方法論記事

生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

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DOI:

10.3791/69742

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2026年7月24日

 ,  ,  ,  , 
1Blizard Institute, Faculty of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London

この記事について

サマリー

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。

要約

多重免疫蛍光(IF)染色は、従来のIF画像診断に比べて高度な技術の進歩を示し、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを連続検出可能にします。これにより、より幅広い細胞タイプや組織構造のプロファイリングが可能になり、連続切片では実現できない形でこれらの間の空間的関係の評価が可能になります。老化の普遍的なマーカーは存在せず、老化の特徴は細胞の種類、老化の誘発点、誘導からの時間によって異なることが広く認識されています。したがって、マルチプレックスIFが提供する組み合わせ的アプローチは、単一の組織切片内で偏りのない老化細胞検出を可能にする強力なツールを提供します。

ここでは、34種類のヒト組織のコアを含む組織マイクロアレイが用いられました。これらは構造バイオマーカー、免疫バイオマーカー、老化バイオマーカーの組み合わせで染色され、10重アッセイで染色され、画像は多重スライドスキャナーで取得されました。この方法は組織中の老化細胞の存在比と空間的分布を評価することを可能にします。 連続染色、イメージング、染料不活化サイクルを用いて多重データセットを作成し、画像は多重蛍光スライドスキャンシステムで取得されました。手動スライド準備とスライドステイナーを用いた自動処理のプロトコル、単一セルセグメンテーションおよびデジタル病理ソフトウェアを用いた空間解析について説明しています。 総じて、これらの手法は組織サンプル内の老化関連バイオマーカーの染色、画像診断、空間解析の包括的なガイドを提供するとともに、多重イメージングのより一般的なガイドを提供します。

概要

老化は複雑な末期細胞の運命であり、老化、がん、免疫機能、さらには正常な組織の恒常性1に寄与することが示されています。しかし、老化の普遍的なバイオマーカーは記載されておらず、識別はいわゆるホールマークの範囲の評価に依存しています。IF組織の画像診断は、1つのセクション内で1つまたは2つのバイオマーカーの評価に限られており、同じサンプル内の複数のマーカーの組み合わせを評価することは困難です。この問題は、単一細胞レベルでの老化細胞異質性の出現や、生体内老化の特徴が少なくなっていることによってさらに悪化しています。これにより、新規文脈や貴重なサンプルでは狭い検出パネルの選択が困難になります。

多重IFイメージングは、単一の組織切片内で複数のバイオマーカーを連続的に検出することを促進することで、この制限を克服することを目指しています。これは蛍光標識されたオリゴヌクレオチドリポーターの使用か、蛍光信号を染料不活化プロセスで消滅させる標識付き一次抗体の使用によって実現可能である7。いずれの場合も、シーケンシャルイメージングは空間的に分解されたバイオマーカーのパネルを構築するために用いられ、従来の断食法に比べて連続組織染色において利点があります。これらの複雑なプロファイルを単一の組織サンプル内で生成することで、より多くの老齢表現型、細胞タイプ、組織構造を検出でき、それらの空間的関係や分布を高度に評価することが可能になります7。

しかし、多重化IFイメージングプロファイルの複雑さは従来のIFを大きく超えるものの、実用的な制約によりマーカーパネルは一般的に<100個のバイオマーカーに制限されています3。これには、各ラウンドごとにエピトープ抗原性、シグナル強度、組織の完全性が失われる可能性、そして交差反応性を必ず含まない大規模な抗体の組み合わせを最適化する課題が含まれます8,9。したがって、各抗体ラウンドの最適な組成を決定することは、多重パネル設計において重要な考慮事項です。したがって、全体の「プレックス」は空間転写学のような技術によって達成されるものよりも小さいです。しかし、マルチプレックスIFは転写産物レベルではなくタンパク質を定量化するため、両技術は補完的と考えられ、大規模な「マルチオミクス」パイプラインで組み合わせることができます。

ここでは、34種類の組織のコアを含むヒト組織マイクロアレイが画像化されました。これらは構造バイオマーカー、免疫バイオマーカー、老化バイオマーカーの組み合わせで染色され、10個のアッセイで染色されました:パンサイトケラチン(PANCK)、CD31、α平滑筋アクチン(aSMA)、ケラチン15(K15)、ビメンチン、FOXP3、CD8、Ki67、p16、ラミンB1。スライドの手動準備および自動スライドステイナーによる自動化への適応に関する詳細なステップバイステッププロトコルが提供されています。代表的な実験比較では、後者が組織の完全性を向上させるとともに、大多数のマーカーにおいて蛍光シグナル11の改善が示されています。最後に、HALOデジタル病理ソフトウェアを用いた多重組織マイクロアレイ画像の解析に関するステップバイステップガイドを提供し、単一細胞断片やバイオマーカー発現の空間解析も含まれます。代表的な結果は、バイオマーカーパネルに基づく老化細胞検出と定量化の技術的実現可能性を示しています(老化分類の包括的な生物学的検証とは異なります)。

全体として、この方法論は、 生体内 での老化バイオマーカーの多重評価のガイドとして、また多重化イメージングのより一般的なガイドとして提示されています(図1)。

プロトコル

倫理声明

本研究に含まれる組織サンプルは、バーツ・ヘルスNHSアーカイブの診断要件を超えたものであり、関連する機関および規制ガイドラインに準拠して取得され、倫理プロトコル10/H0704/65および05/QO605/140の下で承認されました。

1. スライド準備、抗原回収およびブロッキング

注:特に明記がない限り、すべての工程は室温(~20〜25°C)で標準的な実験室条件下で行われます。

  1. 初期試料の設置
    1. 最適な組織保持を確保するために、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織サンプルを高品質な顕微鏡スライド(正に帯電)に装着し、新しいパケットから準備して電荷損失を最小限に抑えます。
    2. セクションの厚さは5μm以下で、最大サイズは4×2cm、中央に取り付けてカバーリップレススライドホルダーの観察窓内での視認性を確保してください。
    3. サンプルの準備は、クローク解除チャンバーを使った手動または自動染色装置による自動方式のいずれかで行います。
  2. クローク解除チャンバー
    1. 組織を上向きにして60°Cで24枚まで一晩焼きます。
    2. サンプルを脱ワックスと再水和処理は、キシレンで連続的に5分間インキュベーション(ステップ2回)を行い、各試薬にスライドを完全に浸してエタノール濃度(100%、100%、90%、70%)を下げます。
    3. PBSに5分間浸してスライドを洗い(ステップを2回行います)。
    4. スライドは、PBSで希釈した0.3%のトリトン×100を10分間浸してスライドを透過します。
    5. PBSに5分間浸してスライドを洗います。
    6. 各セクションに以下の試薬を加えてデクロークチャンバーを準備します:
      1. 主チャンバーに500 mL ddH2Oを投与。
      2. 金属製ラックバスケットの中央リザーバー位置に250 mL ddH2Oを注ぎます。
      3. 金属製ラックバスケットの左側リザーバー位置に250 mL pH 6抗原アンマスキング溶液1(ARS1)を投与。
      4. 金属ラックバスケットの右側リザーバー位置に250 mL pH 9抗原アンマスキング溶液1(ARS2)を置き(10倍のストックからddH2Oに希釈)。
    7. サンプルをARS1溶液に浸し、3つの貯留層すべてに蒸気ストリップを敷きます。
    8. 蓋をデクロークチャンバーに置き、ひねって閉じた位置に固定し、圧力放出値が圧力ステムに平らに収まるようにします。
    9. プロトコルを選択して開始し、設定温度110°Cまで設定し、4分間維持します。
    10. 加熱段階で温度インジケーターパネルに70°Cが表示されたら、20分のタイマーを起動します。この期間中にシステムは温度に達し、維持され、圧力を下げ始めます。
    11. ピンセットで圧力放出バルブを慎重に傾けて蓋を開けてシステムを完全に減圧します。水温が達しているか、ストリームストリップを確認してください。
    12. サンプルをARS1溶液からARS2溶液に移します。チャンバーの蓋を戻します(ただしロックや再加圧はしないでください)、タイマーを20分かけます。
    13. スライドを入れたリザーバーバスケットを作業台に外してください。
    14. バスケットは室温の作業台に10分間置いておきます。
    15. PBSに5分間浸してサンプルを洗浄します(この工程を4回繰り返します)。
    16. 10%ロバ血清と0.3%BSAを含むPBSに1時間浸してサンプルを詰めます。
    17. サンプルをPBSに5分間浸して洗浄します。
    18. PBSで希釈したDAPI(1 μg·mL-1)に15分間浸してカウンターステインをします。
    19. サンプルをPBSに5分間浸して洗浄します。
    20. スライドをカバースリップレススライドホルダーに取り付けます。
  3. オートスライドステイナー(例:Bond RXm)
    1. 洗浄剤、ER1およびER2のバルク試薬を下の引き出しに入れます。
    2. システムの電源を入れて初期化してください。
    3. 廃棄物容器は空で、他の試薬は最低レベルを超えていることを確認してください。
    4. 試薬アームは、システムが指定した総スライド数のために必要な量で以下の試薬をポット位置に充填して準備します。
      1. 試薬アームにPBSを充填した試薬の空ポットを挿入します。
      2. PBSで希釈した0.3%トリトンX-100を含む試薬ポットを試薬アームに挿入します。
      3. ブロッキングバッファーを含む試薬ポット(10%のドンキー血清、0.3%BSAにPBS中に挿入)を試薬アームに挿入します。
      4. PBSで希釈したDAPI(1 μg·mL-1)を含む試薬ポットを試薬アームに挿入します。
    5. 試薬アーム全体(準備済み容器用ポット付き)をシステムに挿入します。
    6. 画面上の指示に従い、夜間に実行する以下の手順を含む自動染色プロトコルを作成します。
      1. 60°Cで10時間焼きます。
      2. PBSで希釈した0.3%トリトンX-100でキュベート(10分。
      3. 事前にプログラムされたバルクウォッシュ試薬で洗いましょう。
      4. エピトープリトリーバル1(ER1)バルク試薬(20分、100°C)でキュベートします。
      5. 事前にプログラムされたバルクウォッシュ試薬で洗いましょう。
      6. エピトープリトリーバル2(ER2)バルク試薬(20分、100°C)で培養します。
      7. 事前にプログラムされたルーティンでバルクウォッシュ試薬で3回洗います。
      8. ブロッキングバッファーで培養 - PBSに10%ロバ血清、0.3%BSA(1時間)を投与。
      9. DAPI(1 μg·mL-1 in PBS)を4回、各5分間投与します。
      10. 洗濯(あらかじめプログラムされたルーティン)。
    7. すべての追加ボリュームを150μLに設定し、準備ステップはドロップダウンメニューでワックス除去に設定してください。
    8. 最大30枚のスライドの詳細を追加し、バーコードラベルを印刷できます。
    9. スライドトレイを取り外し、スライドを上向きに挿入します。各スライドの上に上向きのカバータイルを貼ります。バーコードラベルをスライドの上から下まで表示するように貼り付けてください。
    10. スライドトレイをオートステイナーに戻し、フロントトレイのボタンでロックします。
    11. 現在スライドを装填している各スライドアームのスタートボタンを押します。
      注:フルプロトコルの実行には約15時間(ベイク10時間を含む)かかります。水洗いを省くために開始時間を遅らせることもあります。
    12. サイクル終了後、スライドをカバーリップレススライドホルダーに取り付けます。
  4. 装填式カバースリップレススライドホルダー
    1. スライドをカバースリップレススライドホルダーに入れ、上部と右側のエッジが金属製のストップに合うようにしてください。
    2. スライドをプラスチックカム(両方同時に使用)でロックし、閉じた南京錠の位置に回します。
    3. スライドが完全に平らに収まっているか、ホルダー内で揺れていないか確認してください。
    4. 両手でサイドバーをつまみ込み、スライドの上にカバーリップレススライドホルダーのインサートチャンバーを置き、圧力を抑え破損を防ぎます。
    5. コバースリップレススライドホルダーのインレットポートから、PBS中のグリセロール50%を含む2mLのマウントメディアを装填します。
    6. スライドの左側にバーコードラベルをどちらの向きでも貼り付けます。
    7. 画像診断に進みましょう。

2. 多重イメージング

  1. 領域選択と自己蛍光イメージング
    1. 多重イメージング取得ソフトウェア(例:Mx ワークフロー(4.2.0.4))を開いて、プロトコルパブリッシャーウィザードを使って必要なラウンド数/バイオマーカーと露光時間を持つプロトコルを作成します。
      注意:事前に各抗体の割り当てを利用可能なチャネルに割り当てること。弱いマーカー(すなわち、より長い露光時間が必要なもの)は、自己蛍光が最も少ないCy5およびCy7チャネルに限定します。多重蛍光イメージングシステムでは、1ラウンドあたり最大4本の抗体を使用できます。
    2. 仮想H&E画像が必要な場合は、Cy3チャネルを確実に取得してください。
    3. バッチ作成ツールを使って、バーコード番号を使ってスライドをプロトコルに追加し、マルチプレックス実験のワークフローを作成します。
    4. スライドを取得ソフトウェア(4.2.0.4)から顕微鏡に読み込み、各スライドの2倍および10倍の画像処理で興味のある領域を描画するワークフローに従ってください。領域を選択する際は、各視野に少なくとも2つの隣接領域があることを確認してください。これにより、ステッチの問題を防ぎましょう。
    5. 空のガラスの撮影量を最小限に抑え、縫合問題を防ぎ、空のフィールドを選択しないことでランタイムを短縮しましょう。
    6. ステップ2.1.1で設定した露光時間を使って20倍の自己蛍光イメージングを行い、品質管理(QC)ウィザードに従ってください。ピントが合わない部分やアーティファクトがないことを目視で確認してください。これらが特定された場合はQCに失敗し、再イメージ化してください。
      注:許容されるQC厳格度の単一の指標はなく、成功は必要な実験結果とサンプルの貴重度に依存します。十分な染色強度を持つ焦点合いの組織は、理想的には鮮明で視覚的に鮮明に見えるべきです。組織の剥離や劣化が小さな部分で観察されることが多く、追加の画像検査では改善せず、他のサンプルが良好に撮像されていれば許容されます。大きな明るいアーティファクト(例:ほこり)が観察された場合は、スライドを清掃して再イメージングすることでそれらを除去するのが最善の方法です。
    7. 最終的なバイオマーカー信号から差し引く背景画像を作成し、このプロセスは各マルチプレックスラウンドごとに繰り返されます。
      注:すべてのマルチプレックスラウンドは取得ソフトウェアを通じて自動的にアライメントされます。
  2. ロボットプレートハンドラーの使用
    1. 取得ソフトウェアは必ず閉じておきましょう。
    2. ロボット統合ソフトを開き、スタートをクリックします。
    3. スタックされたカバーリップレススライドホルダーを入力スタックに入れます。
    4. 出力スタックが空であることを確認しましょう。
    5. ロボットプレートハンドラー制御ソフトウェア(例:Harmonyロボティクスソフトウェア(3.2.0))を開き、ウィザードに従い、正しいプレートの種類と番号が選択されていることを確認します。
    6. スタートボタンを押すと、プレートハンドラーが顕微鏡を読み込み、スライドバーコードから自動的に正しいワークフロー段階を把握します。
      注意:以下のバイオマーカーイメージングの手順でロボットローダーを使用する場合は、ソフトウェアで「動的に設定された露光時間」オプションをオフにし、あらかじめ設定した露光時間を使用することが不可欠です。
  3. 逐次バイオマーカー染色、染料不活性化および多重イメージング
    1. 13,000 x g の遠心分離抗体を室温で1分間投与し、アーティファクトを抑えます。
    2. 0.3%BSAを含む抗体溶液をPBSで調製します。
      注:最終抗体濃度は変動しますが、1:200の希釈は新しい抗体の最適化の良い出発点です。
    3. コバースリップレススライドホルダーポートからピペットで取り出し、0.01%トゥイーンを含む2 mLのPBSを5分間洗浄します(この工程を3回繰り返します)。
    4. PBSを除去し、PBSで希釈した350μL抗体溶液をピペットでポートに注入して抗体染色を行います。このボリュームは、染色チャンバー内でサンプルを完全にカバーできるように最適化されています。
    5. 作業台の上で室温で1時間孵化します。
    6. カバースリップレススライドホルダーポートからピペットで抗体溶液を除去し、0.01%トゥイーンを含む2 mLのPBSを5分間洗浄します(この工程を3回繰り返します)。
    7. PBSを取り除き、2mLのマウンティングメディアを加えます。
    8. カバーリップレススライドホルダーを顕微鏡に挿入すると、自動のラウンド特異イメージングステップが開始されます。
    9. 完了後は、画面上の指示通りQCステップを進めてワークフローを進めます。
    10. コバースリップレススライドホルダーポートからピペットで取り出し、0.01%トゥイーンを含む2 mLのPBSを5分間洗浄します(この工程を3回繰り返します)。
    11. 7 mL ddH2O、2 mL 0.5M NaHCO3 、1 mL 30% H2O2 を含む不活化染料溶液を新たに準備します。使用直前にこの溶液を準備し、すぐにスライドに塗布してください。
      注意:過酸化水素は適切な検査用PPEを使用して取り扱うべきです。
    12. 作業液にH2O2 を加えた直後にPBSを除去し、各スライドに2 mLの染料不活化剤を加えます。
    13. スライドホルダーのベンチトップで15分間孵化します。
    14. カバースリップレススライドホルダーポートからピペットで染料不活化溶液を除去し、0.01%トゥイーンを含む2 mL PBSで5分間洗浄します。
    15. PBSを取り除き、2mLのマウンティングメディアを加えます。
    16. カバーリップレススライドホルダーを顕微鏡に挿入すると、自動ラウンド特異的な20倍自己蛍光画像撮影を開始します。
    17. 完了後は、画面上の指示通りQCステップを進めてワークフローを進めます。
    18. 必要なラウンド数やマーカーを回数で、ステップ2.3.1から2.3.17まで繰り返します。(この手技はメーカーによって最大10発まで検証されていますが、組織の完全性がこの制限の主な決定要因となります。)

3. デジタル病理ソフトウェアによる自動ハイプレックス解析

  1. データの読み込みとTMAのセグメント化
    1. 多重化されたIF画像をデジタル病理ソフトウェアの「研究」タブにドラッグ&ドロップします。
      1. バーチャルH&E画像は別途インポートする必要があります。
    2. 組織マイクロアレイ(TMA)サンプルの場合は「TMAモジュール」を使用します。これによりコアごとにラベル付けが可能となり、スライド全体を扱うよりもデータの追跡がはるかに簡単になります。
    3. TMAブロックを作成するには、まずブロックアクションに移動して新しいTMAマップを作成します。
      1. これは手動入力でも、インポートウィザードのExcelスプレッドシートで入力することも可能です。
    4. 研究タブでサンプルを右クリックし、「TMAをセグメント化する」を選択してTMAをセグメント化してください。
    5. コアのサイズを選び、赤いボックスを動かしてマップに合わせます。完了したら「保存」をクリックします。
    6. 分析やデータエクスポートは、コアごとに実行できるようになりました。
      注:以下のパイプラインはTMAモジュールを使わずに全組織切片でも実行可能です。
  2. 単一ターゲットのセグメンテーション
    1. 分析タブに移動します。
    2. 「設定アクション」ドロップダウンメニューで「ロード」をクリックしてHighPlex蛍光分析モジュールを選択してください。
      1. これらの結果にはv5.2.2が使用されました。
      2. 染料選択では、評価中のマーカーを手動または「オートフィル染料」機能で入力してください。
      3. 核検出では、HALOのバージョンに適したセグメンテーションタイプを選択します(ここでは伝統的な非AIバージョンを説明します)。
      4. 核の接触を検出するために核のコントラスト閾値を設定します(通常は0.4〜0.6の範囲)。
        1. 核を捕捉するための最小核強度(通常は0.05以下に抑え)を設定してください。
        2. DAPI信号の強度に応じて最大画像明るさを約0.4に下げます(16ビット画像のダイナミックレンジのため1から減少)。
        3. 組織の種類に応じて、セグメンテーションの積極性、充填穴、サイズフィルターなどのパラメータをさらに調整してください。
      5. このプロセスを膜および細胞質の検出でも繰り返します。
        1. 従来の細胞質検出では、カラー半径が2から5の間で良い出発点となることが多いです。
  3. バイオマーカー陽性閾値選択
    1. 染料選択段階で選ばれたすべてのバイオマーカーは、生の強度値で測定されます。
    2. 各マーカーに対して二値(陽性・陰性)または複数(高・中・低・負)の閾値分類を設定し、染色パターンに応じて核、細胞質、膜の区画のスライダーを使って値を調整します。
      1. 2値の閾値を設定するには、下のスライダーだけを調整してカットオフ値を決定します。
      2. 「分析」メニューのリアルタイムチューニングウィンドウを使い、分析マスクのオン・オフを切り替えて生の染色レベルと比較してパフォーマンスを評価できます。
    3. 「表現型」機能を使ってマーカーの組み合わせを作成します。
      1. 論理ゲーティングはすべてのマーカーに対してAND/OR正負を含み、すべてのステインに無限のマトリックスを構築できます。
    4. 単一ターゲットデータが必要な場合(空間解析に必要)、ストアオブジェクトデータをtrueに設定してください。
    5. プロトコルを保存し、研究タブですべてのスライドを選択して解析、右クリックして希望するプロトコルで解析してください。

4. 結果のレビュー

  1. デジタル病理ソフトウェアにおける空間評価
    1. すべての結果はデジタル病理ソフトの「結果タブ」でご覧いただけます。
    2. 上部の要約表は、現在の画像全体の特徴の平均となります。
      1. これは単一コアを別々に開けた場合の話です。
    3. 下の表には各特徴の単一ターゲットデータが表示されます。
      1. テーブルから選択するか画像をクリックして個別のデータポイントを照会できます。
    4. 適切な列に表現型、マーカー陽性、または強度の閾値をフィルターしてください。これらは「オブジェクトアクション」>「プロット」>「空間プロット」へナビゲートすることでプロットできます。
    5. 複数のグループに対してこれが完了すると、空間解析が実施されます。
    6. 「空間分析」ボタンを選択し、必要に応じてオプションを選択する:
      1. 最近傍:指定されたセルタイプの観測値から他のセルタイプから距離を求めます。
      2. 近接分析:選択した細胞タイプ周辺の帯状に測定し、他の細胞タイプの数と距離を定量化します。
      3. 浸透解析:特定のセルタイプが画像にマークされる指定アノテーションレイヤーへの距離を帯状に測定します。
      4. 密度ヒートマップ:画像全体にセルタイプの分布を可視化します。
    7. 空間解析は、スライドアクションの「結果をスポット」ボタンとドロップダウンメニューの「結果アクション」から、すべてのTMAコアで実行できます。
  2. 輸出結果 デジタル病理ソフトウェア
    1. 結果はTMAタブから「スライドアクション」>「エクスポート」からエクスポートできます。
    2. 概要データのみまたは単一ターゲット分析の詳細な分析は、詳細タブからエクスポート可能です。
    3. データを.csvファイルとして生成し、Rなどのソフトウェアで解析して、すべての細胞にわたるバイオマーカー強度の集団レベル解析を行います。単一オブジェクトの特徴には、サンプルID、セルごとの一意オブジェクトID、各マーカーの生の強度値、表現型分類、空間座標が含まれます。

結果

10プレックスIFとペアリングされた仮想H&E画像は、異なる方法で準備された2つのスライドにまたがる136の組織マイクロアレイコア、34種類のヒト組織タイプをカバーして生成されました(図2)。これらの代表的な画像は、組織形態が保存され、組織マイクロアレイコア全体で複数のバイオマーカーが明確に検出されたマルチプレックス染色の成功を示しています。一方のスライドは自動スライドステイナーを利用し、もう一方は手動のスライド準備プロセスを利用していました。手動のクローク解除チャンバー方式では、組織剥離や失われたコアの露出など、組織アーチファクトの発生率が高まりました(図3)。これらのアーティファクトは、サンプルごとやコアあたりの解析可能な組織領域を減少させ、下流の多重画像解析に影響を与えます。これらの観察結果は、プロトコルが多様な組織タイプ間で信頼性の高い多重染色および画像診断を可能にすることを裏付けています。

多重性画像診断の成功は、組織形態の保存、染色ラウンド間の一貫したアライメント、明確で特異的なバイオマーカーシグナル検出によって示されます。対照的に、最適でないアウトカムは組織剥離、信号喪失、または解析可能な領域を減少させ、下流解析を妨げる画像アーティファクトが特徴です。

次に、PANCK(上皮組織)、CD31(内皮組織)、aSMA(間質組織)、ケラチン15(K15;基底上皮)、ビメンチン(間葉細胞)、Ki67(増殖マーカー)、CD8(細胞毒性T細胞)、FOXP3(TREGs)などのマーカーの染色プロファイルを、両方のスライド準備技術で比較し、手動法では信号の質的(視覚的)わずかな減少が観察されました(図4A)).Digital Pathology Softwareのバイオマーカー分類閾値を活用し、データセット内の約63万個の細胞すべてに対して、サンプルを正の集団と否定的な集団に階層化しました(図4B)。マーカー信号の定量的評価は、デジタル病理解析ワークフローから導出された強度測定を用いて実施されました。自動スライドステイナーを用いた際、手動プロセスと比較して、個体群密度推定値(曲線下の面積が個体群全体の100%を表す場合)および中央値強度値では、陽性集団内で5/8バイオマーカーがわずかに増加しました(図4C)。

パネルを完了した後、上記のマーカーはラミンB1(核膜)およびp16(サイクリン依存性キナーゼ阻害剤)のバイオマーカーと組み合わせられ、10個すべてのマーカーの相対組織存在比と単一サンプル全体の分布を可視化しました(図5)。多数のバイオマーカーをプロファイリングする能力は、複数の直交マーカーの評価に依存して適切な分類を確保する老年学分野で特に有用です。ここでは、p16高濃度および低濃度集団におけるラミンB1強度の変化をプロファイリングすることができました。重要なのは、この多重サンプルであったため、同じ組織内の他の細胞種の分布と比較することで、これらの細胞を空間的な文脈に置くことができたことです(図6A)。Digital Pathology Softwareの分類閾値測定により、この染色を定量化し、p16陽性細胞が陰性細胞よりもラミンB1のレベルが低いことが示されました(図6B)、これは以前に記載された老化関連マーカーパターンと一致しています12。また、ラミンB1陰性細胞はp16のレベルが高いことも観察しました(図6C)。Digital Pathology Softwareの表現型関数(単細胞分断と複数のマーカーの閾値測定に基づいて細胞を分類)を用いて、これらのマーカーの組み合わせを用いて、p16陽性とラミンB1陰性の両方を持つ細胞集団を老化型と定義しました。その後、これらの細胞の組織タイプ別にすべてのコアにまたがる割合と、10個のマーカーを個別に定量化しました(図6D)。この出力により、マルチプレックスデータセット内の複数の組織タイプにわたるバイオマーカー定義された細胞集団の定量的比較が可能になります。分析パイプラインは単一細胞レベルで動作しますが、現在のデータセットは主に集団レベルの分布を用いて提示されています。このデータセットにおけるp16陽性細胞の比較的少ない存在比は、p16とラミンB1間の堅牢な細胞間相関解析の統計的検出力を制限する可能性があり、したがってそのような関係は慎重に解釈されるべきです。

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図1:多重免疫蛍光の全ワークフローを示す回路図。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:多重イメージングの概要:(A-B):仮想H&DAPI染色およびラウンド1のCy3自己蛍光から生成されたE画像で、自動スライドステイナーまたは手動スライド準備プロセスを用いて準備したスライドの組織の完全性を可視化します。(C-D):すべてのバイオマーカーの多重断食断続的染色。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:アーティファクトタイプの例:主にスライド準備時に生成されるさまざまなタイプのアーティファクトの代表例。部分的な組織剥離はピントが合わない領域として観察され、その後の検査で組織の整列に問題を引き起こすことがあります。コアの欠損は実験力を低下させ、繊細な組織タイプで不釣り合いに多く発生します。スリップまたは重なりコアは、コアがTMA上の位置から離れて別の領域に付着し、隠れたコアの解析を困難にしてサンプルの損失を悪化させることで発生します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:BONDオートステイナーと手動スライド準備の蛍光信号の比較:(A):構造マーカーであるパンサイトケラチン(PANCK)、CD31、α平滑筋アクチン(aSMA)の代表的なIF染色。これら3つの画像の統合は最初の列に示されています。(B):Digital Pathology Softwareの二値分類解析をマスクし、異なる細胞タイプ(CD31(赤)、FOXP3(ターコイズ)、Ki67(黄)、CD8(白)、PANCK(緑)で陽性マーカー検出を示します。白いボックスは下部パネルのデジタルズーム領域を示しています。(C):組織調製法(自動スライドステイナー=赤、手動=青)およびマーカー陽性(暗=負、明るい=正)ごとにグループ化された細胞集団におけるバイオマーカー強度の定量化。各密度プロットの下の面積は解析された細胞集団の100%を表します。AF = 自己蛍光。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:フル多重パネル:虫垂組織からの代表画像: A-B: 完全な10重間狭間板パネルC : PANCK(緑)、 D:CD31(赤)、 E:aSMA(黄色)、 F:K15(ピンク)、 G:ビメンチン(白)、 H:ラミンB1(ターコイズ)、 I:p16(金色)、 J:Ki67(明るい黄色)、 K:CD8(明るい緑)、 L: FOXP3(紫)。白いボックス = デジタルズーム(Merge, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16)、ダッシュボックス = デジタルズーム(Ki67, CD8, FOXP3)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図6:老化マーカー検出:(A):膵臓組織画像からの代表的なIFで、ラミンB1(ターコイズ)とp16(金)の対照的な染色パターン、さらに他のマーカーPANCK(緑)、CD31(赤)、Vimentin(白)との空間的関係を示す。(B):p16陽性および負性細胞集団におけるラミンB1(LB1)核強度の定量。(C):ラミンB1(LB1)陽性および陰性細胞集団におけるp16細胞強度の定量。曲線下の密度区画面積は人口の100%を表しています。(D):各バイオマーカーまたは老化表現型(p16+/LB1-ve)の組織タイプ間で平均コアパーセンテージ陽性率のZスコア正規化ヒートマップ。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

自動化プラットフォームを用いた多重IFイメージングは、単一組織切片内の大規模なバイオマーカーパネルの微妙なプロファイル生成を促進します。HALOのようなデジタル病理ソフトウェアと組み合わせることで、細胞種同士の存在量や空間的関係、さらに異なる組織構造を通じた分布の両方を調査できます3。これは、老化細胞の特徴の組み合わせによるプロファイリングに依存し、これらの特徴が著しい異質性を持つことが確立されているため、逐次組織切片では不可能な単一標的細胞プロファイリングを必要とする老化分野に大きな価値をもたらす可能性があります。さらに、老化細胞負荷は組織ごとに異なり、加齢に伴う蓄積速度も異なり、信頼性の高いin vivoでの老化マーカーの不足が確立されているため、より柔軟な対応が求められる新しい文脈では、より大きなバイオマーカーパネルを活用する能力が望ましいです。5,15,16.重要なのは、過去の研究で老化細胞の蓄積および時間動態が組織に強く依存し、臓器系間で存在量と発症に大きな変動があることが示されており、老化は組織間で同期的に起こらないことが浮き彫りになっていることです。空間トランスクリプトミクスやイメージング質量サイトメトリーなどの代替的な空間プロファイリング技術は、補完的な分子情報を提供することが可能です。しかし、多重免疫蛍光はタンパク質発現を直接測定し、完全な組織切片内の細胞表現型の高解像度空間解析を可能にします。マルチプレックスIFの逐次的な性質は、反復的なディスカバリーパイプラインにも適しています。

マルチプレックスIFイメージングは、自動スライドステイナーと統合することで高スループットワークフローで実施可能です。標準化の面で大きな利点を持つだけでなく、手動のデクロークチャンバー方式よりもアーティファクトが少なく、組織剥離やコアの喪失が少なく見られます。しかし、これらの観察は定性的比較に基づいており、処理による組織損傷の違いを正式に明らかにするにはさらなる定量的評価が必要です。これは特に皮膚や乳房などの脂肪組織で懸念されます。さらに、カバースリップレススライドホルダーシステムはロボットプレートハンドラーとの統合を可能にし、夜間の画像診断ランなどのワークフロー改善を促進し、処理能力の向上とオペレーターの時間を短縮します。自動化はスループットと標準化の向上が期待されますが、これらの改善の定量的ベンチマークは本研究で正式に評価されておらず、測定された成果ではなく実践的な観察として解釈されるべきです。組織マイクロアレイとして準備されたサンプルにより、比較的少ないスライド数で数百の患者サンプルの包括的な解析を生成することが可能となり、臨床組織サンプル中の老化細胞の調査を将来の研究に促進する可能性があります5,11。

手動スライド準備工程に比べて自動スライドステイナーを用いることでマーカーの強度がわずかに増加することが観察されましたが、実際にはこの利点は小さく、低信号は通常、より長い露光時間の使用や分析閾値の調整で克服できます。抗体の最適化、多重パネル設計、イメージングパラメータの選択など、アッセイの成功に重要なステップがいくつかあります。抗体適合性、信号強度、繰り返し染色サイクルに対する耐性の慎重な検証は、再現性と高品質な多重化データの確保に不可欠です。さらに重要なのは、バイオマーカーのラウンド最適化とチャネル選択です。これらは検査サンプルを個別および組み合わせて評価し、抗体間の交差反応性がないか、また目的のラウンド内で染料不活化やエピトープ検出が可能であることを示します。通常、自己蛍光が低いCy5およびCy7チャネルには、弱いまたはあまり存在しないマーカーを使用することが推奨されます。最終パネルは関心のある組織タイプでテストされます。なぜなら、扁桃腺など広く使われている最適化組織は、実験環境よりも濃度や曝露時間が短い場合が多く、自己蛍光などの特性も異なる場合があるからです。しかし、実験組織で細胞型の存在が不確かな場合、標的細胞の不在とシグナルの欠如を容易に区別できないため、このような陽性対照組織は有用です。ターゲット組織タイプ内でのパネル最適化における徹底的な取り組みは、最終的な実験ランでバイオマーカーの損失を最小限に抑えるために、成功するアッセイの最も重要な実験ステップです。問題の大部分は、抗体の交差反応、抗体濃度の低下による信号不足、またはFITCやCy3チャネルの信号対ノイズの低さに起因します。さらに、繰り返しの染料不活化工程による抗原保存は抗体と組織の両方に依存しているため、実験サンプルに適したパネル/ラウンド組成の選択を確保するために包括的な最適化ステップの用いが必要です。多重免疫蛍光プロセスの主な制約は、高品質な抗体への依存性と、繰り返し染色および染料不活化サイクルにおけるエピトープの安定性です。

全体として、多重イメージングと自動化プラットフォームの組み合わせは、in vivo 組織サンプルのIF評価における高度化の一歩の転換を示し、単細胞レベルで複雑なバイオマーカーパネルの包括的な空間解析を促進します。このワークフローの将来の応用には、多様な組織タイプにおける老化関連バイオマーカーの大規模プロファイリングや、新たに登場する空間オミクス手法との統合による複雑な組織環境内の細胞異質性のさらなる解明が含まれます。

開示事項

CLBはSenisca、StarkAge、AKLRDのコンサルタントも務めてきました。CLBの研究室はValiRxから資金提供を受けました。

著者の貢献:

RW LGとCLBが初期コンセプトを開発しました。RW、FM、MGC、LG、CLB(国家鉄道)、RW、FM、MGC、LG、CLBがコンセプトを最終決定し、実験を開発・設計しました。RW、FM、MGC、LGがすべての実験を実施しました。RWとCLBは、すべての著者が提出前に原稿の改訂に貢献しながら、初期原稿の草稿を作成しました。すべての著者が最終原稿を読み承認しました。

謝辞

CLBは、BBSRCからのFMおよびMGC(それぞれBB/T008709/1およびBB/W510427/1)からの資金提供と、ウェルカム・トラストからのセルDIVE購入(2021年/Z月223803日)を認めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30% 過酸化水素 (H2O2)MerckH1009
抗原マスク解除液1 (H3300) (ARS1)Vector Labs.H-330012.5 mlの抗原マスク解除液と237.5 mlのddH2Oで調製
抗原マスク解除液2 (ARS2)SigmaT6066 / E513410倍ストックを調製する（12.9 gのTrizmaベース、3.7 gのEDTA、5 mLのTween 20、995 mLのddH2O）。 
ウシ血清アルブミン (BSA)MerckA2153
バルク脱蝋液LeicaAR9222
バルクエピトープ回復1 (ER1)LeicaAR9961
バルクエピトープ回復 (ER2)LeicaAR9640
バルク洗浄液LeicaAR9590
DAPIMerckD3571
二重蒸留水 (ddH20)N/AN/A
DMSOMerck472301
ロバ血清MerckD9663
EDTAMerckE5134
グリセロールMerckG5516
NaHCO3MerckS5761
リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)MerckBP399
プロピルガレートMerckP3130
炭酸ナトリウムMerckS5761
トリトン X 100MerckH5141
TrizmaベースMerckT6066
Tween20MerckP1379
その他消耗品または機器
Decloaking チャンバーBioCareDC2012
スチームストリップBioCare613QC
Bond RXm 自動スライド染色装置LeicaHIS2330自動スライド染色装置として参照
Cell DIVELeica29429159多重蛍光イメージングシステムとして参照
Click Well スライドホルダーLeica29463259Well Coverslipless スライドホルダーとして参照
抗体リスト
CD31 (Pecam-1)Cell Signalling61255クローン: 89C2
蛍光色素: AF555
希釈: 1 in 50
CD8aBioLegend372906クローン: C8/144B
蛍光色素: Alexa 647
希釈: 1 in 100
CDKN2A/p16Santa Cruzsc-56330 AF647クローン: jc8
蛍光色素: Alexa 647
希釈: 1 in 200
FOXP3BioLegend320114クローン: 206D
蛍光色素: Alexa 647
希釈: 1 in 50
ケラチン 15Abcamab194065クローン: EPR1614Y
蛍光色素: AF_488
希釈: 1 in 200
Ki67Abcamab215226クローン: EPR3610
蛍光色素: AF555
希釈: 1 in 50
ラミン B1Abcamab194106クローン: EPR8985(B)
蛍光色素: AF_488
希釈: 1 in 100
PanCK_AE1/AE3Thermofisher53-9003-82クローン: AE1/AE3
蛍光色素: AF_488
希釈: 1 in 100
SMAR&D systemsIC1420Sクローン: 1A4
蛍光色素: Alexa 750
希釈: 1 in 100
ビメンチンCell Signalling69227クローン: D21H3
蛍光色素: Alexa 750
希釈: 1 in 100

参考文献

  1. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a Path Forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  2. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends Cell Biol. 28 (6), 436-453 (2018).
  3. De Souza, N., Zhao, S., Bodenmiller, B. Multiplex protein imaging in tumour biology. Nat Rev Cancer. 24 (3), 171-191 (2024).
  4. Teo, Y. V., et al. Notch signaling mediates secondary senescence. Cell Rep. 27 (3), 997-1007 (2019).
  5. Ogrodnik, M., et al. Guidelines for minimal information on cellular senescence experimentation in vivo. Cell. 187 (16), 4150-4175 (2024).
  6. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
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  9. Tomimatsu, K., et al. Precise immunofluorescence cancelling for highly multiplexed imaging to capture specific cell states. Nat Commun. 15, 3657(2024).
  10. Kiessling, P., Kuppe, C. Spatial multi-omics: novel tools to study the complexity of cardiovascular diseases. Genome Med. 16 (1), 14(2024).
  11. Chaib, S., Tchkonia, T., Kirkland, J. L. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 28, 1556(2022).
  12. Freund, A., Laberge, R. M., Demaria, M., Campisi, J. Lamin B1 loss is a senescence-associated biomarker. Mol Biol Cell. 23 (11), 2066-2075 (2012).
  13. Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Commun Biol. 5 (1), 1-11 (2022).
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  15. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. FEBS J. 288 (1), 56-80 (2021).
  16. O’Sullivan, E. A., Wallis, R., Mossa, F., Bishop, C. L. The paradox of senescent-marker positive cancer cells: challenges and opportunities. NPJ Aging. 10 (1), 1-11 (2024).

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