本研究は、麻酔ラットにおける人工間質液(AISF)のリアルタイムかつ解剖学的に正確なサンプリングを可能にする微小透析技術を導入し、異なる代謝変異を明らかにし、その独自の生理学的重要性を裏付けます。既存の間質流体(ISF)サンプリング法と比較して、この手法は分子分解能とサンプリングの安定性を向上させます。
方法論記事
顕微透析プローブの挿入によるラット大腿動脈静脈間質液のリアルタイムサンプリング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
間質液(ISF)は細胞外微小環境の重要な要素であり、代謝交換と細胞間コミュニケーションを促進します。それにもかかわらず、解剖学的な深さと血管構造への近接性から、ventitial ISF(AISF)は汚染や組織破壊なしに採取が特に困難です。本研究では、麻酔ラットにおけるマイクロ透析を用いたリアルタイムの低侵襲AISF採取法を導入します。大腿動脈静脈のventitiaと頸静脈に20 kDaカットオフプローブの二重を外科的に挿入し、それぞれISFと血液の連続サンプリングが可能となりました。人工細胞外液による灌流により、低分子量代謝物の選択的拡散が可能となりました。主成分解析(PCA)および直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)により、AISFと血液の間に明確な代謝的差異が観察され、146種類の有意に異なる代謝物が特定されました。乳酸およびセロトニンの濃縮パターンは、この方法の解剖学的特異性と機能的信頼性を裏付けました。重要なのは、AISFが血漿に存在しない局所合成代謝物で強化され、その独自の生理学的意義が際立っていたことです。現在の間質液(ISF)サンプリング方法、例えばマイクロニードル、吸引水疱、逆イオントフォレシスと比べて、マイクロダイアリシスは分子分解能の向上、サンプリングの安定性向上、侵襲性の低減を提供します。この技術は間質液中の分析物(AISF)の生 体内 分析の信頼できるプラットフォームを構成し、バイオマーカーの発見と血管病態生理学の研究を推進する大きな可能性を示しています。
概要
組織液、または間質液(ISF)は細胞微小環境の重要な要素であり、19世紀後半にまで遡る学術的研究が行われています。1896年、スターリングは毛細管のろ過再吸収理論を導入し、ISFをプラズマ超ろ過によって生成される均質な流体として初めて特徴づけ、栄養分のない輸送や代謝廃棄物の除去に重要な役割を果たしました。過去20年間で、顕微鏡イメージング技術と分子生物学の進歩により、ISF2の解剖学的分布、組成、機能における多様性の大きな理解が深まりました。
さまざまな解剖部位における間質液(ISF)の研究により、異なる組織内でのその明確な機能が明らかになっています。例えば、脳組織では、ISFはグリパ系を通じて睡眠中に神経毒性代謝物(β-アミロイド)の除去を促進します。逆に、腫瘍間質液(TIF)は乳酸の蓄積を通じて酸性微小環境を促進することで腫瘍侵襲や免疫回避に寄与します。これらの発見は、ISFが代謝交換の媒介者であるだけでなく、組織特異的な病態生理学的プロセスの能動的な調節因子としても機能していることを示唆しています。この文脈で、人工間質液(AISF)はその特定の解剖学的局在性と機能的複雑さから独自の研究課題を呈しています。AISFは翼膜と周囲組織の界面に位置し、血管壁と神経系および免疫系との相互作用において重要な役割を果たしています。しかし、その深い解剖学的場所と血液・リンパ液への近接性は、現地サンプリングや組成解析において大きな技術的課題をもたらしています。
従来のISFサンプリング技術、例えばウィック法や外科的排出法は、血液汚染や組織損傷のリスクにより高純度AISFサンプルの取得に大きな課題があります。例えば、血管上皮の外科的切除は末梢神経やリンパ管に損傷を与え、非標的生体分子の混合を引き起こす可能性があります。さらに、これらの方法はサンプリング率の低さ、不安定性、干渉への感受性、再現性の低さに制約されており、多くの場合、皮下ウィック7挿入による炎症や筋肉 移植時の細胞損傷に起因します。微小透析の開発は、ISF研究においてより効果的なアプローチを示しています。この技術により、半透膜プローブを用いて血管構造を損なうことなく、ISF内で代謝物やサイトカインなどの小分子をその 場 で動的に捕捉することが可能です。プローブは血管上皮空間内に正確に配置できるため、血液やリンパ液による汚染のリスクを低減します。さらに、連続サンプリングを可能にし、さまざまな条件下でのISF代謝の動的変化をリアルタイムでモニタリングすることが可能です。実験中はこれらの代謝過程を継続的かつ安定的にモニタリングすること。
プロトコル
動物実験は北京協和医学院動物倫理委員会の承認を受けて実施されました。すべての手続きは確立されたプロトコルに厳格に従って行われました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 実験的調製
- 図1に示す微小透析サンプリングシステムおよび関連する外科器具を示してください。
- 153.5 mM Na、4.3 mM K、0.41 mM Mg、0.71 mM Ca、139.4 mM Cl、1.25 mM グルコースを含む人工細胞外液(aECF)を製製し、pHを7.4に調整します。
- 20 kDaのmDプローブを2つ準備し、プローブ1(組織液プローブ)とプローブ2(血液プローブ)と指定します。プローブ1を無菌ろ過脱イオン水(dH₂O)に、プローブ2を1%ナトリウムヘパリンに浸し、プローブ先端が常に湿った状態を保つようにします。
- 「流入」と「流出」の2つの経路ペア(経路1と2)を設定します。PE50チューブを使って1mのFEPチューブセグメントを2つ接続し、デッドスペースを最小限に抑えます。各インフローチューブを1mLのExmireシリンジに接続し、シリンジ1にdH₂O、シリンジ2に1%ナトリウムヘパリンを充填します。マイクロシリンジをプローブに接続し、プローブを頸静脈に挿入した後、aECF注入の準備をします。
- mDポンプを作動させ、流量を1.5 μL/minに設定し、流体が流出チューブから出てくるまで続けます。流出チューブをサンプル採取ラインに接続してください。
- 2つのマイクロシリンジにろ過したaECFを満たし、1 μL/minでポンプを開始します。
2. 動物の調理
- 体重280±20g(n = 6)の選ばれた成虫スプラグ・ドーリーラット。
- 3%イソフルランで麻酔を誘導し、1.8%〜2.2%イソフルランを空気・酸素混合液で維持しながら心拍数をモニターします(機関で承認されたプロトコルに従い)。痛み反応の欠如と心拍数の低下(340-390 bpm)を確認して深麻酔を確認しましょう。ネズミをサーモスタットブランケットの上に置き、手足を固定します。
- 脱毛クリームを首と左後肢に塗り、左下腹部まで塗ります。脱皮部位をヨードホーで2回消毒し、残留ヨウ素を75%医療用アルコールで除去します。
3. 二重部位プローブの配置(大腿動脈の門状筋と頸静脈)
- 図2Aに示すように、10mmのアクティブ透析ウィンドウを持つプローブ(CMA-20、カットオフ20 kDa、シャフト径0.5 mm)を使用します。
- ガイドニードルと引き裂きチューブ(図2B)を準備します。
- ラットの後肢を伸ばし、膝関節と鼠径部の折り目の中央点をつなぐ線を体の縦軸に垂直にします。鼠径部の皮膚に沿って後肢方向に2cmの区画を測定し、手術のランドマーク領域を定義します(図2C)。この鼠径部の中央点をマイクロウィンドウの位置決め点と特定します。この位置から2cm横方に刺し穴をマークしてください(図2D)。
- 動物を立体顕微鏡下に置いてください。
- 鼠径部の折り目の中央に0.5〜0.8cmの切開を入れ、視認しやすく、プローブを血管周囲膜内に正確に配置できるようにします。皮下組織を鈍く剥離し、大腿動脈と静脈、大伏在静脈、そして表層腹壁静脈を露出させます(図2E)。
- 刺針の外層を破れやすいチューブで包み込み、ガイドニードルを作ります。
- 穿刺部位の皮膚の下に血管がないか確認してください。針を皮膚に垂直に挿入し、角度を45°に調整して大待在静脈の周囲の組織空間に入ります。
- 針を大伏在静脈内の血流方向に進め、処置中は血管壁に密接に接触を保ちます。立体顕微鏡を使って針の位置をリアルタイムで監視し、血管損傷や血液汚染を防ぎましょう。その後、針を大腿静脈の翼状動脈に導きます(図2F)。
- 刺針を抜き、引き抜きチューブは組織内に残したままにします(図2G)。
- 組織液プローブを破れやすいカテーテルに挿入し、慎重にカテーテルを開けてサンプリング部位を露出させ、組織サンプルを採取します(図2H)。プローブが大腿動脈と静脈の肺動脈内に正確に位置していることを確認してください(図2I参照)。縫合前にプローブを皮膚に固定します(図2J)。すべての処置は厳格な無菌条件下で行い、血管の人工呼吸の乱れや組織の炎症や異物反応の防止に注意してください。
- 手術用定規と固定プローブを一緒に撮影して露出した長さを記録し、図 2Iのようにこの画像を提示してプローブの位置を確認します。
- 胸骨切痕の1cm上から、首の正中線から約0.5cm外側に2cmの皮膚切開を開けます。
- 胸鎖乳突筋を鈍く切り離し、頸動脈の外側に位置し濃い青色の色合いで識別される頸静脈を露出させます。湿らせた綿棒で筋膜を優しく切り離し、迷走神経との接触を避けるように注意してください。
- 顕微鏡用ピンセットを用いて、頸静脈の外膜を優しく持ち上げ、周囲の結合組織を慎重に除去して少なくとも1cmの自由血管長を確保します。4-0シルク縫合糸を近位に挿入し、バックアップの結紮として使います(図2K)。
- 静脈穿刺の場合は、血管径の約3分の1の角度に斜め切開を行います。マイクロピンセットを使って切開部を優しく開き、プローブ挿入のための入口を作ります。
- プローブの先端を慎重に静脈に挿入し、3.5〜4.0cmの深さまでゆっくりと進め、先端が右心房の入口に達するようにします(図2L)。
- プローブを二重結びで近位シルクの結び目を締めて固定します。4-0ビクリル縫合糸で筋肉層を閉じ、その後、間中縫合で皮膚を縫合します。プローブの外側部分を皮膚表面に固定し、ずれを防ぎます。
4. サンプル採取とプローブ回収
- サンプル採取:組織透析とサンプルの採取チューブへの移送の関係性を評価します。プローブとコレクター間の総容量は20μLに保つこと。
- サンプルがプローブとチューブを通過し、チューブの端に到達して1 μL/minの流量で採取するまで20分間の時間を確保します。アッセイに必要な濃度を得るために十分な体積を集めてください。1本の採取チューブにつき30μLの透析液を採取してください。
- サンプル保存方法:0.5 mLのポリプロピレン採取管を4°Cまで予備冷却します。 採取後すぐにチューブにキャップをし、液体窒素で30秒間速凍し、2分以内に-80°Cの冷凍庫に移します。
- ベースラインサンプル:サンプル採取を開始する前に完全なサンプル平衡状態。麻酔下でラット1匹あたり3つのサンプルを採取し、安定した測定基準を確立します。
- プローブ除去:サンプル採取が完了したら、プローブを動物の頭部から取り出し、1%ナトリウムヘパリンを含む保存バイアルに入れます。過剰なイソフルランを吸入して動物を安楽死させてください。
- プローブ保存:プローブを生理食塩水で十分にすすいで、生理食塩水入りのバイアルに保存してください。微生物の増殖を防ぐために、注射器で生理食塩水でチューブを洗い流してください。プローブは十分な流量を維持し膜が無傷である場合にのみ再利用してください。
5. データ分析
- MetaboAnalyst 6.0を用いて主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)、および追加の統計解析を実施します。OPLS-DAを用いて、予測中の変数重要度(VIP)を決定してください。
- P値評価やフォールド変化分析などのノンパラメトリック検定を適用して、差異代謝物を調べます。差別代謝物スクリーニングの臨界閾値をVIP>1、FC≥2、またはFC≤0.5、P<0.05と設定します。
- KEGG化合物データベースを使って同定された代謝物に注釈を付けます。
6. HPLC - MS/MS
- 正イオンモードで動作する電気噴霧イオン化(ESI)源を備えたAB Sciex 6500+三重四重重磁質量分析計を用いて代謝物定量を行います。
- 計器のパラメータは以下の通りに設定されます:カーテンガス、40 psi;衝突ガス、10 psi;イオン源ガス1(GS1)、50 psi;イオン源ガス2(GS2)、55 psi;イオン噴霧電圧4500V;そして水源温度は550°Cです。
- システムを多重反応監視(MRM)モードで運用してください。各代謝物ごとに個別にMRM遷移、脱クラスタ化ポテンシャル、衝突エネルギーを最適化します。Analyst 1.7.1ソフトウェアでデータ取得を行い、MultiQuant 3.0.3で定量分析を行います。
- クロマトグラフィー分離には、C18カラム(2.1 × 100 mm、1.7 μm)を45°Cで維持します。 移動相は、水に0.1%の蟻酸、(B)アセトニトリルに0.1%の蟻酸として準備します。流量を0.35 mL/min、注入量を6 μLに設定します。分析前にオートサンプラーの温度を4°Cに保ちます。
注:本研究では、各ランの合計で約25分間行われました。
結果
データセットは総和および対数変換を適用して正規化され、その後包括的な統計解析が行われました。主成分分析(PCA)を実施し(図3A)、明確な分離と代謝の違いが明らかになりました。その後、直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)モデルが開発され、得られたスコアは 図3Bに示されており、このモデルの識別効果が示されました。AISFと血液サンプルを比較した618種類の代謝物の評価では、146種類の異なる代謝物が確認され、組織液ではダウンレギュレーションおよびアップレギュレーションの両方の代謝物が見られました(図3C)。さらに、上位50の差別代謝物の比較概要を提供するヒートマップが作成されました(図3D)。
サンプリング法の信頼性を評価するために、組織液成分と血液を表すセロトニンと乳酸を陽性対照として用いました。結果は 図4に示すように、これらの成分がさまざまな体液に分布している確立されたパターンと一致しています。 補足図1 は、-80°Cで保存されたマイクロ二成分酸アリコート中の乳酸およびセロトニンの安定性を示しています。
146種類の差分代謝物は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびその類似体に体系的に分類され、脂肪酸およびその誘導体;アミノ酸、ペプチドおよびその類似体;炭水化物および炭水化物共役脂肪酸;有機酸およびその誘導体;生物由来アミン;プリンおよびピリミジン;ビタミンやステロイド、その他の化合物も含まれます(図5A)。補足表1は血液中で検出される代謝物の違いを示しています。ヒートマップ解析は、生体アミンやアミノ酸、ペプチドおよびそれらの類似体のさまざまな体液における濃縮パターンをさらに明らかにします(図5B,C)。差異代謝物濃縮解析は図6に示されています。補足表2は、3つの連続した血管周囲組織液サンプルにおける15種類のランダムに選ばれた代謝物の変動係数(CV)を示しています。
図1:実験装置の画像。 (A) 冷蔵分画集熱器。(B)シリンジポンプ。(C)マイクロシリンジ。(D)血管用ハサミやピンセットなどの外科器具。(E)麻酔装置。(F)微小透析プローブ。(G)微細透析プローブ、組織ガイドニード、そして破れやすいチューブ。(H) 組織ガイド針の組み立て。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:研究の主要なステップ。 (A) 手術部位の位置とプローブの向きを示す図示図。(b) プローブ設置部位の正確な観察を確保するために、重要な血管接合部の特定。(C) ガイドニードルの挿入が皮膚を貫通し、組織空間に進むこと。(D) ガイドピン針の引き込みを抜き、破れやすい管が組織内に残る。(E) マイクロ透析プローブは確立されたチャネル を通じて 組織内に導入されます。(F)破れやすいチューブを優しく引き戻す。プローブを固定した後、破れやすいチューブを優しく引き戻します。(G) 大腿動脈および静脈血管の上皮に位置するプローブの可視化。(H) 頸静脈からの組織分離。(I) プローブを頸静脈に置くこと。(J) 微小透析プローブは皮膚表面に固定されています。(K) 頸静脈の分離。(L)プローブを頸静脈に挿入。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:間質性液体(ISF)と血液の多変量統計解析。 (A) データは大幅な分離を強調するために縮小されており、ISFと血液成分の間に明確な違いがあることが示されています。(B)直交部分最小二乗判別解析(OPLS-DA)モデルのスコアは、それぞれR2YとQ2の値が0.925と0.811を示しています。(C) 火山プロットには146種類の差代謝物が描かれており、そのうち85種がISFでダウンレギュレーションされ、61種が上位調整されています。(D) これに対応して、ISFと血液中の上位30の代謝物を比較したヒートマップでは、両成分の明確な区別が明らかになります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:一連のボックスプロットの提示により、ISFおよび血液中の乳酸およびセロトニンの濃縮レベルが明らかにされました。 すべてのデータポイントはSEM±平均を表しています。すべての量的パネルに対して誤差バーが表示されます。パネル(A)は、ISFサンプルが血液サンプルに比べて乳酸の濃縮が有意に大きいことを示しています。対照的に、パネル(B)は血液サンプルでセロトニンがより濃縮され、同時に乳酸レベルが低いことを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図5:差異代謝物の分類環チャートと、アミノ酸、ペプチド、類似体、さらに生物由来アミンのヒートマップが示されています。 (A) 各色ブロックは異なる代謝物クラスに対応しています。アミノ酸、ペプチドおよび類似体が最大のカテゴリーを占め、全体の19.29%を占め、次いでヌクレオシド、ヌクレオチドおよび類似体(15%)、脂肪酸および誘導体(12.86%)、炭水化物および炭水化物共役物(7.86%)、有機酸および誘導体(10%)、生原性アミン(7.14%)、プリン/ピリミジン(5.71%)、ビタミンおよびステロイド(8.57%)、およびインドール、アゼピン、ピリジン、ベンゼンなどの他の化合物が13.57%を占めています。(B)間質液(ISF)において、デオキシカルニチンやスペルミジンなどの生物由来アミンの濃縮レベルは血液中に比べて有意に高い一方で、セロトニン(D4)、セロトニン、トリプタミンおよび関連化合物のレベルは有意に低下しています。(C) ISFでは、アミノ酸、ペプチド、類似体に関連する代謝物の大部分が血液中の代謝物よりも著しく低いです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図6:正常間質液の代謝物セット濃縮解析(MSEA)により、代謝活動は主にエネルギー産生、酸化還元恒常性、アミノ酸ターンオーバーに関連する経路に分布していることが示されました。 主な濃縮経路には、生理的条件下でミトコンドリアのエネルギー供給と抗酸化能力の維持を反映したブタノエート代謝、プリン代謝、グルタチオン代謝が含まれます。さらに、アルギニンやプロリン代謝、トリプトファン代謝、システインおよびメチオニン代謝など複数のアミノ酸関連経路が示されており、細胞外微小環境における活発なアミノ酸変換および窒素バランス調節が示唆されています。これらの発見は、正常な間質代謝が生体エネルギープロセス、酸化防御、アミノ酸代謝の間で動的な均衡を維持し、組織の恒常性と微小循環安定性を支えていることを示唆しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
補足図1:-80°Cで保存された微量二成分アリコート中の乳酸およびセロトニンの安定性。 データはSEM±平均(n=6回の重複)です。72時間以内に基準値から>5%逸脱した分析物はいません。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足表1:血液および人工間質液微量二分析液中の差異代謝物。 これには代謝物名、フォールド変化(FC)、学生のt検定P値、VIP(OPLS-DA)が含まれます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
補足表2:3つの連続した血管周囲組織液サンプルにおける15種類のランダム選択代謝物の変動係数(CV)。 すべての履歴書は<20%です。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
間質液(ISF)は、すべての組織細胞を包み込む水性微小環境であり、細胞外液体区画8,9の約75%を占めます。血漿の毛細血管ろ過によって生成されるISFは、血液の細胞および高タンパク含有量はないものの、電解質、小溶質、水を保持しています。この構成はISFを血管界と細胞界の重要なインターフェースとして位置づけています。機能的には、ISFは動的な輸送媒体です。酸素、グルコース、アミノ酸、微量栄養素を血流から細胞へ運び、同時に二酸化炭素、尿素、その他の代謝廃棄物を循環に戻すために集めます10。この流体は潤滑剤および緩衝材としても機能し、間質浸透圧、pH、イオンバランスを安定化させます。代謝を超えて、ISFは白血球、抗体、サイトカインを組織空間内で輸送し、ホルモンや副分泌信号の通信の橋として機能します(12,13)。血液と比べて、ISFは本質的に細胞フリーで低タンパクのろ過液です。血管樹に限定された血液には赤血球や白血小板、そして高濃度のアルブミンや凝固因子が含まれています。酸素と栄養素のレベルは血液中で最も高く、ISFでは細胞の取り込みにより徐々に低下しますが、老廃物はリンパや静脈の逆流に入る前にISFに蓄積されます10。正常なISFに大きなタンパク質や細胞が存在しないため、がん圧が最小化され急速な拡散が可能となりますが、炎症状態によって一時的にこのプロファイルが変化することもあります15。
しかし、ISFの研究は、単純で迅速かつ信頼性の高いサンプリング手法が不足しているため、依然として限られています。現在の方法には、マイクロニードル(MN)パッチ、吸引水ぶくれ、逆イオントフォレシス、熱焼灼、微細透析などがあります。MNパッチは皮膚を通じてISF抽出のためのマイクロチャネルを作り、コアシェル型は30秒以内に、浸透圧ハイドロゲルMNは約3分で抽出します。これらはセンサーと組み合わせてオンパッチ分析を行うことができますが、体積に制限があり、強度と膨張のバランスが必要です。吸引ブリスターは純粋なISFを提供し、血液汚染を最小限に抑えますが、侵襲的で痛みを伴い、遅い16,17,18です。逆イオントフォレシス(RI)は、低電流を利用してグルコースやリチウムイオンなどの荷電分析物を皮膚表面に運び、非侵襲的なモニタリングを行います。しかし、スループットの低さ、個体ごとのばらつき、皮膚刺激の可能性などの課題に直面しています。経皮投与(TA)は局所的な加熱で角質層を破壊し、ISFが受動的に親水性マイクロチャネルに侵入できるようにします。装置設計はよりシンプルですが、収集量は5μL未満であり、燃焼を避けるために非常に高感度な検出と慎重な熱管理が必要です21,22。これに対し、マイクロ透析(MD)は、埋め込みされた半透性プローブ間の拡散に依存し、グルコース10 kDa、タンパク質やサイトカイン100 kDaなどの可変分子量カットオフ(MWCO)膜を通じて独自の分子選択性を提供します23,24。この技術は連続的かつ低侵襲的なサンプリングをサポートします。しかし、MDは運用上複雑で、in vivoでの校正が必要であり、疎水性種の回復率にも変動があります。特筆すべきは、MDが大型生体分子のサイズ選択分離が可能な唯一の技術であることです。血管性心室炎に隣接して採取した透析液と血液の比較研究では、乳酸およびセロトニンプロファイルが明確に示され、MDアプローチの安定性と特異性が検証されました。
動物実験では、心臓と肺の相乗的に調節されるISFが大きな動脈、静脈、末梢神経に関連する心肺に流れることが示されています5,9。通常、ISFには血漿から直接由来する代謝物や、組織内で局所的に合成される代謝物が含まれています。したがって、AISFと血漿における代謝物の重複や差異は、血管系内の栄養素や代謝物の輸送および除去にISFの循環系が関与していることを示していると考えられます。ここで導入されたAISFサンプリングに導入された微小透析技術は、全身の複数の臓器や組織における代謝調節における全身性ISF循環の研究を大幅に向上させるでしょう。
本研究で使用された20 kDa分子量カットオフ(MWCO)膜は、グルコース、乳酸、ピルビン酸、アミノ酸などの小さな代謝物の定量的回収に最適です。しかし、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、細胞外酵素など、生物学的に重要な多くの高分子を一貫して過小サンプル化または完全に除外しています。臨床および方法論的レビューでは、標準的な20 kDaカテーテルは小さな親水性代謝物の収集に効果的である一方で、タンパク質や炎症性メディエーターの回復率は低いことが強調されています(29)。したがって、正確なサイトカイン定量には、より高いMWCO(例:100 kDa)を持つ膜や代替のサンプリング戦略が必要です。30,31。したがって、当グループの今後の研究では、より大きなMWCOを持つ膜を用いて末梢間質液の高分子組成を特徴付ける予定です。本研究では、透析液を全身麻酔下で採取しました。マイクロダイアlysisは以前にも覚醒状態で自由に動く動物で検証されており、いくつかの「オープンフロー」マイクロパーフュージョン技術が意識モデルに応用されています32。しかし、覚醒動物にプローブ設計と移植プロトコルを適応させるには、テザーリング、動物ストレス、プローブの安定性、運動アーティファクト、長期的な開通に関する課題に取り組む必要があります。現在、軽量なテザースイベルシステムの開発中であり、次の研究では意識的なサンプリングを行う予定です。
開示事項
開示すべき金銭的利益相反はありません。
謝辞
この研究は、中国国家重点研究開発プログラム(2025YFC3507601)および中央公共福祉研究機関基礎研究基金(番号)によって資金提供されました。ZZ-YC2023007)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 心電図モニタリングシステム | AD Instruments、オーストラリア | パワーラボ | 装備 |
| 鉗子 | F.S.T(ファインサイエンスツールズ)ドイツ | 11252-00 | 外科用器具 |
| ヘパリンナトリウム | シグマ・オルドリッチ、アメリカ | 9041-08-1 | 素材 |
| 高性能液体クロマトグラフィータンデム質量分析計(HPLC-MS/MS) | SCIEX、アメリカ | エクシオンLC-20AC | 装備 |
| IRIS標準はさみ | F.S.T(ファインサイエンスツールズ)ドイツ | 14060-09 | 外科用器具 |
| イソフルラン | RWDライフサイエンス、PRC | R510-22-10 | 素材 |
| 低流量麻酔システム | ケント・サイエンティフィック、アメリカ | ソムノスイート | 装備 |
| 微小透析灌流液T1 | CMAマイクロダイアライシス、スウェーデン | P000034 | 素材 |
| マイクロダイアライシスプローブ、20エリート | CMAマイクロダイアライシス、スウェーデン | 8010436 | 素材 |
| マイクロダイアリシスシリンジ 1 mL ガス密閉 | CMAマイクロダイアライシス、スウェーデン | 8309020 | 素材 |
| 冷蔵分画集熱器 | CMAマイクロダイアライシス、スウェーデン | 470 | 装備 |
| CMA 20プローブ用のスプリットチュービング | CMAマイクロダイアライシス、スウェーデン | 8309019 | 素材 |
| 立体顕微鏡 | オリンパス、日本 | SZ61 | 装備 |
| シリンジポンプ | CMA MD AB、スウェーデン | 800310 | 装備 |
参考文献
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