FACSを用いたマウス皮質組織からのペリサイト分離

サマリー

マウス脳皮質ペリサイトがscRNA-seqの要求を満たすために、CD13⁺/CD31⁻選択に基づく極めて最適化されたFACSプロトコルを提示します。私たちの主要な改良により、細胞の生存率とRNAの完全性が大幅に向上し、信頼性の高いトランスクリプトムプロファイリングが可能になります。

要約

ペリサイトは神経血管ユニットの中核成分として、血液脳関門の完全性を維持し、微小血管緊張の調節を通じて脳血行動態の恒常性を調節する上で重要な役割を果たします。細胞周膜の機能障害は、さまざまな神経障害に関与しているとされています。神経血管疾患における細胞の異質性を単一細胞分解能で解明するため、単一細胞RNAシーケンス(scRNA-seq)に適したマウス脳ペリサイトを単離するための最適化かつ再現性のあるプロトコルを確立しました。この方法は確立されたCD13⁺/CD31^の ソート戦略を基盤としつつ、scRNA-seqアプリケーションに特化した重要な強化も組み込んでいます。簡単に、3匹の成体C57BL/6マウスから脳を採取しました。脳組織は機械的に解離され、酵素による消化を受けて単細胞懸濁液が得られました。逐次遠心分離後、最終細胞ペレットは20%牛血清アルブミン(BSA)溶液に再懸濁されました。これはストレスと凝集を最小限に抑え、配列決定の生存率とRNA品質を最大化するために導入した重要な工程です。この最適化されたFACSベースのアプローチにより、scRNA-seqの厳格な要件を満たす生存可能なマウス脳のペリサイトを強固に分離し、ペリサイト異質性と神経血管疾患における病理的役割を解明する強力なツールを提供します。

概要

ペリサイトは、毛細血管に沿って位置する重要な細胞の一種であり、通常は毛細血管基底膜に埋め込まれ、内皮細胞を包み込んでいます^。脳では、ペリサイトは内皮細胞、アストロサイト、その他の細胞タイプとともに神経血管ユニットを形成し、血脳関門(BBB)の構造と機能に不可欠な役割を果たしています。ペリサイトは脳血流の調節、血管の再構築、血管恒常性の維持に重要な役割を果たします。彼らは近接する細胞との密接な物理的相互作用やパラクリンシグナル伝達を通じてBBBの完全性を維持します^。エンドサイトーシスと特異的トランスポータータンパク質の発現 を通じて 経内皮輸送を動的に調節します。収縮性および弛緩活性を通じて脳血行動態の安定性に寄与します。³.細胞の機能障害やその被覆や密度の変化は血管の調節障害や神経学的欠損を引き起こし、最終的にはさまざまな神経障害に関連する病理学的変化を引き起こす可能性があります^。しかし、ペリサイト固有の異質性は、さらなる機構研究に大きな課題をもたらしています。

単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)技術の進歩により、細胞の異質性を探求し、疾患の病因と進行における主要な標的を特定するためにscRNA-seqを活用する研究が増えています。よく使われるペリサイトマーカーには、血小板由来成長因子受容体β(PDGFR-β)⁵、ニューロン-グリア抗原2(NG2)、α平滑筋アクチン(α-SMA)があります。しかし、これらのマーカーは特^異性が比較的低く、平滑筋細胞のような他の血管細胞やオリゴデンドロサイト前駆細胞のような神経前駆細胞を同時に標識できるため、周囲細胞と他の脳細胞の区別が困難になります。より強力な代替手段を探すため、私たちはCD13(アミノペプチダーゼN、APN)に目を向けました。これは^{過去の研究}で脳血管ペリサイト内で強く一貫した発現を示しているマーカーで広く知られている7,8,9,10です。本研究では脳組織切片に免疫蛍光染色を行い、その結果は周囲細胞におけるCD13発現を確認し、CD13シグナルが血管周囲細胞にのみ関連しCD31⁺内皮細胞には存在しなかったため、ペリサイトと内皮細胞を区別する効果があることを示しました。(図1A)しかし、CD13の発現は完全に細胞周核に限定されているわけではないことに注意が必要です。また、小動脈や静脈の平滑筋細胞でも検出可能なレベルが観察されています(図1B,C)。

図1:免疫蛍光染色により、脳血管の周囲細胞および平滑筋細胞でCD13発現が認められ、内皮細胞では検出信号が検出されません。 (A) 脳微血管の細動脈-毛細血管遷移帯の代表的な免疫蛍光画像。統合画像はCD13⁺ペリサイト(緑)がCD31⁺内皮細胞(赤)を被覆している様子を示しています。α-SMA⁺ 平滑筋細胞(シアン)は動脈領域に局在し、毛細血管には存在しません。(B)小動脈の断面図。画像は周囲の平滑筋層におけるCD13⁺ペリサイト(緑色)とα-SMA⁺ 平滑筋細胞(シアン)の明確な共局在を示し、動脈平滑筋細胞におけるCD13発現を確認しました。(C) 静脈の断面図。同様に、CD13(緑色)は静脈壁のα-SMA平滑筋細胞(矢じり)で検出されます。スケールバー:20μm(A-C)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

scRNA-seqの要件を満たすマウス皮質血管ペリサイトを得るために、ペリサイト分離のためにCD13/CD31⁻抗体標識を用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)^{を実施しました。}当初、CD45およびCD41マーカーを用いて造血細胞を脳組織懸濁から除外しました¹²。その後、ペリサイトはCD13⁺ 細胞を選択することで濃縮され、CD31^- 集団へのゲートにより内皮細胞はさらに除外され、標的ペリサイト集団¹³が分離されました。

CD13陽性選択ステップは同時に、小動脈と静脈の両方からCD13発現の平滑筋細胞を捕捉することを認めます。scRNA-seqの重要な要件を満たし、周囲細胞保持を最大化するために、このマーカーの組み合わせを戦略的に選択し、選別段階での細胞収量を優先しました。このアプローチは少数の平滑筋細胞群の共分離をもたらしますが、初期濃縮段階で潜在的な周囲細胞の回復を最大化します。この段階的ゲート戦略は初期の細胞損失を大幅に最小限に抑えます。さらに、細胞周りの生存率と収量を最大化するために、解離後の細胞再懸濁とろ過に20%BSA溶液を用い、分離後の細胞の生存率と純度を維持しつつ、破片を効果的に除去しました^。

この方法を用いて、脳血管ペリサイトを他の細胞タイプと区別し、scRNA-seqの厳格な要件を満たす高純度かつ高い生存率ペリサイト製剤を実現しました。この技術は、さまざまな疾患文脈におけるペリサイトの役割に関する詳細な研究の堅固な基盤を提供します。

プロトコル

本研究では、3か月齢の成体C57BL/6Jマウス3匹(20〜25g)を用いました。すべてのマウスは、厳密に管理された温度と湿度の12時間の明暗サイクルのもとで飼育され、実験前に自由に餌と水を得られていました。実験動物を対象としたすべての実験手順は、中国医学科学院微小循環研究所および北京協和医学院の実験動物ケア倫理委員会の承認を受け、関連する動物福祉ガイドラインに厳格に従って実施されました。

1. 試薬の調製

1. 30%(wt/vol)グルコース溶液:15gグルコースを50mLのUltraPure DNase/RNaseフリーdH_2Oに溶かします。完全に溶解させるために、まずウルトラピュアDNase/RNaseフリーdH₂Oを20 mLにグルコースを加え、十分に混ぜます。次にUltraPure DNase/RNaseフリーdH₂Oを最終体積50 mLに加えます。溶液をろ過し、最大6ヶ月間4°Cで保存します。
2. DNase I(10 mg/mL):50 mg DNase Iを5 mLの滅菌ddH_2Oに溶かします。ストック溶液は最大2ヶ月間-20°Cで保存可能です。
   注意:酵素活性の低下を防ぐために、繰り返しの凍結・融解サイクルは厳重に避けるべきです。凍結解凍効果を最小限に抑えるために、初回凍結前に150μLの溶液を無菌マイクロ遠心分離機管にアリコートし、実験のために個別のアリコートを解凍します。
3. 2%(vol/vol)胎児用牛血清(FBS)リン酸緩衝生理食塩水(PBS):10×PBS5mLとUltraPure DNase/RNaseフリーdH 2O45mLを混ぜて1×/53個PBSを準備します。FBS1mLを1×PBS49mLに加えて十分に混ぜます。
   注意:この解答はStep 2.1.2の段階で新たに準備してください。組織サンプル1つあたり15 mLを割り当ててください。
4. コラーゲナーゼおよびディスパーゼ(CD)酵素ストック溶液:ディスパーゼ100mgとコラーゲナーゼ100mgをそれぞれ1 mLのUltraPure DNase/RNaseフリーdH_2Oに溶かします。溶液を混合して最終体積2 mL(酵素濃度100 mg/mL)にします。
   注意:500μLを無菌のマイクロ遠心分離機管に分けて-20°Cで保存してください。 凍結・融解サイクルによる活動損失を防ぐために、使用前に渦を使います。粉末状のものは、重度の皮膚・目の刺激や呼吸困難を引き起こす可能性があることに注意が必要です。必ず化学換気フードの中で、ニトリル手袋とN95マスクを着用して取り扱ってください。もし感染した場合は、直ちに被害地域に大量の水を灌漑し、医療機関を受診してください。
5. CD酵素作動液:CD酵素ストック溶液1.5mLと、ステップ1.3の2%(vol/vol)FBS43.5mLをPBS中に優しく逆転させて混合します。
   注意:組織解離直前(ステップ2.3.4)に準備してください。このボリュームは3台のマウスに最適化されています。必要に応じて調整してください。
6. 22%(vol/vol)パーコール溶液:パーコール11mL、10×PBS5mL、UltraPure DNase/RNase_{フリーdH 2}O34mLを混合して50mL溶液を合成します。
   注意:0.22μmのPES膜を通してフィルターで滅菌してください。4°Cで1か月間保存しても安定性を大きく損なうことはありません。
7. 機械的解離バッファー:10 mLのDNase I(10 mg/mL)を10 mLの2%(vol/vol)FBSをPBS中に添加します(ステップ1.3以降)。ピペットで混ぜます。
8. BSA溶液:1%、20%、35%(wt/vol)のBSA溶液を別々に準備します。
   1. 1%(重量/容量)BSA:0.15gのBSAを15 mLのダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)に溶解します。
   2. 20%(重量/容量)BSA:3gのBSAを15 mLのDPBSに溶かします。
   3. 35%(重量/容量)BSA:0.7gのBSAを2 mLのDPBSに溶解させます。
      注意:使用前にすべての溶液を0.22μmのPES膜でろ過してください。
9. ハンクスバランス塩溶液(HBSS)/BSA/グルコースバッファー:ステップ1.1の30%(wt/vol)グルコース167 μLとステップ1.8の35%(wt/vol)BSAを1.4 mLのHBSSに加え、優しく混ぜます。
   注意:この溶液はステップ2.1.2の無菌条件下で新たに準備してください。使用まで4°Cで保存してください。
10. 組織採取バッファー:ステップ1.9のHBSS/BSA/グルコースバッファー12 mLに800 μLのDNase I(10 mg/mL)を補足します。一時的な組織保存およびピペット洗浄に使用。
    注意:この溶液はステップ2.1.2の無菌条件下で新たに準備してください。
11. 1.25%(w/v)トリブロモエタノール溶液:2,2,2-トリブロモエタノール1.25gを2.5mlの2-メチル-2-ブタノールに溶かし、この混合物を滅菌のddH_2Oまたは生理食塩水97.5mlに加え、透明な1.25%トリブロモエタノール溶液を得る。
    注意:使用前には必ず溶液を新鮮に準備してください。室温で光から守って保管し、すぐに使いましょう。

2. 実験的手続き(例として3匹のマウスを使った)

1. 実験前準備(時間:30分)
   1. オートクレーブは消耗品を必要とし、外科用器具は75%(vol/vol)エタノールで消毒されました。
   2. 作動溶液を準備する方法:PBS1×(ステップ1.3以降)、PBSに2%(ボルフ/ボリューム)FBS(ステップ1.3以降)、HBSS/BSA/グルコース溶液(ステップ1.9以降)、組織採取バッファー(ステップ1.10以降)。
   3. 10×cmのセルクラチャー皿に10mLのPBSを注ぎ、氷で保管します。
   4. アンプルを3つ用意し、それぞれ3mLの組織採取バッファーを加えて氷で保管します。
   5. 15mLの遠心分離機チューブを3本準備し、それぞれにPBS入りの2%(vol/vol)FBSを10mL加え、氷で保管します。
2. マウス脳の採取(撮影時間:30分)
   1. マウスは、10g体重あたり0.2mLのトリブロモエタノール腹腔内注射(ステップ1.11以降)で深く麻酔されました。足の反射を失った後、頸椎脱臼による安楽死が行われました。
      注:マウスが注射後5〜10分以内に麻酔の外科面(ペダル離脱反射の欠如で評価)に達しなかった場合、初回投与量の3分の1に相当するトリブロモエタノールの腹腔内追加投与が行われました。
   2. 頭部と首の部分に75%のエタノールをスプレーします。頭蓋骨を露出させるために、後頭部から前頭部にかけて頭皮の中央線を切開します。両側眼窩の前方に横切開を行い、その後小脳の下縁に沿って横切開を行い、頭蓋骨の基部を剥離します。最後に、矢状縫合線に沿って後方から前方へ縦方向にカルバリウムを切開します。頭蓋蓋を持ち上げて、硬膜で閉じた脳を露出させてください。視神経と延髄-脊髄の接続を外科用ハサミで切断しながら脳を優しく持ち上げる¹⁵.脳を10cmの皿に入れ、氷のように冷たくなった10mLの1×PBSを入れます。
      注意:組織を傷つけないように優しく扱ってください。
   3. 脳をアルミホイルに移す。鉗子を使って硬膜を縁から持ち上げ、正中溝に沿って切除します。硬膜を完全に除去した後、くも膜下腔を露出させます。くも膜下腔をHBSS溶液で洗い流し、鈍い針で血管を切り離し、慎重に¹⁶番筋を除去します。カミソリの刃で脳を冠状に2〜3mmの厚さのスライスに切り分けます。嗅球と尾端の部分は捨てます。脳梁に沿って大脳皮質を分離し、皮質組織を氷冷組織採取バッファー3 mL入りアンプルに移^す。
   4. このプロトコルにおけるペリサイト分離は、特に大脳皮質を標的としています。その他の関心領域については、冠状切片を2ウェルスライドに置き、PBSに2%(体積/体量)のFBSを1滴ずつ置きます。解剖顕微鏡で標的領域を特定し、手動で分離し、同じ処理手順を進めます。
3. 組織解離(タイミング:3〜3.5時間)
   1. アンプル内で組織を約1mm×1mmの断片に外科用メスで粉砕します。
      注意:組織の鮮度を保つため、5分以内にミンチを完了してください。
   2. 組織採取バッファー付きのプレリンスピペットチップ。先端に向かってゆっくりと細かくすじた断片を吸引しつつ、垂直方向(先端は下向き)を保ちます。断片を予備冷却した15mL遠心分離機チューブ(ステップ2.1.5で準備)に優しく排出します。
      注意:ピペット壁に付着を防ぐため、上部バレルへの吸い込みは避けてください。
   3. 断片を含むアンプル(ステップ2.3.1のもの)をPBSで2%(vol/vol)のFBSで洗浄し、ウォッシュを遠心分離機管に移します。遠心分離機で300 x g 、4°Cで5分間加熱します。
   4. 遠心分離後に上清液は廃棄します。1本あたり1本につき3mLのCD酵素作動液(ステップ1.5の)に再懸浮ペレットを置きます。各懸濁液を均等に3本のチューブ(合計9本、1 mL/チューブ)に分け、その後4 mLのCD酵素作動液(最終容量:5 mL/チューブ)を補足します。
   5. チューブを37°Cのハイブリダイゼーションオーブンで100分間孵化し、100 x g¹⁴の軌道振動で培養します。
   6. インキュベーション中に、10mLの2%(vol/vol)FBSをPBS中に添加して組織解離溶液を準備します(ステップ1.10以降)。
   7. 消化は300 x g 、4°Cで5分間遠心分離で終了します。
      注意:10〜20μLのアリコートを用いて顕微鏡的に消化効率を評価してください。理想的な終点はビーズ状の維管束断片として現れます。細長い血管節は消化不足を示し、単細胞が優勢な場合は過剰消化を示します。
   8. 1本のチューブに1mLの組織解離液にペレットを再懸浮させます。ピペットで100回¹¹回分解して機械的に解離します。
      注意:泡の形成を最小限に抑え細胞の生存率を維持するために、ピペットの満容量吸引は避けてください。
   9. 3匹のマウスの脳組織を表す合計9本の消化管から、すべての懸濁液を50mLの遠心分離機管にまとめます。各消化チューブを2mLの2%(vol/vol)FBSでPBSですすいで洗浄液を混用します。遠心分離機で300 x g 、4°Cで5分間加熱します。
   10. 遠心分離後、明確な層が見えます。最上層(不純物や小さな細胞ごみを含む)は慎重に廃棄し、中間層(細胞や細胞群の密度が低い)と下層(完全な細胞と部分的に消化されていない組織断片)は残します。20%BSA溶液12.5mLを加え、チューブを優しく反転させてペレットを再び懸浮させます。再び1000× g 、4°Cで20分間遠心分離機を行いました。
   11. 底部ペレット(純度の高い無傷細胞で濃縮されたもの)を集め、ミエリン残骸、脂質、少数の細胞を含む上清液を新しい50 mL遠心分離機チューブに移します。優しく反転させて再懸浮し、遠心分離機で1,000 x g 、4°Cで20分間繰り返します。
   12. 2回の遠心分離ステップ(ステップ2.3.10およびステップ2.3.11)で得られた各ペレットを、2 mLの2%(vol/vol)、FBSをPBSでそれぞれ2 mL(最終合計容量:4 mL)に再懸濁します。
       注意:再懸濁中は、破片による汚染を最小限に抑えるためにチューブの壁に触れないようにしてください。
   13. 前の工程で再懸濁した2つの懸濁液を15mLの遠心分離機管に結合します。遠心分離機で300× g、4°Cで5分間。上清液(BSAを含む廃棄バッファー、細胞の残渣、そして残留ミエリン脂質の微量を含む)を廃棄します。ペレット(最終的に精製・洗浄された高純度の完全な標的細胞)を2 mLのPBS溶液(FBS含有)に再懸浮させます。
       注:この工程は、細胞を洗浄された適切な懸濁バッファーに移し、下流の用途に備えるためのものです。
   14. 15mL遠心分離機チューブを4本、それぞれ22%パーコール溶液4mLを準備します。細胞収率を最大化するために、0.5 mLの懸濁液をパーコル勾配(合計4アリコート)に優しく重ねます。遠心分離機は560 x g 、4°Cで10分間加熱します。
       注意:遠心分離機を「ブレーキなし」に設定し、渦による密度勾配の乱れを防ぎ、ミエリンの破片が上清液内で安定化するようにしてください。
   15. 上清液を慎重に吸引してください。1チューブあたり1mLのHBSS/BSA/グルコースバッファーにペレットを再懸浮させます。プールの懸濁液を新しい15mLチューブに移します。パーコールチューブはHBSS/BSA/グルコースバッファー2mLですすぎ、洗浄液を混用してください。遠心分離機で300 x g 、4°Cで5分間加熱します。
4. フローサイトメトリーの選別準備と取得(時間:50分)
   1. 上清液を慎重に吸引してください。細胞ペレットを1 mLのHBSS/BSA/グルコースバッファーに再懸浮させます。
   2. 細胞懸濁液に5μLのFc受容体(FcR)ブロッキング試薬を加え、4°Cで5分間インキュベートします。
   3. 以下の蛍光共役抗体を細胞懸濁液に示された体積(3匹のマウス由来の組織に十分な量)に加えます:5 μL CD45-PE;CD41-PEを5μL投与;CD31-APCを20μL投与;CD13-FITC 15 μL。
   4. 細胞を暗闇で20分間氷の上で孵化させます。
      注意:光から守ってください。かき混ぜないようにしましょう。
   5. 細胞を洗浄するためにHBSS/BSA/グルコースバッファー6mLを加えます。遠心分離機で300 x g 、4°Cで5分間加熱します。
   6. 上清液を吸引してください。細胞ペレットを1 mLのHBSS/BSA/グルコースバッファーに再懸浮させます。7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)溶液200 μLを加え(死細胞を除外するため)、氷上で10分間培養します。その後、HBSS/BSA/グルコースバッファーを使って2mLにボリュームを調整します。
      注意:光から守ってください。
   7. 1%のBSA溶液を1%のBSA溶液(15mL円錐形チューブ)に加え、内側の表面を優しくすすいでください。過剰な溶液を吸引し、各チューブに1%のBSA溶液を正確に1mL残して選別細胞を受け入れます。一時的に氷で保管してください。
   8. 選別直前に40μmのストレーナーを通して染色セル懸濁液をろ過します。
   9. FSC-Aおよび側散乱(SSC-A)パラメータに基づく初期ゲートを設定し、FSC-A信号が低い細胞ごみを排除します。
   10. 造血系統細胞の枯渇は、CD45およびCD41の二重陰性ゲートによって達成され、白血球、免疫細胞、血小板からの汚染を効果的に排除しました。
   11. 血管壁細胞からCD13陽性選択により推定ペリサイトを捕獲する。
   12. 7-AAD蛍光プロービング による 膜の完全性評価;7-AAD⁻ゲーティングによってアポトーシス細胞を除外します。
       注意:CD31陰性選択を通じて高純度のCD31/13/ペリサイトを採取してください。選別したペリサイトを直接1%のBSA入りチューブに集め(ステップ2.4.7参照)、氷の上に置きます。直ちに単細胞懸浮液を数える準備をしてください。その後、中間培養工程なしで直接サンプルをロードしてシーケンスを行います。
5. scRNAのセキュアと解析(時間:3〜4日)
   1. 10x Genomicsの「GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits User Guide」(CG000731)^17,18)のプロトコルに従い、選別されたペリサイトの単一細胞懸濁液が準備されました。荷重用に準備された細胞懸濁液の有効性は>90%で、推奨濃度300〜2000セル/μLの範囲に希釈されました。
   2. 単一細胞懸濁液をバーコード付きゲルビーズおよび酵素と組み合わせ、マイクロフルイディック液滴カプセル化 により ゲルビーズインエマルジョン(GEMs)に分割^します。in situ 細胞溶解、逆転写、バーコード-cDNA連鎖を行います。
   3. GEMを壊して製品を回収しましょう。以下のプロトコルでPCRによるcDNA増幅:9°Cで4秒の初期変性;続いて、サイクル(<500個のターゲットセルで13サイクル、501〜6000個のターゲットセルで12サイクル)が行われ、9°Cで変性2秒、9°Cで3秒のアニーリング、7°Cで伸長を6秒ずつ行う。そして最終延長は72°Cで1分間続き、その後4°Cでホールドします。 増幅生成物の断片サイズ(200-300 bp)と収率を検証します。
      注:増幅生成物は4°Cで最大72時間、または-2°Cで1週間保存することも、次の工程で直接処理することも可能です。
   4. 認定されたcDNAの場合:断片処理を行い、エンドリペアを行い、P7アダプターをリゲートし、インデックスプライマーで増幅します。サイズセレクト断片を用いてシーケンスライブラリを構築します。
   5. 品質管理検証後のIllumina NovaSeqプラットフォーム上の配列ライブラリ。
   6. 細胞バーコード、一意分子識別子(UMI)、RNA配列を抽出するためのデマルチプレックスシーケンスデータ。アラインリードは参照ゲノムに当てはまります。
   7. UMIカウントの定量化、有効な細胞数の推定、遺伝子バーコード発現マトリックス²⁰の生成。
   8. RのDoubletFinderパッケージ(v2.0.6)を使ってダブルレットを削除。人工的な近傍識別に基づいて予測し、データの品質を確保します。
   9. Seurat(v5.0)を用いて主成分解析(PCA)および一様多様近似・射影(UMAP)次元削減を実施します。細胞クラスターを特定し、周囲細胞特異的マーカー遺伝子を可視化して細胞の同一性を検証します。

結果

脳周囲細胞の正確な分離を達成するために、脳組織から解離した細胞にPE Texas Red共役抗マウスCD41/CD45、FITC共役抗マウスCD13、APC共役抗マウスCD31で染色し、表面マーカーと生存可能性検出を統合した多段階の選別戦略を確立しました(図2)。前方散乱(FSC-A)および側散乱(SSC-A)パラメータに基づく初期のゲートは、細胞の破片を効果的に排除しました(図2、左上象限)。その後のCD45⁺/CD41/デュアル陽性細胞除去により造血細胞および血小板汚染物質が除去されました(図2、右上象限)。CD13⁺の血管壁細胞濃縮中に、7-AAD蛍光プローブを陰のゲートで組み込み、CD31陰性選択に基づいてペリサイトを特定的に採取しました(図2、左下象限)。選別結果は、核化された細胞が全イベントの59.8%、CD13陽性細胞が...

ディスカッション

本研究は、マウス脳血管ペリサイトの高精度分離のために、CD13/CD31/多色ラベリングに基づく体系的に最適化され検証済みのFACS戦略を説明しています(²⁴)。フローサイトメトリックおよびその後のscRNA-seq解析により、この手法がペリサイトと内皮細胞を正確に識別し、生存可能性、凝集率、生細胞濃度、核化細胞比率などscRNA-seqの重要な品質管理指標を一貫して満たす細胞が得られることが確認されました。この確立された方法論は、単細胞トランスクリプトミクスを用いたさまざまな脳疾患における細胞周膜機能の今後の詳細な研究に向けた強固な技術的基盤を提供します。

本研究の主要な技術的進歩は、確立されたCD13/CD31/ソーティング戦略への重要な最適化、特にscRNA序列への適合性向上にあります。まず、細胞選別の時間が長くなることを考慮し、解離後に20% BSA溶液に細胞を再懸浮させる重要なステップを導入し、解離およびバッファ溶液にBSAを用いました。この最適化は主に表面...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	凍結保存する前に小分けし、-20℃で保管。解凍後4℃で1週間まで保存可能
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)	Life Technologies	70011-044	細胞洗浄用に使用前に希釈する
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	細胞エネルギーバッファの調製に使用
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	細胞を保護し、接着を防ぐ
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	細胞洗浄および懸濁用
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977-015	核酸分解酵素フリーの反応システムの調製に使用
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	組織消化および細胞解離用。小分けし、-20℃で保管
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	DNA凝集を防ぐ。小分けし、-20℃で保管
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	細胞分離用。4℃で保管
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	蛍光共役物。4℃で光を避けて1ヶ月間まで保管
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	4℃で光を避けて数ヶ月間保管
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	4℃で光を避けて数ヶ月間保管
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	4℃で光を避けて数ヶ月間保管
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	蛍光コントロール。4℃で光を避けて保管
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	4℃で光を避けて数ヶ月間保管
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	4℃で光を避けて数ヶ月間保管
RNase AWAY Decontamination Reagent	Ambion	10328011	RNase汚染の除去用
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	非特異的抗体結合を防ぐ
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	死細胞除外用
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	1.25％（重量/体積）のTribromoethanol溶液の調製に使用
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	1.25％（重量/体積）のTribromoethanol溶液の調製に使用
C57BL/6 mouse	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Single-Cell Sequencing Data Analysis Software
Loupe Cell Browser		4.1	Cell Browser
STAR		2.5.1b	RNA Alignment
irlbpy		-	Principal Component Analysis
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analysis
k-means		0.17	K-Means Clustering
graph-based clustering		0.17	Graph-Based Clustering
FastQC		v0.11.2	Data Quality Control (QC)