組織を分離しプロテオミクス解析を試みましたが、MS32を持つタンパク質は4つしか特定できませんでした。その後、2012年にはLCMを継続的に用いてグレードIV膠腫の新生血管組織を濃集し、定量的プロテオミクス解析を行いましたが、MS33を有するタンパク質は29個のみで同定されました。これら2つのグリオーマ血管新生プロテオミクス研究は、膠質腫血管新生におけるプロテオームスループットが非常に低いことを示しており、これはグリオーマ血管新生の複雑なプロテオーム的状況を代表できません。
このプロトコルは、神経質腫血管新生の定量的プロテオミクス解析のために十分な新生血管タンパク質を取得できる手技を開発し、腫瘍血管新生の大規模なプロテオミクス的ランドスケープを構築しました。これは効果的な血管新生ベースのバイオマーカーや抗血管新生治療標的・薬剤の発見に重要な科学的価値を持っています。
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プロトコル
この人体組織サンプルを用いたプロトコルは山東第一医科大学医療倫理審査委員会(承認番号R202211090133)により承認され、患者および患者家族から十分な同意が得られました。本研究で使用された膠腫サンプルはすべて、セントラルサウス大学の湘雅病院脳神経外科部門の神経外科切除標本から採取され、その中には3級アストロサイトーマ組織7例も含まれます。正常な制御血管(n=3)は、脳外傷により除去された損傷した脳組織内の微小血管から採取されました。すべての患者は手術前に放射線治療や化学療法を受けておらず、初めての来院者であり、中央南大学湘雅病院の病理科で診断されました。湘雅病院で外部からの力で損傷した正常な脳の非常に微小な血管の神経外科的切除により、3つの正常な対照血管組織が取得されました(神経膠腫はありません)。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. LCMを用いて新生血管組織をヒトグリオーマ組織から分離すること
- LCMスライドの準備:再利用可能な金属スライドにポリエチレンナフタレート(PEN)膜を手動でコーティングし、コーティングされたスライドは-80°Cで保存します。
注:凍結組織の断片は、事前にコーティングされた金属スライドを使用して直接接着します。 - トルイジンブルー染色液(0.5%)を準備します:0.25gのトルイジンブルーを40mLのddH₂Oに溶かします。プロテアーゼ阻害剤錠剤を1錠加え、完全に溶けるまで混合します。ddH₂Oで50mLに体積を調整し、ろ過して氷で保存します。
- プロセス組織:クライオスタットを作動温度(-25°Cのチャンバー/試料頭部)に維持してください。-80°Cの貯蔵からグリオーマ組織を回収し、氷で移し、フィルターペーパーで血液を除去し、適切な組織ブロックを選択して埋め込みを行います。
- 組織埋め込みプロトコル:予冷却標本ディスク。埋め込み培地を塗布し、組織ブロックを素早く埋め込みます。ブロック全体を-25°Cで10分間凍結し、硬化させます。
- 組織切片と血管のスクリーニング:厚さ8μmの切片組織。組織切片を標準スライドにマウントし、トルイジンブルー染色液で組織を染色し、新生血管を光学顕微鏡でスクリーニングします。
注:血管が検出されない場合は、3〜5個の組織切片を廃棄し、新生血管血管領域が現れるまで染色サイクルを繰り返します。 - 準備済みLCMスライドに血管陽性組織断片をマウント:血管陽性断片をPENコーティングされたLCMスライドに移し、密封、ラベル表示、-80°Cで保存します。
- LCMスライドマウントの組織切片を、事前に冷却した70%エタノール(4°C、1〜2分)に固定します。排水および染色は0.5%トルイジンブルー(4°C、30秒)で行われます。染みを抜き、ddH₂O(4°C、2回の洗い槽)で2回すすいで、水切り、プロテアーゼ阻害剤溶液で培養(30秒)、-80°Cで保存します。
- LCM機器を事前に起動し、30分間予熱し、さらに30分間固体赤外線レーザーで予熱し、その後500μLのマイクロ遠心分離機採取装置を設置します。
- 組織サンプルに取り付けられたLCMスライス(-80°Cで保存)を準備済みのLCM機器に搭載し、対応ソフトウェアの支援を得て膠質腫組織内の新生血管への焦点を調整します。
- 新生血管の外縁に沿ってレーザーマーキングラインを正確に描き(血管壁を避け)、レーザーで新生血管を焼き分離し、EPチューブキャップに集めます。
注意:2回目のレーザー焼きは新生血管が完全に剥離されていることを確認するために使用してください。 - 採取した新生血管血管サンプルチューブを裏返し密封し、-80°Cの冷凍庫に保管します。
2. LCM分離された新生血管組織からのタンパク質抽出とタンパク質含有量の定量
- 4%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mMジチオスレイトール(DTT)、150 mM トリス-HCl(pH 8.0)を含むタンパク質抽出バッファーを準備します。
注:SDSは目、皮膚、呼吸器を重度に刺激する有害な粉塵であり、これらは排気フードで計量する必要があります。そしてDTTは刺激物であり、排気フードで計量する必要があります。 - LCM採取した神経質腫新生血管組織を抽出バッファー内で再懸浮させる。完全な溶解のために氷水浴で1分間ソニック酸液を浴びます。
- 16,000 x g で10分間遠心分離し、上清液を新しいマイクロ遠心分離機チューブに移します。
- タンパク質定量のために最小上清を除きます。残った上澄液にDTTを加え(最終濃度:1 mM DTT)、泡を避けるためにピペットで優しく混ぜます。アリコットを取って-80°Cで保存します。
- 以下の手順に従ってビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイを行います。
- 作動溶液(試薬A:B = 50:1)を準備します。
- 牛血清アルブミン(BSA)標準(0.5 mg/mL)を調製します。
- 表1に従って対応する解を加えます。
- サンプルや標準物質を作業液と混ぜて96ウェルプレートに移します。
- 37°Cで30分間孵育します。
- 562nmで吸収を測定してください。
- 濃度を標準曲線に照らして計算します。
3. 定量的プロテオミクスを用いた新生血管タンパク質の解析
- 抽出した新生血管タンパク質のトリプチンペプチドサンプルを準備します。
- 抽出した各タンパク質サンプル(腫瘍;対照群)(サンプル:アセトン=1:5、v/v)に氷のように冷たいアセトンを加え、十分に混ぜて-20°Cで1時間培養します。遠心分離機は12,000 x g (4°C)で15分間行われます。上澄液を捨ててタンパク質抽出試薬(SDS、DTT、Tris-HCL)を除去し、ペレットを1μL1%SDSで20μL溶解バッファーに再懸浮させます。
注意:安全ゴーグルを着用し、十分な換気の良いアセトンを使用し、着火源から離れ、廃棄物は専用の火花防止容器に保管してください。 - 各サンプルに2μL還元試薬(DTT)を加え、十分に混ぜて60°Cで1時間インキュベートします。システイン遮断試薬(ヨードアセトアミド)1μLを加え、室温で10分間培養します。
- 各サンプルにトリプシン(タンパク質:トリプシン=20:1、v/v)を加えます。渦を混ぜて37°Cで一晩孵化します。
- 抽出した各タンパク質サンプル(腫瘍;対照群)(サンプル:アセトン=1:5、v/v)に氷のように冷たいアセトンを加え、十分に混ぜて-20°Cで1時間培養します。遠心分離機は12,000 x g (4°C)で15分間行われます。上澄液を捨ててタンパク質抽出試薬(SDS、DTT、Tris-HCL)を除去し、ペレットを1μL1%SDSで20μL溶解バッファーに再懸浮させます。
- 準備されたトリプティックペプチドを標識するために、相対および絶対定量試薬(iTRAQ)用の等圧ターガルを使用しています。
注:このプロトコルでは、6重体iTRAQ試薬(プレックスタグ113、114、115、116、117、118)を用いてトリプチンペプチドサンプル(腫瘍・対照)を標識し、各サンプルに3回標識を付けます(表2)。- 各iTRAQ試薬チューブを50μLのイソプロパノールで再構成します。
- トリプチンペプチドサンプルを対応する試薬チューブに加え、室温で1時間培養します。
- 反応を終わらせるために3×容量の超純水を加え、室温で30分間培養します。
- ラベル付きの6つのサンプルを均等にまとめ、よく混ぜて凍乾します。
- 強カチオン交換(SCX)を用いてiTRAQ標識トリプチンペプチドサンプルを分画します。
- 2 mLの溶液A(10 mM KH₂PO₄、25% ACN、pH 2.7)で凍結乾燥ペプチドを再構成します。スルホエチル官能化陽イオン交換カラム(4.6 × 100 mm、5 μm、200 Å)に負荷をかけます。
- 溶液B(500 mM KCl、10 mM KH₂PO₄、25% ACN、pH 2.7)を用いて、一定流量1 mL/minで溶出:0 %→10%(2分)→ 10%→20%(25分)→20%→45%(5分)→50%→100%(5分)。プロセス中は214nmでモニタリングし、1本あたり1分ごとに30分ずつ収集します。
- 各分画を真空遠心分離で濃縮し、その後0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)40μLで再構成します。30分すべての分が-80°Cの冷凍庫に保管されます。
注意:TFAは非常に腐食性が高く有毒で、皮膚や目の重度の損傷を引き起こし、呼吸器系を刺激します。排出物は、耐酸手袋、ゴーグル、白衣を含む適切な個人防護具(PPE)を着用した換気フードで取り扱い、廃棄物は酸性廃棄物として収集しなければなりません。
- 各分画ペプチドサンプルを分析するためにLC-MS/MSを使用します。
- 脱塩にはC18逆相固体相抽出カートリッジ(標準密度、床内径7mm、容量3 mL)を使用します。
- C18逆相液体クロマトグラフィー(LC)カラム(長さ10cm、内径75μm、樹脂3μm)を用いて、各分画を10μLずつ溶液C(0.1%蟻酸)と溶液D(80%アセトニトリル、0.1%蟻酸)の勾配で250 nL/minの速度で140分間洗出します。
- オンラインでLC分離ペプチドを高分解能質量分析計に入力し、MS/MS分析を行います。
- Q Exactiveで生成された生スペクトラムファイル(.raw)をProteome Discoverer 1.4で.mgf形式に変換し、これらの.mgfファイルをMASCOT 2.2サーバー (ソフトウェア内蔵モジュール)に提出し、データベース検索が可能です。
注:Uniprotヒトのデータベース(合計146,704配列;2025年7月20日、http://www.uniprot.org からダウンロード)は詳細な検索パラメータと共に使用されます(表3)。 - MASCOTサーバーからProteome Discoverer 1.4へ返す結果の検索ファイル(.dat)を取得します。偽発見率(FDR)閾値<0.01でのろ過データで高信頼度の同定を得る。
- MS/MSデータでタンパク質アミノ酸配列を特定し、iTRAQリポーターイオン強度でタンパク質の存在比を定量化します。
- 差異発現タンパク質(DEP)のカットオフ値と有意な p<0,05 を決定するために実験的再現性を計算します。
注:本研究では、カットオフ値はフォールド変化(FC)>1.4として決定されており、これにより系統誤差を効果的に除去できます。
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結果
定量的プロテオミクスのために十分な量のLCM分離タンパク質サンプルが取得されました
神経膠腫新生血管組織における差異発現タンパク質の信頼できるプロテオームプロファイルを得るため、本研究では最も一般的な膠質腫亜型であるアストロサイトーマグレードIIIと、濃縮された新生血管血管の利用可能性を考慮しLCMを用いた単離新生血管組織を選択しました。さらに、定量的プロテオミクスでは1サンプルあたり≥400μgのタンパク質が必要です。本研究ではLCM技術を用いて、グレードIII星形細胞腫組織7例から新生血管組織を正確に分離し、合計8.4 mgのLCM分離新生血管組織を得ました(表4)。また、正常対照微血管では脳外傷により脳組織が切除された3例から合計27.5mgが検出されました(表4)。
LCM分離された新生血管組織サンプルは非常に貴重であるため、抽出前にそのタンパク質含有...
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ディスカッション
LCMと同位体標識定量プロテオミクスの組み合わせにより、膠質腫血管新生の初の大規模プロテオームプロファイルが特定されました
腫瘍血管新生は膠質腫の重要な病理学的特徴であり、その高侵襲性と治療抵抗性と密接に関連しています 6,7。従来の抗血管新生療法(例えばVEGF阻害剤)は、標的の単調性と代償抵抗性のため臨床的有効性が限定的です(19,20,21,22)。腫瘍血管新生を対象としたこの研究は、科学的価値が高いです。腫瘍血管新生の大規模プロテオームプロファイルを得るためには非常に重要です。このプロトコルの重要な革新は...
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開示事項
著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。
謝辞
この研究は中国自然科学基金(81272798からX.Z.、82203592からN.L.)、山東省自然科学基金(ZR2022QH112からN.L.)、山東省台山学者工学プロジェクト特別基金(NO.tstp20221143からX.Z.)、中国国家高級外国専門家人材プログラム(H20240743;外国専門家:X.Z.)、および山東省第一医科大学新興戦略分野科学研究育成プロジェクト(202403)に関わりました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 96井戸板 | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック(アメリカ) | 468667 | 消耗品 |
| アセトン | 南静試薬(中国) | C0720114023 | 試薬 |
| アセトニトリル | メルク(中国) | CN34892 | 試薬 |
| BCAタンパク質アッセイキット | アブカム(イギリス) | ab102536 | 試薬 |
| 牛血清アルブミン(BSA)標準 | ソラルビオ(中国) | PC0001-1 | 試薬 |
| 遠心分離機管(50ML) | キルゲン(中国) | KG2811 | 消耗品 |
| クライオスタット・ミクロトーム | ライカ(ドイツ) | 約1900年 | 装備 |
| システイン | アラジン(中国) | C108238 | 試薬 |
| DL-ジチオスレイトール(DTT) | アムレスコ(アメリカ) | D8220 | 試薬 |
| EASY-Spray C18逆相HPLCカラム | サーモ・サイエンティフィック(アメリカ) | ES800A | 消耗品 |
| 電子天秤 | サルトリウス(アメリカ) | BSA224S | 装備 |
| 埋め込み媒体 | ライカ(ドイツ) | 39475237 | 消耗品 |
| エンポレ SPE カートリッジ C18 | シグマ・オルドリッチ(アメリカ) | 66872-U | 消耗品 |
| エッペンドルフ管 | キルゲン(中国) | KG2211 | 消耗品 |
| ろ過紙 | シティバ(アメリカ) | 42年生 | 消耗品 |
| 蟻酸 | アラジン(中国) | F112032 | 試薬 |
| ガラスビーカー | シュボ(中国) | 1015479 | 消耗品 |
| ガラス目盛り円筒 | シュボ(中国) | 1601 | 消耗品 |
| 高分解能液体クロマトグラフィー質量分析法 | サーモ・サイエンティフィック(アメリカ) | Q-Exactive | 装備 |
| 断熱容器 | フェフォン(中国) | LCZYX-12 | 消耗品 |
| 逆立顕微鏡 | ライカ(ドイツ) | XDS-1 | 装備 |
| ヨードアセタミド | ソラルビオ(中国) | I8010 | 試薬 |
| イソプロパノール | アラジン(中国) | I112018 | 試薬 |
| iTRAQ試薬 | シグマ・オルドリッチ(アメリカ) | 4381663 | 試薬 |
| KCl | ビヨタイム(中国) | ST1596 | 試薬 |
| KH2PO4 | 上海元業(中国) | S24278 | 試薬 |
| レーザーキャプチャマイクロ解剖 | ライカ(ドイツ) | LMD 6000 | 装備 |
| レーザーキャプチャマイクロ解剖スライド | ライカ(ドイツ) | 3800040 | 消耗品 |
| ライカのハイプロファイル使い捨てブレード | ライカ(ドイツ) | 14035838926 | 消耗品 |
| 液体窒素容器 | キーイクリョ(中国) | YDS-3 | 装備 |
| 磁気ホットプレート攪拌器 | 上海SILE(中国) | LAB-0002-0068-SHSL | 装備 |
| マイクロプレートリーダー | TECAN(スイス) | インフナイトF200 | 装備 |
| PEN 膜 | ライカ(ドイツ) | 11505189 | 消耗品 |
| pHメーター | サルトリウス(アメリカ) | PB-10 | 装備 |
| ピペット | エッペンドルフ(ドイツ) | 3123000268 | 装備 |
| ピペット | エッペンドルフ(ドイツ) | 3123000241 | 装備 |
| ピペット | エッペンドルフ(ドイツ) | 3123000225 | 装備 |
| ポリスルホエチルA | PolyLC Inc(アメリカ) | 104SE0303 | 消耗品 |
| プロテアーゼ阻害剤 | ローシュ(スイス) | 05892791001 | 試薬 |
| 冷蔵遠心分離機 | ベックマン(アメリカ) | アレグラTM X-22R | 装備 |
| 冷蔵庫 | 美嶺(中国) | BCD-180KCT | 装備 |
| ドデシル硫酸ナトリウム(SDS) | アムレスコ(アメリカ) | 1027P033 | 試薬 |
| 染色壺 | ビヨタイム(中国) | FG005 | 消耗品 |
| ステンレス製スクープ | 木子星(中国) | XYS-101 | 消耗品 |
| ヒント | キルゲン(中国) | KG1313 | 消耗品 |
| トルイジンブルー染色溶液 | シグマ・オルドリッチ(アメリカ) | 198161-5G/198161-25G | 試薬 |
| トリフルオロ酢酸 | アラジン(中国) | T103293 | 試薬 |
| トリスHCl | アムレスコ(アメリカ) | T8230 | 試薬 |
| トリプシン-EDTA溶液 | ソラルビオ(中国) | T1300 | 試薬 |
| 超低温冷凍庫 | 三洋(日本) | MDF-382E | 装備 |
| 超純水浄化器 | ELGA(イギリス) | PureLABフレックス | 装備 |
| 超音波セルディスラプター | QSONICA(アメリカ) | Q500 | 装備 |
| 真空フリーズドライヤー | サーモ(アメリカ) | SNL 315SV | 装備 |
| ボルテックスミキサー | クリスタル・テクノロジー&インダストリーズ(アメリカ) | HYQ-3110 | 装備 |
| 水浴インキュベーター | 上海一衡技術機器(中国) | HWS-26 | 装備 |
| 紙の重さ | コール・パーマー(アメリカ) | 133802 | 消耗品 |
参考文献
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