このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

研究記事

ハーブ浣腸剤は、S100β/RAGE/NF-κB経路 を通じて 腸グリアの活性化を阻害することで潰瘍性大腸炎を緩和します

563 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/69571

⸱

2025年11月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

Sanguisorba officinalis、Bletilla striata、Acacia catechuを組み合わせたハーブ浣腸処方を、LC-MS/MSプロファイリング、S100βドッキング、DSS大腸炎モデル、LPS/IFN-γ活性化腸グリアを用いて評価しました。この式はS100βを作用させ、グリア活性化を抑制し、p-NF-κB/iNOS発現を減少させ、S100β-RAGE-NF-κB軸による改善を示しました。

要約

腸内膠細胞(EGC)の活性化は潰瘍性大腸炎(UC)の病因に寄与します。本研究では、 Sanguisorba officinalis、 Bletilla striata、Acacia catechuを組み合わせたハーブ浣腸であるDibai浣腸液(DBE)が、EGC駆動の炎症を調節するかどうかを検証しました。DBE成分および優先化合物のLC-MS/MSプロファイルをS100βにドッキングしました。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性マウス大腸炎において、体重、結腸長、組織病理学、サイトカインレベル(ELISA)を用いて有効性が評価されました。グリア活性化マーカーは免疫組織化学、免疫蛍光共局在、定量PCR(qPCR)、および免疫ブロッティングによって測定されました。in vitro モデルでは、リポ多糖とインターフェロンγで活性化したCRL-2690腸グリアを使用し、介入としてDBE含有ラット血清(15%)を用いた。ドッキングにより、いくつかのDBE成分がS100βに強く結合することが予測されていました。DSSはTNF-αおよびIL-1βを増加させ、密接合部を破壊し、mRNAおよびタンパク質レベルでS100β/GFAPを上昇させ、グリアの過剰活性化と一致しました。DBEはこれらの変更を大幅に覆しました。 in vitroでは、DBEがS100β、RAGE、iNOS(NOS2)、およびNF-κB p65リン酸化を還元しました。総合的に見ると、DBEはEGC活性化を阻害し、S100β/RAGE/NF-κB/iNOS軸をダウンレギュレートすることでUCを緩和し、粘膜の完全性を維持すると考えられています。

概要

潰瘍性大腸炎(UC)は炎症性腸疾患(IBD)の主要なサブタイプであり、大腸の慢性粘膜炎症を特徴とし、1990年以降世界的な負担が増加しています。UCはIBD症例のかなりの割合を占めています。典型的な症状には腹痛や血便が含まれ、身体的・精神的苦痛と多額の治療費を伴います。治療の選択肢は拡大していますが、免疫調節薬や全身免疫を抑制する生物学的製剤への長期曝露はリンパ腫や日和見感染症のリスク増加と関連しており、患者の一部は不耐性または不耐症のまま残っています。潰瘍性大腸炎は、粘膜免疫恒常性の破壊が病態生理の中心となる免疫介在疾患として広く認識されています。しかし、蓄積される証拠は粘膜免疫機構だけではIBDのすべての特徴を説明するには不十分であることを示しています。腸神経系(ENS)は腸の炎症に寄与し、IBD6における神経炎症という概念を拡張しています。

腸グリア細胞(EGC)は成体哺乳類の腸内ニューロンよりも多いため、腸の恒常性と炎症の主要な調節因子として認識されています7,8。EGCはGDNF、TGF-β1、S100β、15d-PGJ2などのメディエーターを放出することで上皮バリア機能を調節し、透過性や粘膜の完全性に影響を与えます。これらのメディエーターの中で、S100βはRAGE/NF-κB経路を含む下流カスケードを活性化し、バリア損傷や炎症増幅を引き起こすことがある10,11。EGCはまた、コネキシン-43およびM-CSFを介してマクロファージ表現型や内臓感受性を調節し、試験管内でT細胞に抑制作用を及ぼすことで免疫応答を形成し、UCにおけるEGC活性化を治療対象として強調しています。12,13。

伝統中国医学(TCM)はUCでますます研究されており、臨床および実験の場で有望な効果を示している(14,15)。古典的な組み合わせであるSanguisorba officinalis(Diyu)とBletilla striata(白極)、そしてAcacia catechu(二合)は、長らく薬本で赤痢疾患として記録されており、止血、鎮痛、創傷治癒の適応として中国薬典にも記載されています。現代の研究では、これらの植物性成分が抗菌、抗炎症、抗酸化、抗潰瘍の活性を報告しており、A. catechuは神経保護効果も示しており、カテキンが主要な成分であることも示されています16,17。従来の全身免疫抑制と比較して、EGC中心の神経免疫経路を関与させる製剤は、独自のメカニズムを持つ補完的な有効性を提供し、潜在的に全身免疫関連リスクを低減する可能性があります(18,19)。

本研究は、地油、白極、二茶(DBE)の複合製剤が、EGC活性化を抑制することで潰瘍性結腸炎を軽減するかどうかを評価する。統合的アプローチが用いられます:成分の優先順位付けのための非標的LC-MS/MSプロファイリング、S100βに対する分子ドッキング、デキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎モデルでの検証、EGCsにおける機構的アッセイ。本研究は、過去のUC治療で探求されてきたS100β/RAGE/NF-κB/iNOSなしの神経免疫機構を強調し、用量選択、製剤最適化、その後のトランスレーショナル研究における実践的な示唆を示しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての動物処置は北京中医薬大学動物倫理委員会[BUCM-2023-0912]により承認され、実験動物のケアおよび利用に関する機関および国家のガイドラインに従って実施されました。被験者は関与していません。
試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 試薬と材料

分析用溶媒と分子生物学用試薬が全て使用されました。製造元、カタログ番号、ソフトウェアライセンス詳細を含むすべての商用情報は、材料表(xlsx)に記載されています。すべての調製水は脱イオン処理され、ろ過されました。すべてのバッファーは、以下に指定された条件下で新鮮に準備されるか、保管されました。

2. 機器およびソフトウェアの設定

四重極飛行時間質量分析計と結合したUPLC-MS/MSシステム、スイングバケットローターを備えた冷蔵遠心分離機、CO₂インキュベーターは37°C、CO₂5%、相対湿度≥95%に維持されています。マイクロプレートリーダー(450nm)、リアルタイムPCRサーモサイクル装置、電気泳動およびブロッティング装置;また、固定励起・発光フィルターを備えた蛍光顕微鏡が使用されました。計測機器制御とデータ解析は、クロマトグラフィーおよび質量分析データ用にMassLynx v4.2で、ドッキング用にはAutoDock 4.2とAutoDockTools 1.5.7で実施されました。画像解析はImageJ/Fiji v1.53で実施されました。

3. ディバイ浣腸液(DBE)の調製

地油(50g)、白極(50g)、二茶(20g)からなるハーブ混合物は、粗く砕かれ、室温で1,200mLの脱イオン水に30分間浸され、完全な水分補給を確保しました。浸した混合物は30分間強く沸騰させ、時折かき混ぜて粘着を防ぎました。熱い煮込み薬は無菌の多層医療用ガーゼを通して無菌ガラス器具に浸透し、不溶性物質を除去しました。ろ過液は45°Cを超えない水浴で真空濃縮され、最終的なストック濃度1.98 g/mL(高用量ストック)に相当する濃縮液が得られました。中低用量の作動溶液(0.99 g/mLおよび0.50 g/mL)を無菌脱イオン水で希釈し、それぞれ100 mLの最終体積に準備しました。各溶液は0.22μmの膜を無菌条件下で通過し、標識付き滅菌容器に分散され、4°Cで最大7日間保存されました。使用前に溶液を優しく混ぜ、許容できる外観は透明からやや乳白色で、目に見える粒子はありませんでした。

4. UPLC - DBEのMS/MS分析

各医薬品成分の粉末は50mgで正確に計量され、80%(v/v)メタノール1.0mLを常温で超音波攪拌で30分間抽出しました。抽出物は超音波処理後に室温に戻され、15,000 × g で4°Cで10分間遠心分離され、上清液は0.22μmの膜を通してオートサンプラーバイアルにろ過されました。クロマトグラフィー分離は、逆位相カラム(2.1× 100 mm、1.8 μm;極末端C18型)で35°Cで実施されました。列、ブランド/モデル、カタログ番号は材料表に記載されています。移動相A:水中の0.1%の蟻酸;移動相B:アセトニトリル。流量:0.30 mL/min;注入量:10 μL。勾配:0-2分間は5% B;2〜20分は5→95%のB;20〜23分間は95%のB;23分→23.1分のBは955%;5%Bで26分まで再平衡させます(完全な勾配表は 表1に記載)。

質量分析法は、正負スイッチングを用いた電気噴霧イオン化と、低エネルギーおよび高エネルギー(MSE)スキャンによるデータ非依存性取得を用いていました。質量範囲:m/z 100-1,500;毛細管電圧:2.0 kV;サンプリングコーン:20V;水源温度:120°C;溶け温度:360°C;コーンガス:50 L/h;溶剤ガス:600 L/h。高エネルギー関数は20〜50 eVの段階的衝突エネルギーを用いていました。データはMassLynx v4.2で処理され、ロック質量補正と標準的なピーク検出パラメータが適用されました。補 足表1には、105の特定成分(分子式、観察されるm/z、保持時間、信頼度スコア)が包括的に示されています。

5. 分子ドッキング

ドッキングはAutoDock 4.2で誘導フィットプロトコルのもとで実施されました。S100β(PDB 3HCM)の三次元構造は、結晶学的な水分子を除去し、極性水素を加え、コールマン電荷を割り当てることで準備されました。特徴的なDBE成分を表す配位子構造が構築され、生理的pHでプロトン化され、エネルギーが最小化されました。結合部位はネイティブ-リガンド座標によって定義されました。ネイティブリガンドから6 Å以内のアミノ酸残基はドッキング時に柔軟として扱われました。グリッドボックスはポケット全体を囲み、グリッド間隔は0.375 Åでした。ラマルク遺伝学アルゴリズムのパラメータは以下の通りです:集団サイズ150;最大2.5×10⁶のエネルギー評価;1リガンドあたり100回の独立ラン。最終ポーズは予測結合自由エネルギーでランク付けされ、RMSDでクラスタリングされました。相互作用パターン(水素結合、疎水性接触、π π相互作用)は既知のS100β錯体との整合性を可視化しました。

6. DSS誘発性大腸炎およびDBE治療の動物モデル

オスのC57BL/6Jマウス(8週、20-22g)は、22°C±相対湿度50%〜60%、12時間の明暗サイクルで少なくとも7日間、食事と水を自由に与えた環境で慣れさせました。動物は6つのグループ(n=10/グループ)に無作為に割り当てられました:対照群、デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)モデル、スルファサラジン(SASP)陽性対照群、低用量・中用量・高用量のDBE治療。組織学的スコアリングおよび画像の定量化を担当する職員は、グループ割り当てに関しては盲目化されていました。

実験的な大腸炎は、7日間飲用水中の2.0%(w/v)DSS、その後3日間1.0%DSS、さらに4日間通常の水で安楽死を誘発しました。DBEは1日1回、直腸に2.5cm挿入されたフレキシブルカテーテルを用いて浣腸で10 mL/kg投与されました。動物は漏れを最小限に抑えるために30分間垂直に保持されました。1日あたりのDBE投与量は、低・中・高群でそれぞれ12.35、27.4、49.4 g/kg/日でした。SASPは陽性対照として0.5 g/kg/日で投与されました。体重、便の濃度、便の潜血を毎日記録し、疾患活動指数を算出しました。エンドポイントでは、マウスにペントバルビタールナトリウム50 mg/kgで麻酔を投与しました。ヘパリン化された毛細血管を用いて後眼窩洞から血液を採取しました。動物は子宮頸部脱臼によって安楽死されました。大腸は回盲部から直腸まで切除され、優しく伸ばされ、最小限の緊張で長さを測定しました。代表的な区間は4%のパラホルムアルデヒドに固定され、残った組織は液体窒素で速凍され、−80°Cで保存されました。

7. 薬物含有血清の調製

オスのスプラグ・ドーリーラットは対照群とDBE群に無作為に分けられました(n=6/群)。DBE群は経口ガベージで1日1回、7日間1日12.34g/kgを投与しました。対照群には同等量の精製水が投与されました。最終投与から24時間後、動物は麻酔され、腹部大動脈から全血が採取されました。血清は室温で30分間凝固し、その後1,500 × g で4°Cで10分間遠心分離しました。 血清は56°Cで30分間熱不活化され、0.22μmの膜を無菌状態でろ過した後、保存されました。血清は無菌チューブに分割され、−80°Cで保存されました。 吸収率が414nm付近で高かった溶血サンプルは除外されました。

8. 組織学的検査(H&E)

4%パラホルマルデヒドに24時間固定された大腸組織を、段階エタノールで脱水し、キシレンで除去し、パラフィンに埋め込まれました。5μmの断片を切断し、脱硫、再水和、ヘマトキシリンで5分間染色、流水で5分間青色化し、2分間エオシンでカウンターステインしました。スライドは樹脂でマウントされ、下穴構造、ゴブレット細胞密度、上皮の連続性、炎症浸潤の検査を行いました。代表的な変更は矢印や矢じりで示され、図の引文で定義されます。スケールバー(例:200μm)やあらかじめ定義された視覚閾値は凡例で指定されます。

9. 免疫組織化学(IHC)

パラフィン切片は、95〜98°Cでシエン酸バッファー(pH6.0)で抗原回収を15〜20分間行い、内因性過酸化物酵素を3%過酸化水素で10分間焼き入れ、室温で5%正常血清で1時間ブロッキングしました。一次抗体は加湿チャンバーで4°Cの一晩培養されました。洗浄後、断片はDABで2分間現像(顕微鏡モニタリング)を用いてストレプタビジン-ペルオキシダーゼ検出システムで処理され、ヘマトキシリンでカウンターステインされ、脱水されてマウントされました。一次抗体を欠く陰性対照群も各バッチに含めました。

10. 免疫蛍光(IF)解析

パラフィン埋め込み切片は脱パラフィン化され、EDTAバッファー(pH 8.0)で抗原回収を受けました。冷却後、室温で3%牛血清アルブミンで1時間非特異結合を遮断しました。切片は4°CでGFAP(1:500)およびS100β(1:200)に対する一次抗体と共に一晩インキュベートされ、その後、フルオロフォア結合二次抗体(1:500)を室温暗闇で1時間投与しました。核はDAPIでカウンターステインされ、スライドはフェード防止媒体に装着されました。画像は同一の対物レンズ、100msの固定露光時間、グループ間で検出器ゲイン1.0を用いて撮影されました。平均蛍光強度は、ImageJ/Fiji v1.53でピクセルサイズの校正、背景引き算(ローリングボール半径50ピクセル)、およびDAPI正領域への正規化後に定量化されました。各グループあたり少なくとも5つの生物学的複製と、重複しない3つのフィールドが分析されました。

11. 細胞培養と処理

ラットの腸内グリア細胞(コードコードCRL-2690)は、5%CO₂を含む加湿インキュベーターで、胎児用牛血清10%とペニシリン-ストレプトマイシン1%を37°CでDMEMで培養しました。細胞同様は短時間連続反復プロファイリングによって確認され、培養はマイコプラズマを含まなかった。実験は5番から15番の箇所で行われました。細胞は2.0 mL/ウェル培地で6ウェルプレートにシードされ×10⁵ 10⁵ cellを2.0 mL/ウェル培地で24時間付着させました。実験群は、未処理対照群、車両対照群、モデル群、DBE血清群、阻害剤群でした。

モデル誘導では、細胞をリポ多糖(LPS、1 μg/mL)とIFN-γ(20 ng/mL)を完全培地で24時間曝露しました。IFN-γの対応するU/mL値は、ロット特比効力に基づき材料 表 に報告されています。DBE血清処理では、細胞に対して15%(v/v)熱不活化(56°C、30分)、0.22μmろ過DBE含有ラット血清を完全培地で24時間投与しました(用量範囲はCCK-8節で指定された生存可能性最適化のため5%-20%が使用)。阻害剤治療には、選択的S100β阻害剤SBI-4211(10-50μM、キー読み取りに45μM)を24時間使用しました。車両制御装置は、溶媒含有量(0.1% DMSO(v/v))を同一の媒体と一致させました。特に記載がない限り、処理は予備加熱(37°C)培地で調製され、置換前に細胞はPBSで2×洗浄されました。治療後、細胞はRNA抽出、タンパク質解析、免疫蛍光検査のために採取され、その後のセクションで詳細に述べられました。生物学的複製は、各疾患ごとにn個の独立培養≥5個でした。

12. CCK-8細胞生存能力アッセイ

細胞は100μL培地で5個×10³セル/ウェルの96ウェルプレートにシードされ、一晩密着させました。培地はDBE処理済み血清を含む培地に置き換えられ、5%、10%、15%、または20%(v/v)で24時間保持されました。CCK-8試薬(10μL/ウェル)を追加し、プレートを37°Cで1時間インキュベートしました。 吸収は450nmで、ブランク引き算(培地+試薬、細胞なし)で読み取りました。実現可能性は車両制御の割合で表されていました。各条件はn、≥5の生物学的複製(独立培養)を使用し、各培養ごとに3つの技術的複製が行われました。

13. 組織サイトカインに対するELISA

大腸組織はプロテアーゼ阻害剤を含むPBS(1:9、w/v)で氷上で均質化されました。均質酸塩は12,000 × g で4°Cで10分間精製されました。上清液はキットプロトコルに従ってIL-1βおよびTNF-αのアッセイを行いました。標準と試料は重複して実行され、曲線にはR²≥0.99の4パラメータロジスティック(4PL)モデルが適用されました。逆算基準は公称水準の85%〜115%以内に受け入れられました。吸収は450 nmで読み取り、利用可能な場合は620〜650 nmの基準を用いていました。サイトカイン濃度は組織重量(pg/mg組織)に正規化されました。各グループには5つの生物学的複製≥含まれていました。

14. 定量的リアルタイムPCR(qPCR)

大腸組織(または該当する細胞)からの総RNAは、シリカ膜スピンカラムキットで単離されました。RNAの完全性はA₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.1およびアガロース-ゲル検査で検証されました。第一鎖cDNAはゲノムDNA除去により1μg RNAから合成されました。qPCRは校正済みのサーモサイクラーでSYBRグリーンマスターミックスを使用し、プログラムは95°C30秒、95°Cの5秒、60°C30秒の40サイクル;溶融曲線は65〜95°C、0.5°C/5秒のステップで変化します。GAPDHは内因性対照群として機能しました。プライマー効率(標準曲線斜面から90%-110%)を確認した後、相対発現は2⁻ΔΔCtで計算されました。ノーRTおよびノーテンプレートコントロールも含まれていました。プライマー配列は 表2に記載されています。各グループは1サンプルあたり5回の生物学的複製と2回の技術的重複≥を持ちました。

15. ウェスタンブロット解析

大腸組織(または細胞)からタンパク質をプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を用いたRIPAバッファーで抽出し、BCAアッセイで定量しました。等量のタンパク質(30 μg/レーン)を変性させ、4〜20%勾配のSDS-PAGEで分解し、PVDF(0.45 μm;≤ 20 kDaターゲットは0.2 μm)に転移しました。膜は5%脱脂肪乳で室温で2時間ブロックし、GFAP(1:1,000)、S100β(1:1,000)、iNOS(1:1,000)、NF-κB p65(1:1,000)、リン-NF-κB p65(Ser536、1:1,000)、オクルジン(1:1,000)、クラウディン-1(1:1,000)、GAPDH(1:5,000)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩培養しました。HRP結合二次抗体(1:5,000)を室温で1時間適用しました。信号はECLで開発されました。露光時間は線形ダイナミックレンジ(10〜90秒)に制限されていました。移植はブロッキング前に可逆膜染色によって確認されました。バンド強度は背景差し引きの後にImageJ/Fiji v1.53で定量化され、GAPDHに正規化されました。予想分子量:GFAP ~49 kDa、S100β ~10-12 kDa、NF-κB p65 ~65 kDa、iNOS ~130 kDa、オクルジン ~65 kDa、クラウディン-1 ~22 kDa、GAPDH ~36-37 kDa。各解析には5回≥生物学的複製が含まれていました。

16. 統計分析

データはGraphPad Prism 8.0で解析され、SEMの平均±として提示されています。複数群比較では、一方向ANOVAの後にTukeyの事後検定を用い、ペアワイズ比較では、適切な場合に非ペアの二尾Student氏t検定を適用しました。時間経過設計や二因子設計(例:投与量治療や時間××治療)では、図の凡例に指定されたように、Tukey補正またはダネット補正を用いた2方向ANOVA(該当する場合の繰り返し測定)が用いられました。Shapiro-WilkとLeveneの検定は、パラメトリック検定の前に正規性と等方差性を調べるために用いられました。仮定が破られた場合は、データをログ変換または適切な非パラメータ的検定(Kruskal-Wallisによるダンのポストホックによる分析)、ペアワイズのためのマン・ホイットニー大学)。正確なp値および効果サイズの測定値(ANOVAはη²、t検定はコーエンのd)は、該当する場合は図の凡庸で報告されています。両側p<0.05は統計的に有意とされました。 図の凡例は 以下の意味表記を用いています:*p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Control;# p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS;特に重要ではありません。

17. 期待結果と品質管理

DSSは結腸の長さを短縮し、病変活動指数を上昇させ、組織学的損傷(クリプト構造の歪み、ゴブレット細胞の枯渇、上皮侵食)を引き起こすと予想されます。DBE治療は用量依存的にこれらの指標を改善し、腸グリア活性化マーカーを低減させるべきです。ウェスタンブロットでは上記の分子量帯が示され、DSSのシグナルが増加し、DBEまたはSBI-4211では減衰が見られます。露出は線形ダイナミックレンジ内に収めるべきです。GFAPおよびS100βの免疫蛍光はDSSの平均強度が上昇し、DBE治療後に減少を示すはずです。LC-MS/MSクロマトグラムは、基準イオンに対して安定した保持時間(ドリフト≤0.2分)と質量精度を5ppm以±内で示し、主要成分には特徴的な断片イオンを示す必要があります。陰性対照(例:一次抗体の省略)では特異的なシグナルは得られません。有効な定量比較を可能にするために、画像取得パラメータ(対物レンズ、露出、ゲイン、ガンマ)はグループ間で固定されなければなりません。

18. トラブルシューティングノート

DBE溶液中の濁度や粒子状物は、十分なろ過や降水不足を示し、0.22μmのろ過を繰り返し、pH6.5-7.5を確認しました。DSS曝露中の過剰な死亡率や重度の体重減少は過剰誘発を示唆します。DSS濃度を下げ、バッチ分子量を検証し、DSS溶液を毎日交換します。免疫蛍光定量の不一致は通常、曝露の変動を反映しています。露光時間とゲインを固定し、バッチキャリブレーション用のリファレンススライドを同梱します。弱いウエスタンブロットバンドは、荷重不足や伝達効率の低下を反映している可能性があります。タンパク質定量の確認、適切なゲルの割合または勾配の選択、可逆膜染色による転移の確認。ELISA適合度が悪い(R²<0.99または標準的な逆算が85〜115%を超えた場合は、標準曲線の繰り返しと希釈されたサンプルの再評価が必要です。qPCRランでプライマー効率が90-110%を超える場合は、分析前にアニーリング温度またはプライマー濃度を再最適化してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

DBE成分および薬物含有血清の同定

LC-MS/MSはDBEで105種類の独自の化学成分を特定し、質量誤差<10 ppmでした。分子式、同位体パターン、断片一致によって同定が確認されました。主要なクラスには、トリテルペン、フラボノイド、ビフェナントレン、有機酸が含まれていました。薬物含有血清は、ブランク減算後に59のDBE由来成分を明らかにしました。代表的なTICは図1A、Bに示されており、完全な注釈(名前、式、観測されたm/z、保持時間、誤差、主要断片)は補足表1に示されています。シナミン酸、フィシオン、ハイパーロシド、3,4-ジヒドロキシベンゾイン酸、トーメント酸の5つの生物活性化合物がドッキングおよびメカニズム解析に優先的に割り当てられました20...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

潰瘍性大腸炎(UC)は、多因子による病因を持つ慢性炎症性腸疾患です。免疫反応の調節障害に加え、腸上皮関壁機能障害や腸内細菌叢の不全がよく知られている要因であり、腸神経系(ENS)の異常が潰瘍性大腸炎の進行の主要な要因としてますます特定されています。具体的には、ENSの構造的および機能的調節障害は粘膜炎症や疾患の重症度を悪化させる可能性があります。さらに、前臨床研究では腸内グリア細胞(EGC)の活性化を抑制することで、潰瘍性結腸炎モデルにおける腸の炎症や不安様行動が減少することが示されています25。これらの発見は、EGC活性化がUCの発症の重要な要因であることを示しています。

本研究は、神経精神疾患のバイオマーカーであり、EGC駆動病理における炎症促進メディエーターとして機能するカルシウム結合タンパク質S100β

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は、国家伝統医学管理局の高級重点医学分野建設プロジェクト(ZYYSZX-2023256)の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オートドック 4.2分子ドッキングソフトウェア-スクリップス研究所
デクトレン硫酸ナトリウム(DSS)マウスの大腸炎誘発化学薬品9011-18-1シグマ・オルドリッチ
ディバイ浣腸液(DBE)潰瘍性大腸炎治療のためのハーブ混合物-北京中医薬大学
DMEM(ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム)細胞培養培地11965-092サーモ・フィッシャー
胎児用牛血清(FBS)細胞培養のための補遺16000-044サーモ・フィッシャー
蛍光顕微鏡免疫蛍光画像装置-オリンポス
LC-MS/MSシステムLC-MS分析用の質量分析計-ウォーターズ・コーポレーション
リポポリサカリド(LPS)細胞培養における炎症誘導因子L2630シグマ・オルドリッチ
PCRサーマルサイクラーqPCR用の機器T100バイオ・ラッド
一次抗体(S100)S100タンパク質検出のための抗体ABC1234アブカム
プロテインアッセイキット(BCA)タンパク質定量キット23225サーモ・フィッシャー
組換えインターフェロン(IFN)細胞培養におけるエグロ細胞活性化のためのサイトカイン-シグマ・オルドリッチ
二次抗体(HRP結合抗体)免疫組織化学のための二次抗体XYZ5678サーモ・フィッシャー
スルファザラジン(SASP)潰瘍性大腸炎のポジティブコントロール-シグマ・オルドリッチ
ウェスタンブロット機器タンパク質解析のための電気泳動システム-バイオ・ラッド

参考文献

  1. Lin, D., et al. Global, regional, and national burden of inflammatory bowel disease, 1990-2021: Insights from the global burden of disease 2021. Int J Colorectal Dis. 39 (1), 139(2024).
  2. Le Berre, C., Honap, S., Peyrin-Biroulet, L. Ulcerative colitis. Lancet. 402 (10401), 571-584 (2023).
  3. Cui, Y., et al. Integrated network pharmacology, molecular docking and animal experiment to explore the efficacy and potential mechanism of Baiyu decoction against ulcerative colitis by enema. Drug Des Devel Ther. 17, 3453-3472 (2023).
  4. Rosh, J. R., Gross, T., Mamula, P., Griffiths, A., Hyams, J. Hepatosplenic T-cell lymphoma in adolescents and young adults with Crohn's disease: A cautionary tale. Inflamm Bowel Dis. 13 (8), 1024-1030 (2007).
  5. Pastorelli, L., De Salvo, C., Mercado, J. R., Vecchi, M., Pizarro, T. T. Central role of the gut epithelial barrier in the pathogenesis of chronic intestinal inflammation: Lessons learned from animal models and human genetics. Front Immunol. 4, 280(2013).
  6. Capoccia, E., et al. Enteric glia: A new player in inflammatory bowel diseases. Int J Immunopathol Pharmacol. 28 (4), 443-451 (2015).
  7. Sharkey, K. A., Mawe, G. M. The enteric nervous system. Physiol Rev. 103 (2), 1487-1564 (2023).
  8. Fung, C., Boesmans, W., Cirillo, C., Foong, J. P. P., Bornstein, J. C., Vanden Berghe, P. VPAC receptor subtypes tune purinergic neuron-to-glia communication in the murine submucosal plexus. Front Cell Neurosci. 11, 118(2017).
  9. Bubeck, M., Becker, C., Patankar, J. V. Guardians of the gut: Influence of the enteric nervous system on the intestinal epithelial barrier. Front Med. 10, 1228938(2023).
  10. Da Silva Sousa, J. J., et al. Colonic mast cells trigger enteric neuronal death through the S100β/RAGE/NFκB pathway on inflammatory bowel diseases. Med Hypotheses. 170, 111004(2023).
  11. Xie, H., et al. Enteric glial cells aggravate the intestinal epithelial barrier damage by secreting S100β under high-altitude conditions. Mol Biomed. 4 (1), 31(2023).
  12. Grubišić, V., et al. Enteric glia modulate macrophage phenotype and visceral sensitivity following inflammation. Cell Rep. 32 (10), 108100(2020).
  13. Kermarrec, L., Durand, T., Neunlist, M., Naveilhan, P., Neveu, I. Enteric glial cells have specific immunosuppressive properties. J Neuroimmunol. 295 - 296, 79-83 (2016).
  14. Liu, D., et al. Flos lonicerae flavonoids attenuate experimental ulcerative colitis in rats via suppression of NF-κB signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (12), 2481-2494 (2020).
  15. Zhao, Y., et al. Gegen Qinlian decoction maintains colonic mucosal homeostasis in acute/chronic ulcerative colitis via bidirectionally modulating dysregulated Notch signaling. Phytomedicine. 68, 153182(2020).
  16. Zhu, L., Gu, P., Shen, H. Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats. Int Immunopharmacol. 68, 242-251 (2019).
  17. Zhang, S., et al. International clinical practice guideline on the use of traditional Chinese medicine for ulcerative colitis by Board of Specialty Committee of Digestive System Disease of World Federation of Chinese Medicine Societies (2023). Phytother Res. 38 (2), 970-999 (2024).
  18. He, X., et al. Bletilla striata: Medicinal uses, phytochemistry and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 195, 20-38 (2017).
  19. Kumari, M., et al. Acacia catechu (L.f.) Willd.: A review on bioactive compounds and their health promoting functionalities. Plants. 11 (22), 3091(2022).
  20. Yasueda, A., et al. Sanguisorba officinalis L. derived from herbal medicine prevents intestinal inflammation by inducing autophagy in macrophages. Sci Rep. 10 (1), 9972(2020).
  21. Garg Jyoti, V. Acacia catechu Willd. and Acacia arabica Willd. decrease the extent of anxiety behavior by reducing oxidative stress and moderating neurochemicals. J Ethnopharmacol. 312, 116496(2023).
  22. Ban, J. Y., et al. 3,4-Dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid β protein (25-35)-induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci Lett. 420 (2), 184-188 (2007).
  23. Olech, M., Ziemichód, W., Nowacka-Jechalke, N. The occurrence and biological activity of tormentic acid: A review. Molecules. 26 (13), 3797(2021).
  24. Wang, Q., et al. Hyperoside: A review on its sources, biological activities, and molecular mechanisms. Phytother Res. 36 (7), 2779-2802 (2022).
  25. Xun, L., et al. Physcion and physcion 8-O-β-glucopyranoside: A review of their pharmacology, toxicities and pharmacokinetics. Chem Biol Interact. 310, 108722(2019).
  26. Cirillo, C., et al. Increased mucosal nitric oxide production in ulcerative colitis is mediated in part by the enteroglial-derived S100B protein. Neurogastroenterol Motil. 21 (11), 1209-e112 (2009).
  27. Li, Y., et al. Inhibiting the activation of enteric glial cells alleviates intestinal inflammation and comorbid anxiety- and depressive-like behaviors in the ulcerative colitis mice. Neurochem Int. 178, 105789(2024).
  28. Cirillo, C., et al. S100B protein in the gut: The evidence for enteroglial-sustained intestinal inflammation. World J Gastroenterol. 17 (10), 1261-1266 (2011).
  29. Esposito, G., et al. Enteric glial-derived S100B protein stimulates nitric oxide production in celiac disease. Gastroenterology. 133 (3), 918-925 (2007).
  30. Yang, Y. H., Qian, W., Hou, X. H., Dai, C. B. Bifidobacterium bifidum and Bacteroides fragilis induced differential immune regulation of enteric glial cells subjected to exogenous inflammatory stimulation. Inflammation. 45 (6), 2388-2405 (2022).
  31. Le Berre, C., Naveilhan, P., Rolli-Derkinderen, M. Enteric glia at center stage of inflammatory bowel disease. Neurosci Lett. 809, 137315(2023).
  32. Schroeter, M. L., et al. Mood disorders are glial disorders: Evidence from in vivo studies. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2010, 780645(2010).
  33. Kaplan, G. G. The global burden of IBD: From 2015 to 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (12), 720-727 (2015).
  34. Fan, M., et al. Electroacupuncture at ST36 relieves visceral hypersensitivity based on the vagus-adrenal axis in the remission stage of ulcerative colitis. Neuromodulation. 28 (5), 812-824 (2025).
  35. Lechner, M., Lirk, P., Rieder, J. Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: The two sides of the same coin. Semin Cancer Biol. 15 (4), 277-289 (2005).
  36. Nomura, Y. NF-kappaB activation and IkappaB alpha dynamism involved in iNOS and chemokine induction in astroglial cells. Life Sci. 68 (15), 1695-1701 (2001).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

S100RAGENF BDSS

この記事は公開されました

動画は近日公開

お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。