方法論記事

原始生殖細胞移植 による 鶏の生殖細胞系キメラ生成の段階的手順

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DOI：

10.3791/69704

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2025年12月5日

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

この記事について

サマリー

原始生殖細胞(PGC)を受容者胚に移植することで生成される鳥類生殖細胞キメラは、遺伝子移植、遺伝子編集、種の保全に応用可能です。このプロトコルはPGC単離、 in vitro 増殖、顕微注射、ドナー検証の手順を詳述し、生殖細胞細胞の生成と鳥類バイオテクノロジーの進歩に向けた信頼性の高いプラットフォームを提供します。

要約

鶏における原始生殖細胞(PGC) の移植による 生殖細胞株キメラの生成は、鳥類の遺伝子導入、ゲノム編集、種の保全において堅牢かつ再現性の高いプラットフォームを提供します。EGKステージX胚からの胚胚細胞を用いた従来のアプローチは、細胞系統の早期分離により生殖細胞の伝達効率が低いことに制限されています。これに対し、PGC媒介の戦略はこれらの一能性細胞の内在生殖細胞能力を利用し、受容性腺への信頼性の高い組み込みを可能にします。ここでは、HHステージ26〜28胚からPGCを分離し、 vitroで維持・増殖し、HHステージ14〜17の受容者胚の背側大動脈に移植するための段階的プロトコルを示します。短期的な移植はPKH26などの蛍光マーカーを用いて監視され、長期的な生殖細胞寄与は受主性腺のPCR解析で確認されます。このアプローチは、ドナーPGCの生存可能性と機能能力を維持しつつ、生殖細胞株キメラの一貫した生成を保証します。さらに、CRISPR/Cas9やトランスポゾンベースのベクターなどのゲノム編集ツールと互換性があり、トランスジェニックおよび遺伝子編集された鳥モデルの作成が可能です。基礎研究を超えて、この戦略は種間生殖細胞の伝播や遺伝資源の保存を通じて保全活動を支援しています。全体として、このプロトコルは鳥類生殖細胞を操作するための包括的かつ信頼性の高い枠組みを提供し、家禽バイオテクノロジーの基礎研究と応用研究の両方に多様なプラットフォームを提供します。

概要

原始生殖細胞(PGC)媒介による生殖細胞の伝達は、鳥類において遺伝情報を次世代に伝達する最も効率的な方法です1,2,3。生殖細胞由来の細胞と宿主由来の生殖細胞の両方を持つ個体と定義される生殖細胞細胞は、ドナー遺伝物質を子孫に伝達し、トランスジェニシス、機能ゲノミクス、絶滅危惧種の保全に応用を支持します。胚胚葉細胞に依存するアプローチとは異なり、PGC媒介の戦略は生殖細胞の伝達効率と再現性が高く、精密な遺伝子操作に適しています。

鳥類種では、PGCは胚胚葉の中央ペルシダ領域であるエヤル・ギラディおよびコハヴ(EGK)ステージX9 に起源を持ち、その後ハンバーガー・ハミルトン(HH)ステージ410で胚胎三日月へ移動します。HHステージ9から12の間、PGCは胚性血管 を経 由して循環し、その後ゴナダルリッジ11、12、13に定着します。これらの独特な移動パターンにより、胚状三日月、循環血液、生殖腺など複数の段階でPGCを分離することが可能です。特に、HHステージ26-28の生殖腺から採取し、HHステージ14-17の受容者胚に移植したPGCは、最適な生殖細胞の能力と移植効率を示しており、このプロトコルの標準化された適用のための実用的な枠組みを提供しています。

PGCは生殖細胞の同一性と伝播能力を保持しつつ、in vitroで維持・増殖でき、安定した遺伝子改変に利用することが可能です。PGC介在生殖細胞系キメラ生成は、組換えタンパク質を発現する遺伝子組換え鳥の生成、生殖系統の痕跡、性決定経路の操作、感染症への抵抗性付与(6,15,16,17,18,19)に用いられています。さらに、PGC移植は絶滅危惧種の鳥類遺伝資源の種間生殖系統伝達と保存を促進し、PGCの凍結保存は長期的な遺伝資源保存を可能にします。

胚性幹細胞(ESC)26,27,28,29、誘導多能性幹細胞(iPSCs)30,31,32、精子形成幹細胞(SSCs)33,34など他の幹細胞タイプも鳥類生殖細胞の修飾として研究されていますが、これらの生殖細胞の伝達効率は、現在最も高水準と考えられているPGCベースのシステムに比べて依然として低いままです生殖細胞に適合する細胞の信頼できる供給源。

生殖細胞由来のキメラ研究では、ドナー由来の生殖細胞と宿主由来細胞を区別するためにドナー品種の選択が極めて重要です。韓国オギエ鶏(KOC)は、黒い皮膚と羽毛を特徴とする劣性i/i対立遺伝子を持ち、これは優性のI/I対立遺伝子35,36を持つホワイトレグホーン系統と容易に区別できます。この目に見える差異により、生殖細胞の伝播解析時にドナー由来の子孫を明確に識別できるだけでなく、KOCの在来遺伝的価値により生物多様性の保全も支援しています。

総じて、PGC媒介による生殖細胞キメラ生成は、鳥類バイオテクノロジーの堅牢なプラットフォームを提供します(図1)。最適なドナー(HH26-28)および受容者(HH14-17)段階を指定し、定義された培養および検証ステップを取り入れることで、このプロトコルは効率的な生殖系統伝達を可能にし、トランスジェニックおよびゲノム編集された鳥類の生成、さらに貴重な鳥類遺伝資源の保存のための実用的な枠組みを提供します。

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プロトコル

鶏を対象としたすべての処置は、韓国ソウル大学実験動物資源研究所(IACUC承認番号:SNU-250226-4)によって承認されています。動物は管理された衛生的な環境で管理され、消毒水と飼料が提供されました。さらに、トリプシン/EDTA溶液、PKH26標識細胞、胚性または性腺組織を含む処置中に発生したすべての化学廃棄物および生物廃棄物は、ソウル大学の機関バイオセーフティおよび有害廃棄物管理ガイドラインに従って取り扱い・処分されました。このプロトコルで使用されるすべての試薬および装置は 材料表に記載されています。ドナー胚からの性腺採取や細胞培養に使用されるPGC培地および試薬は無菌でなければなりません。

1. 鶏のPGCの分離

  1. 新鮮な受精鶏卵をエヤル・ギラディおよびコハブ(EGK)ステージXで37°Cで5.5日間培養し、胚がHHステージ26〜28に達するまで続けます。
    注意:正常な胚の発育を確保するために湿度を60%〜65%に保ちましょう。
  2. HHステージ26〜28の卵子から胚を無菌鉗子を用いて慎重に分離します。
  3. 胚を1×PBSで洗浄し、その後炭皿に置き、昆虫ピンで固定します。立体顕微鏡を使い、鋭く削った鉗子を使ってペアになった胚性腺を慎重に解剖します。
    注意:組織を優しく扱い、損傷を防ぎ、生殖腺の正確な隔離を確保してください。HHステージ26〜28で中腎臓に近接しているため、少量の腎組織が誤って採取されることがあります。しかし、立体顕微鏡による慎重な解剖と選択培養条件により、PGCのみが増殖し純度が保たれます。
  4. 3つの胚から採取した対になった生殖腺を、0.05%トリプシン/EDTAを含む500μLの1.5mLチューブに移し、37°Cで5分間インキュベートして細胞を解離させます。
  5. 50μLのFBSを加えてトリプシンを不活性化します。
  6. 200 × g の遠心分離機で室温(約20〜25°C)で5分間細胞ペレットを乱さないように上清液を慎重に除去してください。
  7. 解離した性腺細胞を1 mLの1× PBSに再懸浮させます。

2. 鶏のPGCの in vitro 増殖

  1. PGC培養培地(KO-DMEMに20%FBS、2%チキン血清、ヌクレオシド、グルタMAX、MEM非必須アミノ酸、2-メルカプトエタノール、10 mMピルビン酸ナトリウム、抗生物質-抗菌剤、10 ng/mL bFGF)を準備し、培地を37°Cまで加熱します。
  2. HHステージ26-28の3つの胚から採取した解離性腺細胞(胚あたり約100-150 PGC、37,38)をウェルごとに1mLの予温培養培地に加え、細胞を12ウェルの培養プレートにプレートします。
  3. プレートを優しく揺らして細胞の均一な分布を確保してください。
  4. PGCは37°C、CO₂5%で維持し、形態と細胞密度を毎日監視してください。PGCは丸く屈折し、通常は浮遊している一方で、体細胞は付着しています(図2A)。
    注:培養条件はPGCの増殖を選択的に支持し、PGCが増殖しつつ体細胞が徐々に排除されることを可能にします。
  5. 12ウェルプレートで培養されたPGCは、最適な増殖と生存率をサポートするために3〜4日ごとに培地を交換することで維持されます(図2B)。
  6. オプションとして、PGC特異的マーカー(例:CVH、DAZL、NANOG、POUV)を使用して純度を検証し、PCRによる性判定を行うことも可能です(表1)。
    1. 製造元の指示に従い、RNAミニプレップシステムを用いてPGCサンプルをRNA抽出のために準備します。
    2. 標準プロトコル39(図2C,D)に従い、RT-PCR(例:CVH、DAZL、NANOG、POUV)またはPGC特異的マーカー(SSEA1およびDAZL)を用いた免疫染色を行います。
    3. 標準プロトコル40 (図2E)に従ってPCRの性判定を行います。

3. PKH26標識を用いた培養PGCの生殖細胞系能力の検証

  1. PGCはログ成長段階に達した時点で収穫し、通常は12ウェルプレートの1-5セル× 105セルあたりの密度で行われます。
  2. 細胞を室温(約20〜25°C)で200×gで5分間遠心分離し、1×PBSに再懸浮させ、トリパンブルーで生存可能性を評価します。
  3. PKH26赤色蛍光細胞リンカーキットから希釈剤Cを製製し、一般的な細胞膜標識用に室温(約20〜25°C)まで平衡させます。
  4. PKH26染料を再合成し、最終濃度約1〜2μMの希釈液Cで作動溶液を準備します。
  5. PGCペレットを1 mLの希釈剤Cに再懸浮させます。1 mLのPKH26溶液(1:1比率)を素早く加え、優しく混ぜて室温(約20-25°C)で2〜5分間培養します。
  6. 細胞懸濁液に1 mLのPKH26作動溶液を素早く(1:1の比率)加え、ピペッティングで優しく混合し、室温(約20-25°C)で2〜5分間培養します。
    注意:推奨される潜伏期間を超えないでください。
  7. PBSにFBSの2〜4倍の体積、または1%〜5%のBSAを加えて染色を止めましょう。
  8. 遠心分離機で200 × g、室温(約20-25°C)で5分;PGC培養培地またはPBS1×+0.1%BSAで3回洗浄します。
  9. 細胞を注入バッファー(PGC培養培地または1× PBS + 0.1% BSA)に1-5 × 1×0 〜 1 〜 105 セル/μLの濃度で再懸浮させます。生存率を保つために短時間氷上に置いてください。
  10. 注入前に蛍光顕微鏡でラベルを確認してください(図3A)。
  11. トリパンブルーを用いてカウントした3,000個以上の活発な標識PGCをHHステージ14-17の胚に注入し、6日目までインキュベートします(図3B)。
  12. 6日目までに受容性腺の定着を確認しましょう(図3C)。

4. ドナーPGCを受容者の胚性血管に移植する

  1. 受主卵はHHステージ14-17(37°C、湿度60-70%、1時間ごとに45°で揺れます)まで抱卵します。
  2. ホウケイ酸ガラス管(外径1.0mm、内径0.5〜0.75mm)を用いてガラス毛細管マイクロピペットを準備します。マイクロピペットプラーを使って毛細管を引き抜き、先端を内径約10〜20μmまで研磨します。
  3. 卵子の先端に小さな窓(約0.5cm×0.5cm)を作り、胚への刺激を最小限に抑えつ顕微注射が可能にします。
    注意:窓を開ける前に、汚染を防ぐために卵殻表面を70%エタノールで滅菌してください。
  4. 立体顕微鏡下で背側大動脈に3,000個以上のPGCを1×PBSまたはHBSSで含む懸液2μLを注入します。
    注意:胚や血管を傷つけないように立体顕微鏡で注射を行い、損傷を防ぐために顕微注射針を慎重に操作してください。
  5. 卵の窓をパラフィンフィルムで密封します。卵の先端を下に置き、37.5°C、湿度60〜70%で孵化させ、1時間ごとに45°で揺らします。
    注意:胚の生存と成功した発育を確保するために適切な温度と湿度を保ちましょう。

5. 生殖細胞キメラの検証

  1. 孵化後のG0ヒナから精巣や卵巣を採取してください。
  2. 採取した性腺組織からゲノムDNAを抽出し、生殖細胞細胞キメラ形成を確認する。採取した性腺組織から以下の方法でゲノムDNA抽出を行います。
    1. 精巣または卵巣組織を採取し、1.5 μLのプロテナーゼKを含む300 μlの溶解バッファー(2 mM Tris-HCl(pH 8.0)、10 mM EDTA、1% SDS)で均質化し、60°Cでhで培養して完全な溶解を保証します。
    2. タンパク質沈殿液100μL(7 M酢酸アンモニウム)を加え、よく混ぜて12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
    3. 上清液(水相)を新しいチューブに移し、500μLのイソプロパノールを沈殿DNAに加え、12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
    4. 上清液を捨て、70%エタノール1mLを加え、12,000× g で4°Cで10分間遠心分離します。
    5. エタノールを取り出し、DNAペレットを室温で10分間自然乾燥させます。
    6. DNAを50μLのRNaseフリー水で洗出し、分光光度計(A260/A 280 ≈ 1.8)でDNA濃度と純度を測定します。
    7. DNAをPCR反応あたり10〜5 ngに調整してください。
  3. 以下の条件下で設計された種特異的プライマー(表1)を用いてPCR増幅を行います:94°Cで3分間、その後94°Cで30秒、68°Cで30秒、72°Cで30秒、最後に72°Cで5分間延長します(図4A)。
  4. 性的に成熟したG0オスから精液を採取し、同じプロトコルで精子DNAを抽出し、種特異的プライマーを用いてPCRを行います(図4B)。

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結果

チキンPGCのin vitro増殖と特徴付け
PGCを含む全性腺細胞はHH期26-28の胚から単離され、定義されたPGC培養条件下で培養されました。時間の経過とともに、性腺間質細胞は培養表面に付着するか分解を経て、PGCは懸濁状態のままで活発に増殖し始めました(図2A)。約2週間の培養後、PGC集団は1×10〜5 細胞以上に拡大し、これらの定義された条件下でPGCの強力な増殖と選択的濃縮を示しました(図2B)。

培養細胞の生殖細胞の同一性を確認するため、生殖細胞特異的マーカーを用いたRT-PCR解析と免疫細胞化学が行われました。RT-PCRの結果により、培養PGCsにおけるDAZL、CVH、NANOG、POUV遺伝子の発現が示されました(図2C)。一貫して免...

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ディスカッション

培養された原始生殖細胞(PGC)を受容者胚に移植することは、鶏の生殖細胞キメラを確実に作製する方法を提供します。このプロトコルはPGCの内在生殖細胞系ポテンシャルを活かし、モザイク現象や発生変動が起こりやすい従来の胚胚葉ベースのシステムと比べて実験の一貫性を向上させます。この方法の重要な利点は、定義された培養条件下でPGCを選択的に in vitro で増殖できることであり、これにより胚細胞の同一性が維持されます。培養期間を通じて、PGCは特徴的な形態を保持し、高い増殖率を示し、CVHやDAZLなどの生殖細胞特異的マーカーを発現して未分化状態を確認します。

胚発生段階の正確な制御は、成功する着床に不可欠です。HHステージ14〜17のウィンドウは最適です。なぜなら背側大動脈が完全にアクセス可能であり、性腺隆起が定着しやすいからです。この窓の外に胚を注入すると、ドナー細胞が生殖腺ニッチに効率的に到達できず、生殖細胞の寄与が減少する可能性があります。したがって、段階は孵化時間だけでなく形態的ランドマーク...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)助成金[RS-2024-00418297]および韓国農村開発庁の農業科学技術開発協力研究プログラム[RS-2025-02213489]の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1xPBS ハイクローンSH30256
2-メルカプトエタノールギブコ21985023
抗生物質抗菌液(100X)ギブコ15240062
抗DAZL抗体アブカムAB215718
チキンセラム 無菌ロックランドD102-00-0500
牛の膵臓からのデオキシリボヌクレアーゼIシグマ・オルドリッチ9003-98-9
ドラムモンド・マイクロキャップ使い捨てマイクロピペット ドラモンド・サイエンティフィック・カンパニー1-000-0500
EmbryoMaxのヌクレオシド(100X)メルクES-008-D
FBS(胎児牛の血清特性解析、米国産、500ml)ハイクローンSH30919
グルタMAXサプリメントギブコ35050061
ノックアウトDMEMギブコ10829018
MEM非必須アミノ酸溶液ギブコ11140050
パラフィルムMラボラトリーフィルムアムコアPM996 
一般的な細胞膜標識用のPKH26赤色蛍光細胞リンカーキットシグマ・オルドリッチPKH26GL-1KT
精製抗マウス/ヒトCD15抗体(SSEA-1)バイオレジェンド125602
組換えヒトFGF塩基性/FGF2/bFGF(146 aa)タンパク質 R&Dシステム 233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsプロメガZ6011
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)ギブコ11360070
トリパンブルー溶液シグマT8154-100ML
トリプシン-EDTA(0.5%)、フェノールレッドなしギブコ&トレード;15400054

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