方法論記事

ラット橈骨骨折の新規内固定モデルの開発:骨折治癒評価と背根神経節の分離

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DOI：

10.3791/69707

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2026年3月13日

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1Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Nantong Tongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Institute of Modern Biology, Nanjing University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、ラットの橈骨骨折モデルにおいて、縫合糸とチタン針を革新的に組み合わせて安定した内固定を実現しています。骨折治癒はマイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)で評価され、一次背根神経節(DRG)ニューロンを単離して培養し、さらなる調査を図りました。

要約

ラットの橈骨骨折モデルは整形外科研究において非常に重要であり、特に骨折治癒機構の研究、薬物スクリーニング、生物学的材料の評価に活用されています。いくつかの制約はあるものの、科学研究におけるその役割は依然として代えがたいものです。ラットの半径が比較的小さいため、現在臨床で使用されている鋼板やネジはラットの橈骨骨折の治療には適していません。この制約に対処するため、本研究は縫合およびチタン針固定法を革新的に用いています。これは比較的安定した固定を提供する橈骨骨折の内部固定モデルであり、内固定を研究するための堅牢な動物モデルを確立します。生体内画像診断は、Sprague-Dawley(SD)ラットにおける橈骨骨折の治癒を検出するために、生体動物マイクロCTシステムを用いて実施されました。ラットDRGの抽出と応用は神経科学研究において重要なステップであり、神経科学、病理学、細胞生物学などの分野で広く利用されています。このプロトコルは、橈骨骨折ラットの背根神経節ニューロンの一次培養に適しており、神経損傷や骨折後の神経損傷や神経伝達物質の放出などの修復メカニズムの研究にも用いられます。

概要

橈骨骨折は最も一般的な臨床骨折の一つであり、世界的にかなりの発生率を持ち、四肢の長骨骨折の主な原因の一つです。集団研究では、橈骨骨折の二峰性年齢分布が明らかになり、小児および高齢者の両方でピークを迎えます。治療の遅れは前腕の回転機能障害を引き起こし、日常生活活動(ADLs)に著しく障害をもたらすことが多く5,6。橈骨骨折管理には論争が続いており、主に骨折分類システムと治療法の選択を中心としています7,8。臨床的証拠は、開放内固定(ORIF)が肘または手首の関節可動域(ROM)および筋力回復を著しく改善することを示唆しています。しかし、このアプローチは術後感染や内固定関連合併症の発生率が高いことと関連しています10,11。

DRGは末梢神経系と中枢神経系(CNS)間の感覚情報伝達のための重要な解剖学的かつ機能的な架け橋として機能します。DRGは主に末梢感覚信号(触覚、温度)の収集と伝達に従事するだけでなく、痛みなどの異常感覚を積極的に調節するため、正常な感覚機能と臨床疼痛管理の両方の基盤となる重要な構造となっています(12,13,14)。DRGにおける損傷、炎症、神経変性などの病理学的変化は感覚異常(例:しびれ、チクチク)や慢性的な痛みを引き起こすことがあり、神経科学や痛み医学の研究の中心的存在となっています。

本研究では、約200gの生後8週齢の雄SDラットを選定し、(1) ラットの橈骨横断の内固定モデルとその後の治癒後評価、(2) 橈骨骨折の内固定モデルを持つラットからDRGの分離および in vitro 培養を行いました。このプロトコルは、骨折治癒機構、DRG介在感覚変化、骨折後の痛みや機能障害の治療対象を探る研究において再現可能な実験を促進することを目的としています。

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プロトコル

すべての動物実験は南京中医科大学動物倫理委員会(No. 202508A046)によって承認されました。以下のアッセイで用いられたすべてのラットは、特定の病原体フリー(SPF)条件下で維持されました。プロトコルを表す回路図は 図1に示されています。

1. ラットの橈骨骨折に対する内固定モデルの確立

注:ラットは手術前に静かで柔らかく拡散した照明に慣れ、騒音や強い照明から身を守っていました。取り扱い中、ラットの腹部と胸部は優しい手で固定され、尾を掴むことは痛みや苦痛を招き、抵抗に伴う不快感を軽減することで避けられました。

  1. 図2に示すように手術器具を準備します。手術器具には、メス用刃、メスのハンドル、手術用ハサミ、針ホルダー、止血鉗子、歯型組織鉗子が含まれます。オスのスプラグ・ドーリー(SD)ラットは生後約8週間で、体重は約200gでした。
  2. イソフルランガス麻酔装置でラットを麻酔します。誘発時には4%イソフルランを使用し、手術中は鼻のコーンを使って人工呼吸麻酔(2%イソフルラン)を維持します。手術室の温度は約28°Cに保ってください。
    注意:麻酔の成功を判断するには、バイタルサイン(呼吸や心拍数など)、角膜反射(反応なしは効果的な麻酔を示す)、まばたき反射(なし)、足の指収縮反応(刺激後に引っ込めない)をチェックします。
  3. ラットを横向きに置き、右前肢を露出させ、ヘアクリッパーで毛を剃ります。無菌シートを貼り、右前肢の近位部に止血帯を巻いて手術出血を抑えます。
  4. アルコールとベタジンのスクラブを交互に3回入れて皮膚を準備します。
  5. 右前腕の背側橈骨側に縦方向に1.5cmの切開を入れます( 図3参照)。筋肉の隙間を分けて、右前肢の半径を完全に露出させます。
    注意:橈骨は筋肉間隙に沿って筋肉を鈍く分離することで露出します。橈骨の背側筋だけが露出し、周囲の筋肉を完全に剥がすことはありません。
  6. 手術用のハサミを使って半径を切り、横断骨折を作ります。ハサミは半径に対して90度の角度で配置されています(図4参照)。
  7. 直径0.8mm、長さ10mmのチタン針を取り、縦軸に沿って半径断裂に挿入します(図5)。 図6に示すように、半径とチタン針を縫合糸(4-0[1.5メートル]の非吸収性編み糸)で固定します。
  8. 縫合糸を3本連続で結び、チタン針を4本の中断縫合で橈骨に固定します。
    注:骨折の近位端と遠位端はそれぞれ2回固定されています。
  9. 皮膚を縫合(4-0[1.5メートル]の絹編みで吸収性に欠け、余分な縫合糸を切り取り、傷口を閉じます。ベタジンのスクラブで皮膚を消毒してください。
  10. 傷口を滅菌ガーゼで覆い、包帯で固定してください。意識を取り戻すまでネズミを檻に入れて回復させてください。
  11. 術後の痛み管理:
    1. 動物が痛みの兆候を示したり、食事をしない、または後肢で歩くのをためらう場合は、獣医師に相談し、追加の鎮痛剤を投与してください。
      注:セフロキシムナトリウムは細菌感染症の治療に使用されます。鎮痛剤の投与にはトラマドール塩酸塩が使用されます。

2. マイクロCTイメージング

  1. イソフルランガス(誘導用量4%)麻酔装置でラットを麻酔します。
  2. スキャンチャンバー内でラットを伏せにし、四肢と頭部の位置を調整して標的スキャン領域の視野の中心にし、手順中は継続的な換気と麻酔(2%イソフルラン)を維持します。
  3. 固定された動物ベッドをスキャンチャンバーに押し込み、チャンバーの扉を閉めます。
  4. マイクロCTスキャンパラメータを以下のように設定します。スキャンモード:標準;露光時間:2分;視野角:72 mm;ボクセルサイズ:144 μm;電圧:90 kV;電流:88μA;フィルター:3Dソフト。
    注:スキャンデータは自動的にソフトウェアに送信され、三次元CT画像が生成されます。
  5. 標的組織を分離してください。
    1. 元のマイクロCT画像から選択された骨組織領域を解析します。伝達関数のラインをスライドさせて骨を筋肉から切り離し、筋肉組織を過剰に含まないようにします。分割された骨組織領域で高解像度再構築を行い、3Dモデルを作成します。
  6. 処理済み画像をエクスポートします。
    1. 画像を処理した後、 終了 ボタンを見つけて現在のワークフローを最終決定します。
    2. ポップアップウィンドウが表示されます。まず 「静止 画像」を選択して、静止画像(動的シーケンスではなく)をエクスポートしたいか確認してください。
    3. 利用可能なオプションから jpeg を出力ファイル形式として選択してください。
    4. エクスポート画像が解析やドキュメントに適した高解像度を保つように 、大きなサイズ を選択してください。
    5. エクスポートプロセスを完了するには OK をクリックしてください。

3. 橈骨骨折ラットにおけるDRGの単離および培養

注:安楽死は4%イソフルラン吸入麻酔と共に行われ、その後急速な子宮頸部脱臼を施して動物を安楽死させます。放射状破壊モデル確立から20日後にDRGを抽出します。

  1. 脊椎を切断し、C1-C7椎骨を切除します。頸椎を前後の正中線に沿って切り、左右に分けます。必要に応じて、手術を容易にするために棘突起を切断してください。
  2. 椎間孔内の脊髄組織と神経線維を優しく洗浄してください。PBS入りの注射器で椎間孔をすすいで血液を取り除き、外側の凹みを露出させます。
    注:DRGは外側の凹みの内側に位置し、淡黄色の結節として現れ、両端で神経線維が接続されています。
  3. 歯型の鉗子でDRGを持ち上げ、優しく持ち上げてから、手術用のハサミで両端の神経線維を切断します。
  4. 抽出したDRGを抽出培地付きの1.5 mL遠心分離機管に移します。冷やしておいて。
    注意:抽出培地には、α-Minimum Essential Medium(α-MEM)に2%胎児用牛血清(FBS)を加えて準備してください。DRGは抽出培地内で約30分間インキュベートされ、その後次のステップに進みます。
  5. ゆっくりと吸引して抽出液を捨てます。混合消化酵素作動液を1mL加えます。37°Cの水浴で60〜70分消化します。
    注:混合消化酵素作動液を調製するには、100mgのI型コラーゲン酵素と100mgの分散酵素を1mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶かします。使用時は、5 mg/mLの作動液に希釈して氷で保存してください。
  6. 適切な量のフィブロネクチン作動溶液をピペットでピペットで覆い、37°Cで1時間培養します。
    注:ヒト血漿フィブロネクチン作動液(フィブロネクチン作動液)は、1 mg/mLのフィブロネクチンストック溶液をddH₂Oで希釈して0.02 mg/mLのフィブロネクチン作動液に製造します。
  7. 消化後は、混合消化酵素の作動液を吸引して捨てます。完全な培地1mLを加え、DRG組織を数回優しくピペットで移動させます。
    注:完全な培地を製製するには、MEM-α培地45 mL、FBS培地4.5 mL、ペニシリン・ストレプトマイシン(PS)溶液0.5 mLを混合し、0.22 μmの滅菌グレード微細多孔膜でろ過して滅菌します。
  8. ろ過液を回収し、75× g で遠心分離機で25°Cで8.5分間処理します。
  9. 遠心分離後、上清液を吸引して遠心分離管内に捨て、1mLの完全な培地を加えて沈殿物を再懸濁させます。
  10. ペトリ皿を取り出して。フィブロネクチンの作動液は捨ててPBSで2回洗いましょう。
  11. 細胞をコーティングされたペトリ皿に接種し、1mLの完全な培地を加え、定温インキュベーターで37°C、5%のCO₂で8〜12時間培養します。
  12. 8〜12時間後、完全な培地を交換用培地に替えてください。その後、2〜3日ごとに体積の半分を代替培地に置き換えます。
    注:代替培地を準備するには、MEM-α培地44.5 mL、FBS 4.5 mL、ペニシリン・ストレプトマイシン(PS)溶液0.5 mL、デオキシウリジン0.5 mLを混合します。0.22μmの滅菌グレードの微細多孔膜を通してろ過して滅菌します。

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結果

マイクロCT画像により、 図7 の橈骨骨折ラットモデルと 図8のラット骨根骨折の内固定モデルの確立が成功したことが確認されました。マイクロCT画像は、骨折の内固定モデル構築当日とモデル確立後20日間の撮影を比較しました。モデリングから20日後、骨折モデル群のSDラットのマイクロCT解析により、良好な予後が示されました。画像には、モデル化された領域にぼやけた骨折線が見られ、骨折部位の骨組織がほぼ治癒していることが示唆されました。骨折端間にタコが形成され、徐々に融合して骨折線がさらに見えなくなりました。これは骨結合の中期から後期段階と一致しています。特に骨折部位の周囲には顕著なタコの形成も見られました。治癒過程で新たに形成される骨組織として、タコは骨折端を安定させ、最終的な結合の基盤を築く役割を果たします(図8)。ラットの橈骨骨折の内固定モデルを確立するために10匹のラットを用いました。骨折手術後...

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ディスカッション

橈骨骨折は臨床において最も一般的な長骨骨折の一つです。その治癒過程は、骨組織修復と神経調節(例えば、神経ペプチドや背根神経節から放出される神経栄養因子による骨芽細胞/破骨細胞の調節)の複雑な相互作用を含みます15,16,17,18。ラットは明確な遺伝的背景と短い生殖周期から、骨折治癒のメカニズムを研究する古典的なモデルです。しかし、橈骨の直径が約1.0〜1.5mmしかないという解剖学的特徴により、臨床標準的な内固定装置(1.5mmのスクリューやプレートなど)に適合することは不可能であり、神経骨治癒の研究における応用は著しく制限されています。単純な髄内ピン固定は回転不安定性を起こしやすく、ワイヤー固定は骨皮質を切断する可能性があり、外固定は外傷を増やし局所神経微小環境に干渉します 19,20,21,22,23,24。<...

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開示事項

すべての著者は潜在的な利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は江蘇省伝統中医学会の科学研究プロジェクト(XYLD2024038年)および南通保健福祉委員会の科学研究プロジェクト(QNZ2023115年)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5-フルオロ-2'デオキシウリジンシグマF0503
セフロキシムナトリウム 山東潤澤製薬有限公司、中国国耀準子H20205058
DAPI染色ソリューションバイヨタイムC1005
分散上海元業バイオテクノロジー有限公司S25046
胎児用牛血清(FBS)熱力学16000-044
止血鉗子 上海医療機器(グループ)有限公司およびnbsp;J31070
ヒトプラズマフィブロネクチン(ヒトフィブロネクチン) シグマF0895
イソフルラン後輪駆動R510-22-10 
生きた動物マイクロCTイメージングシステムアメリカのパーキンエルマークォンタム GX 
MEM-ALPHA培養培地および注釈;BIC3060
ニードルホルダー 上海医療機器(グループ)有限公司およびnbsp;200622
操作シザーズ&NBSP;上海医療機器(グループ)有限公司およびnbsp;J21130
ペニシリンソーラービオ140051251
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 ノヴァセルN-PSS125
ポビドンヨウ素メイルンビオMB1313800g
メスブレード上海医療機器(グループ)有限公司RYY070
メスの柄上海医療機器(グループ)有限公司およびnbsp;J11010
縫合とnbsp;ジョンソン&ジョンソン医療(中国)有限公司およびnbsp;SA84G
縫合針上海小宇医療機器 &デルタ;3/8 & ミッドドット;3×6
チタン針天津裕通医療機器 2-0X250 
歯型組織鉗子とnbsp;上海医療機器(グループ)有限公司およびnbsp;J41055
トラマドール塩酸塩江蘇九緒製薬有限公司、中国CYHB2201997
チューブリンβ-IIIシグマCBL412X
タイプIコラーゲンゼ 熱力学17100-017
ツァイス アクシオ・ヴェール A1 逆形蛍光顕微鏡ツァイスアクシオ・ヴェール A1

参考文献

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