ナイメーヘン止血アッセイ:単一のウェルにおけるトロンビンとプラズミン生成の同時蛍光生成測定

サマリー

このプロトコルは、トロンビンとプラズミン生成を同時かつ時間分解で測定し、凝固と線維溶合の統合評価を可能にするナイメーヘン止血アッセイを説明しています。このアッセイは、従来の止血試験の範囲を超えた研究および臨床現場での止血バランスの特徴付けを改善することを目的としています。

要約

トロンビンとプラスミンはそれぞれ凝固と線維溶化を調節し、止血において中心的な役割を果たします。従来の止血アッセイは、単離成分や限られた止血段階に焦点を当てることが多いです。例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間およびプロトロンビン時間はフィブリン形成の開始のみを評価し、活性アッセイは個々の凝固因子の機能を評価します。これらのアッセイは価値がありますが、二次止血および線維溶解の全体的なプロセスの包括的な視点は欠いており、これらは時間とともに動的に展開します。ナイメーヘン止血アッセイ(NHA)は、単一のマイクロプレートウェル内でトロンビンおよびプラスミン生成を同時かつ時間分解可能にすることで、この制約に対処しています。異なる励起および発光スペクトルを持ち、交差反応性のない2つの合成蛍光生成基質を用いることで、このアッセイは両酵素を並行して正確に定量化することを可能にします。血小板不足の血漿では、組織因子、カルシウム、組織型プラスミノゲン活性化剤を用いて止血を開始し、37°Cで70分間にわたり30秒ごとに蛍光が記録されます。 酵素活性曲線はキャリブレーション標準を用いて生成され、そこから遅延時間、トロンビン電位、フィブリン溶解時間、プラスミンピーク高さなどのパラメータが導出されます。このアッセイは、同時進行するトロンビンおよびプラズミン生成を高精度で捉え、ヘパリン、活性タンパク質C、イプシロン・アミノカプロイン酸などのエフェクターによる凝固および線維溶離の調節を検出します。臨床サンプルでは、凝固因子欠損症患者でトロンビン生成が有意に減少し、線維溶解障害患者ではプラスミン生成プロファイルが上昇しました。トロンビンとプラスミン生成の測定を組み合わせることで、NHAは従来のアッセイを超えた止血バランスの包括的な洞察を提供します。この統合的アプローチは、止血表現型の特徴付け、出血および血栓リスクの評価、標的治療介入のモニタリングなどの研究および臨床応用に期待されています。このプロトコルは、止血バランスの理解と評価を高めることを目的としたNHA手順を概説しています。

概要

止血は凝固と線維溶融の動的なバランスの結果です。トロンビンとプラスミンがこれらの過程を駆動する主要な酵素です。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換し、プラズミンはフィブリンを分解して血栓を溶解させます。このバランスが崩れると出血や^{血栓性イベント}を引き起こすことがあります^1,2。しかし、臨床現場で止血を評価するための検査は、通常凝固や線維溶解の単発段階に焦点を当てており、全体の止血バランスについての洞察は限られています。出血傾向が疑われる患者では、プロトロンビン時間(PT)や活性化部分トロンボスチン時間(aPTT)などの定期的なスクリーニング検査が凝固因子欠損症のスクリーニングに一般的に用いられます。しかし、これらのアッセイは初期フィブリン形成までの時間を測定し、血栓開始以降のトロンビン生成を捉えません。この時期には生理学的に重要なトロンビン^{活性が最も多く}発生します^1,2,3。したがって、軽度の凝固因子欠損症3,4,5,6,7,8の患者では正常な結果が得られることがあります。これらの特定の欠乏を特定するために、凝固因子活性アッセイが用いられます。診断には有益ですが、これらのアッセイは個々のタンパク質を単独で評価し、全体的な止血バランスを反映するものではありません。その結果、軽度の欠損症患者では、因子レベルが出血表現型と相関が低いことが多い^9,10。これにより、臨床リスク評価や治療のタイミングや投与量、血栓性または重度出血性事象への介入など患者管理の最適化が複雑になります。これらの制限は、経過した止血過程をより包括的に観察できるアッセイの必要性を強調し、検査結果と臨床症状のギャップを埋める助けとなる可能性があります。

ナイメーヘン止血検査法(NHA)は、これらの制限に対処するために開発され、血小板が少ない血漿^8,9におけるトロンビンとプラズミン生成を同時に時間分解で測定できるようにしました。異なる励起および発光スペクトルを持つ2つの合成フルオロゲン基質を用いて、同じマイクロプレート上で両酵素を交差反応性なく正確に定量します。酵素生成曲線により、二次凝固および線維溶離の動態を反映した定量的パラメータ(遅延時間、トロンビンピーク高さ、フィブリン溶解時間、プラスミンピーク高さなど)を導出できます。NHAは、既存の自動血栓グラム(CAT)、セヴェロンs100、STジェネシアなどの既存のトロンビン生成アッセイに比べていくつかの利点を持ちます。これらはトロンビン動態に関する貴重な情報を提供しますが、線維溶活性^10,11,12,13は評価しません。血栓溶解アッセイは線維溶解の一部を捉えますが、¹⁴世代のトロンビンに関する情報は不足しています。これにより、全体的な止血バランスを決定する複雑な相互作用を評価する際の彼らの有用性は制限されます。一部の研究室で開発された手法では、トロンビンとプラスミン生成を組み合わせた測定が行われていますが、これらは通常、別々のウェルや並列アッセイを必要とし、時間的なアライメントやスループットが制限されます^。血栓エストラストグラフィー(TEG)や回転血栓エストメトリー(ROTEM)などのグローバルアッセイは、一次止血、二次凝固、線維溶解を捉えることで補完的な情報を提供します^16,17。フローチャンバーシステムは、流量条件¹⁸における全止血を評価するための新たな実験的アプローチを示しています。これらのグローバルアッセイはより広範な生理学的文脈を提供しますが、軽度出血性障害に対しては一般的に感受性が低いです(19,20,21)。同一反応井戸内でトロンビンとプラスミン生成を同時に測定することで、NHAは従来のTGAの感度とグローバルアッセイの統合的視点を組み合わせ、二次止血、線維素溶解およびそれらの相互作用を直接評価することを可能にします。

トロンビン生成アッセイは、個別出血や血栓リスクプロファイリング、治療モニタリングなどのトランスレーショナル応用においてすでに大きな可能性を示しています 22,23,24,25。臨床研究では、NHAは血友病A、血友病B、稀な凝固因子欠損症患者におけるトロンビン生成の減少、さらにα2-抗プラズミン欠損症(26,27,28,29)などの高線溶疾患におけるプラスミン生成の増加を示しています。また、出血と血栓リスクの増加に関連する低フィブリノゲン血症患者でも両経路の違いが観察されています。この集団では、フィブリノーゲンレベルの低下とプラスミン生成の減少と相関しており、これはプラスミノゲン結合部位の欠如によると考えられる。一方、血栓症の既往がある患者はトロンビン生成の増加を示した³⁰。さらに、このアッセイは抗凝固剤、プロ凝固剤、抗線溶薬などの治療薬の効果も検出^します。以前の研究では、再現性を高め、ランや検査室間で結果の比較を可能にする標準化および正規化アプローチを提案しており、^{臨床実装に}向けた重要な一歩です。このプロトコルは、臨床研究やトランスレーショナルの現場での実装におけるNHAの全手順および分析アプローチを概説しています。

プロトコル

ヒト血漿サンプルを含むすべての処置は、機関のガイドラインに従って実施され、アーネム・ナイメーヘンの医療倫理委員会によって承認されました。サンプル採取前に、すべてのドナーから書面によるインフォームドコンセントが取得されました。

1. バッファー、試薬、血漿サンプルの調製

1. 緩衝液を準備してください
   1. 1.2 g Tris(p.a.)を重さ、0.9% NaCl を含む180 mLに溶かします。
   2. HClを使ってpHを7.4に調整します。
   3. 最終体積を200 mLに、0.9%のNaClで50 mM Tris-150 mM NaClバッファー(TBS)を得ます。
   4. TBSを2本の50mLチューブに分けます。
   5. 残りの100mL TBSを使ってカルシウム含有バッファーを準備します。7.34 g CaCl₂·2H₂Oを100 mLのTBSに溶解し、Tris-NaCl-CaCl₂ バッファー(TBS-Ca、pH 7.4)を得ます。
   6. TBS-Caを2本の50mLチューブに分けて分断します。
   7. 両方のバッファーは4°Cで保存し、1週間以内に使用してください。
2. フルオロゲン基質の準備
   1. トロンビン基質(Bz-β-Ala-Gly-Arg-AMC)53.2 mgを4 mLのTris-NaClバッファーに溶解します。
      注:箱には分析証明書付きのリーフレットが入っています。追加するバッファーの量は指定濃度によって異なり、120 μL試薬に添加されたヒトトロンビン1 μLで最終濃度を76 nmol/Lにするよう調整する必要があります。
   2. エッペンドルフ管に100μLを分断し、−80°Cで保存します。
   3. 使用前に、トロンビン特異的フルオロゲン基質のアリコートを室温で10分間解凍します。実験中はボルテックスと氷のままにしろ。
   4. プラズミン基質(CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine)1バイアルの内容物を1,955μLのDMSOに溶解します。
      注:箱には分析証明書付きのリーフレットが入っています。添加するバッファーの量は指定濃度によって異なり、120μL試薬に1μLのヒトプラズミンを加えると最終濃度200 nmol/Lになるように調整する必要があります。
   5. エッペンドルフ管に60μLをアリコートし、−80°Cで保存します。
   6. 使用前に、プラズミン特異的蛍光生成基質のアリコートを室温で10分間解凍します。実験中は渦を巻き起こし、室温で保ちます。
      注意:この基質はジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解しており、降水を避けるために冷却してはいけません。
3. トリガー試薬を準備しろ
   1. 蒸留水1mLを加えて凍乾したセファリンを再構成します。完全に溶けるまで徹底的に渦を巻く。
      注:セファリンはリン脂質を供給するために再構成されており、リン脂質は複数の凝固反応を触媒し、アッセイで生理学的に重要な凝固を可能にするために不可欠です。
   2. エッペンドルフ管に60μLのアリコート(20井戸分)を抽出し、−20°Cで保存します。
   3. 使用前にアリコートを解凍し、氷で保管してください。ピペッティング前に一瞬渦を吹き飛ばします。
   4. 4mLの蒸留水で組換えヒト組織因子(TF)バイアル1本の内容物を再構成します。
   5. エッペンドルフ管に60μLをアリコートし、−80°Cで保存します。
   6. TFのアリコートを一時的に溶かし、ボルテックスを使います。
   7. TFを1:500で逐次希釈で準備します:
      1. TFを54μLのTBSバッファーに加えます。渦巻き。
      2. この希釈液6μLをTBS54μLに加えます。渦巻き。
      3. この2回目の希釈液を20μL取り、TBSを80μL加えて最終濃度0.28 pMにします。渦巻き。
   8. 組織型プラズミノゲン活性化剤(tPA)1バイアル(20 mg)の内容物を蒸留水20 mLに再構成し、最終濃度580,000 IU/mL(バッチ特異濃度を確認)にします。
   9. エッペンドルフ管に50μLを割り当て、−80°Cで保存します。
   10. tPAのアリコートを少し溶かして、短時間ボルテックスを使います。
   11. 20μLのtPAを980μLのTris-NaClバッファーに加え、1:50の希釈tPAを準備し、最終濃度11,600 IU/mLに到達させます。渦巻き。
4. 血漿サンプルを準備してください
   1. 静脈血を3.2%シトレートを含む3 mLのシトレートチューブに採取し、少なくとも2.7 mL(90%充填)を確保します。
   2. 静脈穿刺後の最初のチューブは使わないでください。組織因子による活性化を避けるために廃棄してください。
   3. 採取直後、チューブを少なくとも10回逆さまにしてください。
   4. 室温で2時間以内に遠心分離機を使い、最初は2,500 ×g で5分間、次に10,000 ×g で10分間加熱します。
   5. 使い捨てピペットを使って細胞層のすぐ上から血漿を採取します。
   6. プラズマを標識されたクライオビアルに分割し、液体窒素で速凍し、−80°Cで保存します。
      注意:サンプルに血栓がないことを確認してください。新鮮な血漿や一度解凍した血漿のみを使いましょう。CTADチューブ1本で重複分析が可能です。

2. 機器の準備とソフトウェアのセットアップ

1. 蛍光プレートリーダーを準備してください
   1. プレートリーダーを起動し、37°Cまで平衡させます。
   2. 以下の基本パラメータを設定してください:
      1. グライナー96ウェル、フラットボトム、ブラック。
      2. 一般設定:位置決め遅延:0.1秒;運動時間の回数:1。
      3. 運動時間窓:サイクル数:140;測定開始時間:0.0秒;1サイクルあたりの1ウェルあたりのフラッシュ数:10回;サイクルタイム:30秒。
      4. 光学系:トップ光学系
      5. フィルター設定:単色粒子数:2。励起フィルター:トロンビン用355nm;プラスミンは485nmです。発光フィルター:トロンビン用460nm、プラズミン用520nm。ゲイン:600。
   3. 1枚のプレートに最大20ウェルの配置を定義します。
   4. 濃度/体積/シェイキングに切り替え、以下の設定を確認してください。ポンプ1 = 20 μL;ポンプ2 = 0 μL;速度=420 μL/s。
2. 注入システムの準備をしてください
   1. 注射針を取り出して、バッファー付きの容器ですすいでください。
   2. 洗浄液の容量を2,500μLに設定し、37°CのTris/NaClバッファーでポンプをすい流します。
   3. すすぎの量を500μLにリセットします。

3. マイクロプレート形式でのアッセイセットアップ

1. マイクロプレートシェーカーのセットアップ
   1. 使用前にマイクロプレートシェーカーを37°Cに設定し、温度を確認してください。
   2. 振動強度を1100rpmに設定してください。
   3. このシェーカーはアッセイのすべての混合工程に使用し、試薬の均一な分布と一貫した酵素活性を確保します。
2. 井戸に試薬を加える
   1. 患者の血漿と通常のプール血漿(NPP)を37°Cの水浴で最大10分間溶かします。
   2. よく混ぜて完全に解凍(氷沈殿物なし)を確認しましょう。
   3. 患者血漿またはNPPをあらかじめ選択したウェルに80μLを加えます。各サンプルごとに新しいピペットの先端を使いましょう。
      注意:各アッセイランにNPPサンプルを含め、ラン間の変動を考慮してください(ステップ5.6の詳細参照)。
   4. セファリンを2μL追加します。
   5. 組織因子2μL(希釈1:500)を加えます。プレートシェイカーで短く混ぜます。
   6. トリスNaClバッファー10μLを加えます。プレートシェイカーで短く混ぜます。
   7. 4μLのトロンビン基質を追加します。
   8. プラスミン基質を2μL追加します。プレートシェイカーで短く混ぜます。
3. 前潜伏
   1. マイクロプレートをプレートリーダーに挿入します。
   2. プレートを37°Cで数分間平衡させます。

4. 開始試薬の調製および注入

1. ポンプ1用の試薬を準備してください
   1. Tris/NaClバッファー672μL、Tris/NaCl/CaCl₂バッファー192μL、tPA96μL(ステップ1.2.5以降)を組み合わせます。ボルテックスを徹底的に。
   2. 試薬チューブのキャップに2つの穴を開けてください。
   3. ポンプのチューブをチューブの底に通す穴を通します。
2. プライムしてアッセイを始めます
   1. ソフトウェアを使って500μLの試薬でポンプをプライムします。
   2. 注射針を指定された位置に再度挿入します。
   3. すぐに蛍光測定を開始してください。
3. アッセイの手動開始
   注:この手動開始手順は、ステップ2.2、4.1、4.2で説明されている自動注入ワークフローの代替手段を提供します。
   1. 使用直前に4.1.1で説明されている開始試薬を準備してください。
   2. プレートリーダーからマイクロプレートを取り出し、各ウェルに20μLの開始試薬を素早く加え、より速い取り扱いを図ります。
   3. 直ちにプレートをリーダーに戻し、遅延なく蛍光測定を開始します。
      注意:試薬添加から測定開始までの時間を最小化(1行あたり<10秒)して変動を減らしてください。
4. 運動学的読み取り
   1. 蛍光を30秒ごとに70分記録してください。
   2. 測定中はプレートを37°Cに保ちます。

5. データ分析

1. 分析のためにデータを準備してください
   1. プレートリーダーから動態蛍光データを、タイムポイントと各ウェルごとの蛍光値を含むテーブルとしてエクスポートします。
   2. 生の蛍光データをExcelや他のソフトで一次微分を計算して酵素生成曲線に変換します。
   3. 各ウェルごとに酵素生成曲線をプロットして酵素反応を可視化します。
      注:これらの曲線は時間経過によるトロンビンまたはプラスミン生成速度を表し、図に示されたグラフィック出力に対応しています。
2. 血栓生成曲線の解析
   1. トロンビン生成曲線から以下のパラメータを特定します( 図1参照):
      1. ラグタイム:トロンビン生成曲線が一貫して上昇し、トロンビンピークの高さの8%に達する時点です。
      2. トロンビンピーク高さ:y軸の最大信号値(すなわち最大トロンビン生成率)。
      3. トロンビンピーク時間:アッセイ開始からトロンビンピークの高さまでの時間。
      4. トロンビン電位(トロンビン生成曲線下の面積):ラグタイムからトロンビン信号が基準値に戻るまでの曲線下の面積。
         注:トロンビン電位は、アッセイ条件下でのサンプルの総トロンビン生成能力を反映しています。
3. プラズミン生成曲線の解析
   1. プラズミン生成曲線から以下のパラメータを特定します( 図2参照):
      1. フィブリン溶解時間:プラズミン生成開始(すなわちプラズミン生成曲線が一貫して上昇し、プラスミンピーク高さの8%に達する時刻)からプラズミンピークに達するまでの時間。
      2. プラズミンピーク高さ:曲線の最初の明確な最大値は、プラズミン生成の初期バーストに対応し、プラズミン生成開始後にプラズミン生成曲線の2階微分(3分間移動平均に基づく)がゼロになる地点で決定されます。
      3. プラスミンポテンシャル(プラスミン生成曲線下面積):プラズミン生成開始からプラズミンピーク時刻までの曲線下面積。
         注意:信号の変動は初期プラズミンピーク後に発生し、プラズミン生成パラメータの解析には含まれません。
4. パラメータを手動またはカスタムソフトウェアで抽出してください
   1. Microsoft Excel、GraphPad Prism、またはカスタムスクリプト(例:PythonやR)を使って運動パラメータを抽出してください。
   2. 生データ、プロットされた曲線、計算されたパラメータを構造化形式で保存し、アーカイブや将来の参照にします。
      注意:マクロを使用する場合は、自動出力に頼る前にすべてのパラメータの正確性を視覚的かつ手動で確認してください。データ変換用のマクロはご要望に応じてご利用いただけます。
5. 標準化と正規化
   1. 正常化に用いるNPPサンプルと並行して、健康なドナーからの40個体を測定して生理学的基準を確立します。このステップはNPPバッチごとに1回行います。
   2. 健康なドナーの平均トロンビンおよびプラズミン生成パラメータ値を計算し、同じランで得られたNPP値との比率を決定します。
   3. 各患者サンプルごとに、まず同じランで測定されたNPP値にトロンビンまたはプラスミン生成パラメータを正規化します。
   4. この結果を、同じNPPバッチで以前に設定した健康なドナー対NPP比率で割ります(ステップ5.6.2参照)。これにより、平均的な健康個体に正規化された相対値が得られ、NPPを用いたインターランバリアの標準化が行われます。
   5. パラメータ値は健康な個人の平均値(100%)に対する割合として表されます。患者サンプルの結果を適切に提示してください。
      注:各患者サンプルの相対パラメータ値は以下の式で計算されます。ここで、ランaは患者サンプルの測定ラン、ランbは健康なドナーサンプルを同じNPPバッチと並行して測定した参照ランを示します。データ正規化の計算を含むExcelファイルは、ご要望に応じてご利用いただけます。
      

6. キャリブレーション曲線の生成

1. トロンビンキャリブレーション曲線を準備します
   1. 製造元のデータシートに指示された通り、凍結乾燥したヒトαトロンビンを再構成する。
      注:例えば、データシートで100μLの水で再構成して3.34 mg/mLと指定されている場合、これは100 μLで0.334 mgに相当します。
   2. 再構成されたトロンビンをTris/NaClバッファーで1:10希釈します。
      注:これにより、分子量36,700 g/molに基づく約9.1 nmol/mL(0.0091 nmol/μL)のストック濃度が得られます。
   3. Tris/NaClバッファーで希釈系列を準備し、アッセイ内で0から152 nmol/Lの範囲で最終的なトロンビン濃度を得ます。
   4. バッファーを含む選択されたウェルにピペットでスロンビンを注入し、1ウェルあたりの総体積を100μLに達成します。
   5. ステップ1.2.2の300μLトリス/NaClバッファーと200μLのトロンビン基質を混合して、ポンプ1用の基質溶液を準備します。
   6. さらに400μLの混合物と360μLのTris/NaClバッファーを混ぜて希釈します。
   7. 各校正井戸にこの基質混合物を20μL加え、総アッセイ体積を120μLにします。
   8. プレートを優しく混ぜてプレートリーダーに差し込みます。第2節で説明した蛍光設定で25サイクルの動態分析を行います。
   9. 生の蛍光データをエクスポートし、GraphPad Prismまたは同等のソフトウェアを用いて各トロンビン濃度の初期傾き(サイクルあたりの蛍光増加率)を算出します。
   10. 初期傾きとトロンビン濃度をプロットして標準曲線を作成します。
       注意:すべてのバッファーは37°Cまで予熱され、酵素は氷上で扱うようにしてください。常に新鮮な希釈液を用意し、よく混ぜてください。得られた標準曲線は、第5節で説明したマクロを使って未知のサンプルにおける相対的なトロンビン活性を計算するために用いられます。
2. プラズミン校正曲線の準備
   1. 製造元の指示に従い、蒸留水(例:0.543 mL)で凍結乾燥プラズミンを再構成します。
      注:プラズミンの分子量は75,400 g/molです。得られるストック濃度は約24.3 nmol/mL(0.024 nmol/μL)であり、0.543 mLに1 mgを含んでいると仮定します。
   2. Tris/NaClバッファーで希釈系列を準備し、最終プラズミン濃度を66〜532 nmol/Lの範囲で測定します。
   3. Tris/NaClバッファーを含むウェルにピペットプラズミンを移し、最終体積100 μLに到達させます。
   4. ステップ1.2.5の基質溶液を、Tris/NaCl緩衝液680μLとプラズミン/ロダミン基質80μL(必要に応じて希釈済み1:1)を混合して準備します。
   5. 各キャリブレーション井戸にこの基質溶液を20μL加え、総体積は120μLとなります。
   6. プレートを優しく混ぜてプレートリーダーに差し込みます。セクション2で説明した蛍光設定を用いて、25サイクルのキネティックアッセイを実行します。
   7. 生の蛍光データをエクスポートし、GraphPad Prismまたは同等のソフトウェアを用いて、各プラズミン濃度の蛍光増加の初期傾きを決定します。これは、運動曲線の線形位相に線形回帰を適用することです。
   8. 初期傾きとプラズミン濃度をプロットして標準曲線を生成します。
      注:プラズミン活性のバッチごとの変動のため、各新しいロットごとに校正を繰り返し行う必要があります。予想外に高い活性が観察された場合は、校正シリーズを準備する前にストックを1:2で希釈することが推奨されます。
3. 定量化にはキャリブレーションカーブを使いましょう
   1. セクション6で生成された較正曲線を用いて、蛍光傾き値を相対酵素活性に変換します。
   2. 未知の試料を補間するには、キャリブレーション曲線の線形部分のみを使用してください。

結果

ナイメーヘン止血アッセイ(NHA)で得られた代表的なトロンビンおよびプラズミン生成曲線は 図3に示されています。各曲線の信号強度は、同時に測定された通常のプールプラズマ(NPP)サンプルに対するパーセンテージとして表されます。NPPを含むサンプルは、アッセイの有効性を検証し、相互比較性を確保するために、すべてのランに内部管理として含まれています。

図3A、B は、3つの健康対照群と正常なプール血漿(NPP)の結果を示しており、予想されるピーク高さとタイミングを持つ再現可能なトロンビンおよびプラズミン曲線を示しています。これらは正常な止血機能の基準プロファイルとして機能し、成功したアッセイ性能を示します。

図3C,Dは...

ディスカッション

ナイメーヘン止血アッセイ(NHA)は、血小板が少ない血漿におけるトロンビンとプラズミン生成を同時に時間分解で測定できる二重酵素蛍光生成アッセイです。両方のプロセスを単一の井戸に記録することで、二次止血および線維溶解の高解像度の動態解析を可能にします。この二重測定は従来のアッセイに比べて独自の方法論的利点を持ち、凝固因子欠損症、高線溶症疾患、その他の止血平衡障害の研究に成功裏に応用されています。

NHAの信頼性と再現性には、いくつかの技術的側面が不可欠です。これには、正確なピペッティング、試薬の一貫した調製、基質および活性化剤の添加後の即時の蛍光測定開始が含まれます。アッセイ全体で37°Cの温度管理は、酵素活性を維持し有効な動態的指標を確保するために不可欠です。これらの事前分析変数の標準化と試薬取り扱いの一貫性は、技術的ばらつきを最小限に抑えるために重要であり、これは他のグローバルアッセイ^34、35<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>マテリアルズ
塩化二水化カルシウム(CaCl2.2H2O)	メルク	1.02382
セファリン(C.K. Prest 5 APTT試薬キット)	スタゴ	00847	-20 & C.nbspで6ヶ月間安定しています。
蒸留水			開店日を記録してください。開封後1日以内に使用してください。
ジメチルスルホキシド(DMSO)	メルク	1.02950.0500
ヒトα-トロンビン	酵素研究所	HT 1002a	箱には分析証明書付きのリーフレットが入っている。追加するバッファーの量は指定された濃度によって異なり、1 & micro;120およびマイクロ量に添加されたヒトトロンビンL;L試薬は最終濃度76 nmol/Lとなります。
ヒトプラズミン	酵素研究所	HPlas	箱には分析証明書付きのリーフレットが入っている。追加するバッファーの量は指定された濃度によって異なり、1 & micro;1Lの添加ヒトプラズミンを120およびマイクロに含めて;L試薬は最終濃度200 nmol/Lとなります。
通常のプールプラズマ	社内準備	該当しません	氷で冷やしておけば、解凍後3時間は安定しています。
患者血漿	該当しません	該当しません
プラスミン基質(CBZ-L-フェニルアラニル-L-アルギニンアミド)-ロダミン-モルフォリノ尿素	シメレス		-80度で6ヶ月間安定しています。C.
組換えヒト組織因子(TF):イノビン	デイド・ベーリング	B4212	-80度で6ヶ月間安定しています。C.
組換え組織型プラスミノゲン活性化剤(tPA):アルテプラザーズ/アクチリース	ベーリンガー・インゲルハイム		12ヶ月間安定しており、-80度;C.
トリス(ヒドロキシルメチル)アミノメタン(H2NC(CH2OH)3)	メルク	1.08382.2500
トリスナキュラムバッファー、pH 7,4(TBS)	社内準備	該当しません
トリス-NaCl-CaCl2バッファー、pH 7,4(TBS-Ca)	社内準備	該当しません
トロンビン基質 Bz-β-Ala-Gly-Arg-7-アミノ-4-メチルクマリン	シメレス		-80度で6ヶ月間安定しています。C.
<ストロング>装備
Fluostar Optima 蛍光計/マイクロプレートリーダー(温度制御および試薬インジェクター付き)	BMGラボテック
96ウェルマイクロタイタープレート、ポリスチレン、フラットボトム、黒色、中程度の結合面(マイクロロン相当)	グライナー・バイオワン	655076
解析的バランス(トップローディングバランス)
青いピペットの先端(100-1000およびマイクロ用;L)
シトレート血液採取チューブ 3mL(3.2% シトレート)	BDバキュテイナー
アイスバケツ
製氷機
インキュベーター/マイクロプレートシェーカー
磁気攪拌器
マイクロ遠心分離機チューブラック
マイクロ遠心分離機管、閉じられる
pHメーター
ピペットチップ0.1-10およびマイクロ;L、非無菌
ピペット(2、10、20、100、1000およびマイクロ;L)
ドライバー(プローブとして使用)
真空管ミキサー
水浴
黄色いピペットの先端(20-200およびマイクロ用;L)