修正スイスロール技術を用いたマウス胃筋層の空間マッピング強化

Summary

このプロトコルは、元々マウス腸向けに開発された「スイスロール」技術を改良した全胃免疫染色法を示しています。

Abstract

空間的「オミクス」技術は、胃神経筋器官の個々の細胞の生物学的相互作用を、その自然な組織環境で研究する前例のない機会を提供します。しかし、これらの手法の成功裏の適用や、眼底、小体、門骨における構造的・分子的差異の評価には、一貫したサンプリングと組織の配位付けが必要です。ここでは、マウスの胃に特化した改良型「スイスロール」技術を報告します。これにより、主要な解剖部位をすべて一度の冷凍切開で埋め込み、観察できます。このアプローチは、フラットな固定と慎重な位置取りを重視し、再現可能な向きと品質を持つ断面を作成します。また、免疫蛍光染色条件を最適化し、細胞マーカーの高品質な可視化を確保しました。このプロトコルにより、組織の損失や実験的変動を最小限に抑えつつ、胃領域の包括的かつ並列比較が可能になります。組織保存と空間的向きの向上により、この方法は生理学的および病理学的文脈で胃生物学を研究する研究者にとって実用的かつ拡張可能なツールを提供します。

Introduction

胃は複雑なJ字型の器官で、食道と十二指腸¹をつなぎます。この部位は主に3つの解剖学的領域に分かれています:眼底、体、そして第¹節です。胃被膜筋筋の各領域は異なる生理的役割を果たし、調節、服従、食物の調整、排出などの重要な胃機能に寄与しています^1,2。胃の生理学や病理の変化を研究するには、これらの領域とその細胞構造の詳細な分析が必要です。

広範囲の組織を可視化するために、研究者たちはしばしば「スイスロール」技術を応用します。これはもともとマウス腸3,4,5,6のために開発されました。この研究は、マウスの胃に用いるためにスイスロール技術を改良し、新たなプロトコルを確立しました。まず胃は解剖学的領域に分けられ、平らな姿勢で固定されます。その後、組織は慎重に巻き上げられ、冷凍解剖のために処理されます。不適切なスイスローリングは、特に腸内の脆弱な上皮構造を損傷し、免疫染色に適した組織の質を悪化させることがあります。細胞構造が完全な、しっかりと固定され適切な配向を持つ組織を保存することは、高解像度イメージングに不可欠です。この研究は、すべての胃領域を単一のクライオブロック内に含むスイスロールを生成する新しい方法を提示します。さらに、筋膜性胃の被膜に対して最適化された免疫蛍光染色プロトコルも記述されており、胃機能の詳細な評価が可能となっています。このプロトコルは、胃組織の慎重な準備、スイスロール処理、染色を通じて高品質な免疫蛍光画像を取得するための包括的なガイドを提供します。この方法は、胃の筋肉膜の複雑な形態を保存することで、その構造と健康および疾患における機能の理解を深めるのに役立ちます。

Protocol

動物実験は、国立衛生研究所の実験動物ケア・利用ガイドに記載されたガイドラインに従って実施されました。これらのプロトコルはメイヨークリニック施設動物ケア・利用委員会(A48315-15)によって承認されました。メイヨークリニックの動物ケアおよび利用プログラムおよび施設は、国際実験動物ケア評価認定協会(AAALAC)によって審査され、完全認定を受けています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. パラホルムアルデヒド(PFA)固定胃冷凍切開のためのスイスロール技術

1. C57BL/6Jマウス(生後8〜10週齢)を少なくとも3分間二酸化炭素(CO₂)吸入 して 麻酔し、その後子宮頸部脱臼を施して安楽死を確実にします(機関承認プロトコルに従い)。
2. 食道、十二指腸、腹側および背側の中腹を切って胃を取り除きます。
3. 胃を冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)入りのシリコンコーティング皿に入れます。食道、眼底、体、十二指腸を定着させて、方向の基準として使います(図1A)。切断方向は 図1Aの赤い破線で示されています。
4. ダボハサミと鉗子を使って、付着した脂肪を慎重に取り除きます。
5. 十二指腸の腹側腸間膜と胃に沿って小体のピンまで切り、組織を優しく平らにします(図1B)。
6. PBS入りのトランスファーピペットを使って胃腔内の残留食物を洗い流してください。
7. 開いた腹部を優しく伸ばして平らな向きにします(図1C)。
   注意:組織構造を保存するために、元の寸法の110%を超える過度の伸張は避けてください。
8. 胃を冷たい4%PFAに2分間浸して組織を軽く固定し、転がしやすくします。
9. 短い固定の後、組織を再び平らに固定します。
10. 腹部を破線に沿ってトリミングし、ローリングに適した均一な形状にします(図1C)。
11. トリミングした胃組織をPBS湿らせたフィルターペーパーの上に置きます(図1D)。
12. 組織をスイスロール状に丸め、中央に爪楊枝を差し込んで固定します。
    注意:巻き付けの際、粘膜側が上向きであることを確認しましょう。片手で鉗子で十二指腸端を握り、もう一方の手でつまようじを導き、公開されている方法のわずかな修正に従ってください。
13. 巻いたら、30Gの針を刺して形を固定し、90°の角度で曲げて丸めた胃を安定させます(図1E)。
14. 巻いた組織を4%PFAで4°Cで6時間固定します。
15. 固定組織をPBS中の30%ショ糖に移し、4°Cで12〜16時間培養してクライオプロテクションと氷結晶形成防止を行います。
16. 安定針を優しく外します。
17. 使い捨てのベース型を使って最適な切断温度(O.C.T.)化合物に組織を埋め込み、ドライアイスで凍結します(図1F)。
18. 完全に凍結したら、型を-80°Cで保存します。
    注意:O.C.T.内の気泡、特に組織周辺は切片の妨げになるため避けてください。組織ブロックは-80°Cで少なくとも1年間保存可能です。
19. 切片前に、ブロックを-20°Cで少なくとも1時間平衡させます。
20. クライオスタットで5μmの厚さで組織を切片します。
    注意:マウスの胃切片^7,8には一般的に5〜12μmの厚さが適しており、実験的ニーズに応じて調整可能です。セクションは-20°Cで最大3ヶ月間保存可能です。

2. 胃筋組織の免疫蛍光染色

1. 疎水性バリアペンを使い、顕微鏡スライドの各組織セクションの周囲に水を発注するバリアを描きます。
2. 残留するO.C.T.化合物を溶かすために、冷たいPBSで5分間セクションを洗い流します。
3. 室温(RT; 21-23°C)で1%牛血清アルブミン(BSA)をPBSで1時間培養することで非特異的結合を阻害します。
4. 1%のBSAを吸引で除去し、その後、切片を冷たいPBSでRT(21-23°C)でそれぞれ10分間3回洗います。
5. さらに、マウス同士のIgGブロッキング溶液をPBSでRT(21-23°C)で1時間培養することで非特異的結合を阻害し、マウス抗体IgGを用いた際には内因性IgGの結合を減少させ特異性を向上させます。
6. 吸引でブロッキング溶液を除去し、その後、冷たいPBSでそれぞれ10分間RT(21-23°C)で切片を3回洗います。
7. 逆呼吸(RT、21-23°C)で1時間BSAブロッキングを繰り返します。
8. 一次抗体で切片を培養してください。アノクタミン-1(ANO1)、KIT、ベータチューブリンクラスIII(TUBB3)は、冷たい1%BSAに0.3%トリトンX-100を希釈した。別の実験では、ミオシン重鎖11(MYH11)、E-カデリン、KITを用いてください。4°Cで12〜16時間の夜間を抱卵します。
9. 一次抗体溶液を優しく吸引して除去します。冷たいPBSで3回、RT(21-23°C)でそれぞれ10分間洗浄します。
10. 切片を二次抗体で培養します。Alexa Fluor(AF)488抗ウサギIgG、AF555抗マウスIgG、AF647抗ヤギIgG(いずれも5 μg/mL、1:400)を1% BSAでRT(21-23°C)で1時間投与しました。
11. 二次抗体溶液を吸引で除去し、切片を冷たいPBSで3回、RT(21-23°C)でそれぞれ10分間洗浄します。
12. 4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI、希釈1:300°C)で1時間RT(21°-23°C)で染色します。
    注意:神経核は通常、他の消化管細胞タイプよりもDAPI信号が弱いです。最適な可視化のためには最低1時間の潜伏が推奨されます。
13. 残留塩分を取り除くために、超音波の部分を超純水で一度洗い流してください。
14. スライドはアンチフェードマウントで取り付けます。
15. カバースリップの角を蛍光性のラッカーネイルポリッシュで封印してください。余分なマウントメディウムは優しく吸引して取り除きます。次にカバースリップの周囲全体を密閉します。

3. 共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光イメージング

1. DAPI、AF488、AF555、AF647用のレーザーと検出器を設定し、スペクトル分離と信号飽和を回避し、共焦点イメージングソフトウェアでマルチチャネルZスタック取得をセットアップします。
   注意:各蛍光分子ごとにレーザー出力と露光時間を個別に調整し、クロストークを防ぎ、全チャンネルのダイナミックレンジ内に信号を保ってください(図2A)。
2. 共焦点イメージングソフトウェアで露出パラメータを設定し、高輝度領域のピクセル飽和を避け、信号の詳細を保持します(図2B)。
   注意:すべてのチャンネルの信号がダイナミックレンジ内に収まり、飽和状態にならないようにしてください。
3. 胃のSwissロール全体をキャプチャするには、大きな画像取得設定(例:6×6フィールド)(図2C)を使用します。ただし、この設定は巻いた組織の全体の大きさや締まり深さに応じて調整する必要があります。
4. 共焦点イメージングソフトウェアのZシリーズ取得を用いて3D画像を取得します。N次元(ND)取得の詳細なワークフローは 図2Dに示されています。
5. Zシリーズイメージングを有効にするために Zスタック オプションを選択してください。
6. Z範囲は、胃全体の全厚を含む上下の焦点位置を設定することで定義します。
7. 腹部の上部にピントを合わせ、 トップ ボタンをクリックして上限Zリミットを設定します。
8. 胃筋の下部にフォーカスを調整し、「 ボトム 」ボタンをクリックして下限Zリミットを設定します。
9. 胃筋の全深さにZスタックステップ数を8回に設定します。
10. 「 今すぐ実行 」をクリックするとZスタック画像取得を開始します。
11. 個別および統合された蛍光チャネルの最大強度投影を生成し、二次元画像上で三次元データを可視化します。

Results

新しい方法を用いると、マウスの胃スイスロールは胃の主要3領域すべて(眼底、小体、肛門)に加え、食道と十二指腸の一部を1つのセクションに含みました。胃全体を一つのセクションに含めることで、包括的な地域分析が可能になります(図1)。胃のスイスロール全体画像にヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を施したことで、すべての領域で胃構造が良好に保存されており、粘膜層、粘膜下層、筋層の明確な可視化が可能となりました(図3)。図4は、カハール間質細胞(ICC;相性腸運動の基盤となるリズム的緩波を生成するペースメーカー細胞;KITおよびANO1で識別)、腸ニューロン(消化管運動を調整する腸神経系のニューロン;TUBB3免疫染色で識別)、および核核(DAPI)の代表的な免疫蛍光染色を示しています。胃粘膜では、KITは^{以前に報告}されたようにパネス細胞やゴブレット細胞でも発現^{しています。}ANO1は胃上皮、特に眼底の柱状上皮細胞で高発現しており、塩化物輸送および粘膜分泌における役割と一致しています¹¹。さらに、TUBB3はヒトプロテインアトラス^12,13のデータによると、特定の胃内分泌細胞や粘液分泌細胞でも発現しています。図5は、MYH11によって標識された平滑筋細胞、E-カデリンによって標識された胃粘膜上皮細胞、そしてKTによって標識されたICCの代表的な免疫蛍光染色を示しています。MYH11は胃粘膜の筋線維芽細胞でも発現しており、以前に報告されている¹⁴。これらの免疫蛍光結果を合わせることで、当プロトコルが組織構造を保存していることが確認されます。

図1:マウスの胃の「スイスロール」の冷凍解剖準備。 (A) 胃全体を、組織の完全性を保つために、摘出直後に冷たいリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を充填した黒いシリコーンコーティングの解剖皿に入れます。(B) 胃は十二指腸の中央に開いています。(C)腹部を優しく伸ばし、皿に固定して過度な緊張をかけずに平らに寝かせる。組織に沿って赤い破線が引かれ、転がりやすくするためにトリミングすべき箇所を示します。(D) 開いた固定された胃を、PBS湿らせたフィルター紙の上に置き、コンパクトな構成に巻く準備を行います。赤い矢印は胃の回転方向を示しています。(E) 組織片は最適切断温度(O.C.T.)の化合物に埋め込まれ、ドライアイス上で凍結されて冷凍し、冷凍解剖の準備を行います。(F) 凍結ブロックは−80°Cで保存され、5μm厚さで冷凍切断され、下流分析に使用されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:Zスタックイメージング中のND取得セットアップおよび飽和可視化。 (A) 多チャネルスペクトルイメージング用に共焦点イメージングソフトウェアで設定されたレーザーおよび検出器の設定。4種類の蛍光色素が使用されます:4′,6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール(DAPI)、Alexa Fluor 488(AF488)、Alexa Fluor 555(AF555)、Alexa Fluor 647(AF647)。それぞれに対応する励起レーザーと発光検出器と組み合わされています。スペクトルグラフは励起曲線と放出曲線を示し、クロストークを最小限に抑え信号検出を最適化するための調整を可能にします。(B) 各蛍光分子ごとに露出設定を個別に調整し、ピクセル彩度を避け高輝度領域のディテールを保持します。(C) 大規模な画像取得設定(例:6×6フィールド)により、胃のスイスロール全体を可視化すること;画像フィールドのサイズは、巻き上げた組織の大きさやコンパクトさに応じて調整する必要があります。(D) ND取得ウィンドウでZスタックパラメータ設定を表示します。Z範囲は胃筋の上下位置を選択し、組織の全深さを把握するために8つのステップが設定され、3次元(3D)解析を行います。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ヘマトキシリンとエオシン染色されたマウス胃のスイスロールの画像。 タイルスキャンは、生後8週間のメスのC57BL/6Jマウスの胃のスイスロール全体を可視化できることを示しています。主な解剖学的領域は食道(赤い点線)、下部食道括約筋(紫色の点線)、眼底(黒い点線)、小体(青い点線)、肛門(緑の点線)、十二指腸(オレンジの点線)などが示されています。スケールバー:1000μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:マウスの胃のスイスロールの共焦点画像:ANO1、KIT、TUBB3。 上部パネル:8週間齢のメスC57BL/6Jマウスの胃スイスロールの代表的な縫合共焦点画像で、ANO1(緑)、KIT(シアン)、TUBB3(黄色)、核(青)の免疫染色を示しています。胃底、体、門を含む全ての回転した胃が視覚化されます。スケールバー:1000μm。 下部パネル:上部パネルの白い破線のボックスで囲まれた領域の拡大図で、カハールの間質細胞(ANO1⁺ および^KIT+;黄色の矢印)および腸内ニューロン(TUBB3⁺;赤い矢印)の細胞詳細を強調。スケールバー:100μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図5:マウスの胃全体のスイスロールの共焦点画像:MYH11、KIT、E-カデリン。 上部パネル:生後8週間のメスのC57BL/6Jマウスの胃スイスロールの代表的な縫合共焦点画像で、MYH11(緑)、KIT(シアン)、E-カデリン(黄色)、核(青)の免疫染色を示しています。胃底、体、門を含む全ての回転した胃が視覚化されます。スケールバー:1000μm。 下部パネル:上部パネルの白い線のボックスで囲まれた拡大された地域のビュー。白い点線は粘膜上皮(E-カデリン)と筋層(MYH11)を示しています。白い矢印はカハール間質細胞(ICC)を示すKIT⁺ 。スケールバー:100μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

Discussion

新たに最適化された胃のスウィスロール法を用いることで、胃の3つの区画(眼底、小体、肛門)と食道、十二指腸を1枚のスライドに含めます。この包括的な埋め込みにより、研究者は胃全体の構造的および分子的変化を解析でき、試薬の切片および染色コストを削減できます(図1)。

免疫染色時にすべての胃部を同じ染色液に同時に曝露することで一貫性が保たれ、精度が向上します。スイス製胃の免疫染色により、胃壁の異なる層が明確に明らかになります。 図4 および 図5に示すように、この方法は胃節間の形態的差異を可視化し、ICC(KITおよびANO1)¹⁰、ニューロン(TUBB3)¹⁵、平滑筋細胞(MYH11)、粘膜上皮細胞(E-カデリン)、および核の検出を可能にします。

組織の状態や研究目的に応じて、わずかな修正が加えられることがあります。例えば、余分な付着脂肪を取り除くことで、固定時のロールの形状を保つのに役立ちます。切片の厚さを調整することで、組織構造の維持やスライドへの接着性の向上にも役立ちます。もう一つの改良案として、腸用スイスロール¹⁶のように金属型を使ってより均一な切断を行う方法があります。このプロトコルは冷凍切開に重点を置いていますが、パラフィン埋め込み組織にも適応される可能性があります。パラフィン埋め込みは組織の構造的完全性を保つ一方で、クライオセクションはより速い処理と抗原の保存を可能にし、免疫蛍光により適しています。

この方法には限界があります。炎症、肥満、糖尿病、加齢などの疾患でよく見られる肥大、線維化、または石灰化した胃は、転がすのが難しく、最適な染色に課題をもたらす^{ことがあります。}この制約にもかかわらず、この技術は従来の領域別埋め込みに比べて大きな利点を提供します。すべての胃領域を同一条件下で処理することで、一貫性が向上し、変動性が低減され、時間と試薬の両方を節約できます。

このアプローチは、地域特有の変化の研究に特に有用です。また、複数の細胞タイプの空間解析をサポートし、画像ベースの定量化と組み合わせることも可能です。総じて、この新たに最適化された胃のスウィスロール法は、健康および疾患における包括的な胃組織解析のための実用的かつ拡張可能なプラットフォームを提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5SF 鉗子	ファインサイエンスツール	11252-00
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A7906
ColdVision MC-LS LED 光源	ショット	MC-LS
コンフォーカルソフトウェア	ニコン	ニコン NIS-Elements イメージングソフトウェア
クライオシールXYL	エプレディダ	9312-4
DAPI(4フィート、6-ジアミジノ-2-フェニリンドール、ディラクテート)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	D3571
解剖皿、大	リビングシステム 楽器編成	SKU:DD-90
ドンキーアンチゴート AF647 pAb	ライフ・テクノロジーズ	A21447	ロット:1739289 RRID:AB_2535864
ドンキーアンチマウス AF555 pAb	ライフ・テクノロジーズ	A31570	ロット:1774719 RRID:AB_2536180
ドンキーアンチラビット AF488 pAb	ライフ・テクノロジーズ	A21206	ロット:2668665 RRID:AB_2535792
E-カダリン(1:400希釈)	BD バイオサイエンス	610181	ロット:25510 RRID:AB_397580
イオシン	ELITechGroup(エリタイックグループ)	$SS-071C
エポキシコーティング鉗子	ファインサイエンスツール	11210-10
エタノール	シグマ・オルドリッチ	459828-4L
フレックスチューブ 1.5 mL	エッペンドルフ	22364111
ガーゼスポンジ	フィッシャーサイエンティフィック	22-362-178
硬化ファインシザー	ファインサイエンスツール	14090-09
ヘマトキシリン	エプレディア	7211
KIT(0.2 & micro;g/mL;1:1000の希釈)	R&Dシステムズ	AF1356	ロット:IEO0217101 リッド:AB_354750
レンズクリーニング用溶液 1オンス スプレーボトル	ニコン	77013066
顕微鏡カバーガラス	フィッシャー・サイエンティフィック	12541016
顕微鏡スライド	カーディナルヘルス	M6133A
ミニチュティアンピン	ファインサイエンスツール	26002-20
MYH11(1:400希釈)	バイオメディカルテクノロジー	BT-562	リッド:AB_10013421
ネイルポリッシュ	罪深い色	7.33855E+11
針 30 G x 1/2インチ & nbsp;	BD バイオサイエンス	305106
パラホルムアルデヒド	シグマ・オルドリッチ	158127-500G
パーソナ・シングルエッジブレード	ザ・レイザーブレード社	76247-652
ReadyProbesマウス間IgGブロッキングソリューション(30倍)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	R37621	ロット:3226230
スローフェイドダイヤモンドアンチフェードマウント(マウンティングメディア)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	S36972
StainTray 10スライド染色システム	Simport Scientific	M918-2
ステレオ顕微鏡 0.8x-5x	ニコン	SMZ645
スクロース	シグマ・オルドリッチ	S9378-1KG
サーフェスアンプ X-100(トライトンX)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	28314
TMEM16A(ANO1:1:400希釈)	アブカム	ab53212	ロット:GP3295656-1 RRID:AB_883075
トランスファーピペット	ファルコン	357575
TUBB3(1:400希釈)	細胞シグナル伝達技術	4466	ロット:5 RRID: AB_1904176
キシレン	フィッシャー・サイエンティフィック	X3P-1GAL	ロット206238