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研究記事

NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1軸は敗血症モデルにおけるマクロファージの分極と炎症を調節します

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DOI：

10.3791/69802

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2026年1月16日

 ,  , 
1Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Critical Care Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University

この記事について

サマリー

本プロトコルは臨床サンプル、培養マクロファージ、盲腸結紮穿刺(CLP)マウスモデルを統合し、NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1軸が敗血症におけるマクロファージ分極と炎症をどのように調節するかを調査し、他のlncRNA介在免疫経路に応用可能な段階的なガイダンスを提供します。

要約

敗血症は宿主免疫応答の調節不全を特徴とし、世界的に主要な死亡原因となっています。長く非コードするRNAのNEAT1は炎症性疾患に関与していることが示唆されていますが、敗血症中のマクロファージ分極におけるその特異的な役割はまだ完全には解明されていません。ここでは、臨床サンプル、培養マクロファージ、CLPマウスモデルを対象にNEAT1/miR-181a-5p/HMGB1軸を体系的に調査します。定量PCR、ウェスタンブロッティング、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ、RNAプルダウン実験を用いて、NEAT1、miR-181a-5p、HMGB1間の競合的な内因性RNA(ceRNA)相互作用を確認します。免疫蛍光、トランスウェル移動、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)染色などの機能的アッセイを用いて、マクロファージの分極、移動、アポトーシスを評価する。 In vivoでは、CLPモデルとELISAおよび組織病理学を組み合わせることで、NEAT1ノックダウンがサイトカインプロファイルおよび臓器損傷に与える影響を検証しています。敗血症患者およびリポ多糖刺激マクロファージでは、NEAT1とHMGB1はアップレギュレーションされる一方で、miR-181a-5pはダウンレギュレーションされます。NEAT1のサイレンシングはM2マクロファージの分極を促進し、炎症促進サイトカインを減少させ、マクロファージの移動を阻害し、miR-181a-5p/HMGB1軸を介して敗血症マウスの組織損傷を緩和します。私たちの知る限り、これは臨床、in vitro、in vivoの調和手法を用いて敗血症におけるlncRNA-microRNA-HMGB1調節回路を特徴づける初の統合プロトコルです。NEAT1関連ceRNAネットワークを潜在的な治療戦略として標的とする方法論的枠組みを提供します。

概要

敗血症は、宿主の感染反応の調節不全によって引き起こされる生命を脅かす臓器機能障害と定義されます。臨床管理の進歩にもかかわらず、死亡率は依然として高く、免疫不均衡の分子メカニズムは完全には解明されていません。免疫調節因子の中では、長非コードRNA(lncRNA)が炎症シグナル伝達およびマクロファージ機能の重要な調節因子として浮上しています4,5。NEAT1は核に富む豊富転写産物であり、パラスペックルの構造的成分であり、免疫および組織損傷反応と関連しています6,7。過去の研究では、NEAT1が腸の炎症、虚血/再灌流障害、急性呼吸困難症候群(8,9,10)と関連していることが示されています。

敗血症の文脈では、累積する証拠はLNCNAがマクロファージの分極化と炎症性シグナル伝達を調節し、それが疾患の進行や転帰に影響を与えることを示しています11,12。例えば、lncRNA KCNQ1OT1およびSNHG1は、微小RNA媒介経路を通じて敗血症誘発心筋損傷を調節することが報告されています13,14。しかし、敗血症においてNEAT1がmiR-181a-5p/HMGB1軸を介してマクロファージ分極を調節するかどうかは、体系的に定義されていません。このギャップを埋めるために、患者血液サンプル、リポ多糖刺激されたRAW264.7マクロファージ、盲腸結紮および穿刺マウスモデルを組み合わせてNEAT1/miR-181a-5p/HMGB1軸15,16を解析するプロトコルを確立しました。定量PCR、ウェスタンブロッティング、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ、RNAプルダウン、マクロファージM1/M2の分極、移動、アポトーシスの機能的読み取りを用い、本プロトコルは敗血症におけるマクロファージ機能の調節因子としてNEAT1を定義し、lncRNA標的戦略の開発を支援する再現可能な実験的枠組みを提供します(17,18)。

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プロトコル

人間参加者を含むすべての処置は、河北大学付属病院の倫理審査委員会によって承認されました(承認番号:HDFY-LL-2021-232)。書面によるインフォームドコンセントは、すべての参加者から取得され、該当する場合は法的代理人からも取得されました。すべての動物実験は機関のガイドラインおよび国内規則に従って実施され、同じ倫理委員会によって承認されました。承認されたプロトコルは、盲腸結紮穿刺(CLP)手技、アデノウイルス投与、麻酔レジメン、および人道的評価項目の詳細を明記していました。

患者サンプル採取

敗血症患者は2022年2月から2024年7月にかけて河北大学付属病院で前向き募集されました。合計50名の患者が選考基準を満たし、そのうち24歳は男性26名、女性24名(平均52.4歳±10.2歳)でした。敗血症は敗血症-3基準に基づいて診断され、感染の疑いまたは確定に加え、逐次臓器不全評価(SOFA)スコアが≥2ポイント上昇することが求められました。各患者について、主な感染源(肺感染症、腹腔内感染症、尿路感染症、血流感染症など)および疾患の重症度(敗血症または敗血性ショック)を記録し、SOFAスコアの分布をまとめて疾患負荷を特徴づけました。対照群として、感染や全身性炎症性疾患の臨床的証拠がない健康な個人39名(男性20名、女性19名、年齢26〜70歳、平均50.7歳±11.0歳)を対象に、年齢や性別に有意差は認められませんでした。

敗血症患者から末梢静脈血を採取し、敗血症特異的治療を開始する前に可能な限り実施しました。通常5〜10mLの血液をエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)コーティングチューブに抽出し、抗凝固剤を混ぜるために数回優しく逆さまにしました。サンプルは採取から約1時間以内に処理されました。血漿は室温で1,500 × g で10分間遠心分離し、標識されたマイクロチューブに分割され、-80°Cで保存して後続のサイトカイン測定を行いました。RNAおよびタンパク質抽出のために、製造元の指示に従い、同じサンプルの一部から末梢血単核細胞(PBMC)を分離しました。細胞はPBSで2回洗浄され、数えられ、-80°Cで細胞ペレットとして保存されました。

細胞培養とトランスフェクション

RAW264.7のマウスマクロファージ細胞は、RPMI-1640培地に10%熱不活化胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを37°Cの加湿インキュベーターで5%CO2で維持しました。細胞はオーバーコンフレンスに達する前に細胞スクレーパーで通過させ、安定した表現型を保ちました。

トランスフェクションでは、試薬曝露約24時間前に、RAW264.7細胞を1ウェルあたり5個、10個の5 細胞×6ウェルプレート、2mLの完全培地でシードしました。培養が70〜90%のコンフルエンスに達すると、製造元の指示に従い、核酸(NEAT1やHMGB1発現プラスミド、ショートヘアピン構成体、miR-181a-5p模倣体または阻害剤、および対応する対照剤)を血清フリー培地で脂質系トランスフェクション試薬と複合体化しました。通常、推奨量の試薬と2〜3μgのプラスミドDNAまたは50〜100pmolの小さなRNAを混合し、室温で10〜15分間複合体を形成し、その後抗生物質フリー培地で細胞に滴下して添加します。4〜6時間後、培地は新鮮な完全な培地に置き換えられ、細胞はさらに24〜48時間培養されてから下流のアッセイが行われました。

マクロファージ分極の誘導

炎症性マクロファージ分極を誘導するため、RAW264.7細胞は6ウェルプレートに完全培地で少なくとも4時間付着させました。培地は100 ng/mLのリポ多糖(LPS)を含むDMEMに置き換えられ、細胞は37°Cで5%CO2で6時間培養されました。刺激後、細胞は即座にRNAおよびタンパク質抽出、免疫蛍光染色、移動アッセイ、またはアポトーシス解析のために処理され、実験デザインに応じて行われました。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)

標準手順に従い、フェノール・グアニジニウム系モノフェイ試薬を用いて、培養細胞、PBMC、またはマウス組織から総RNAを抽出しました。簡単に言えば、サンプルは10個6 細胞あたり1mLの試薬または50〜100mgの組織に溶解され、室温で5分間培養され、その後クロロホルム(試薬1mLあたり0.2mL)と強く混合されました。2〜3分間の培養後、溶解液を12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、相を分離しました。水相は新しいチューブに移され、RNAは同量のイソプロパノールとともに沈殿されました。混合物は約10分間培養され、再び12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離されました。 得られたペレットは75%エタノールで洗浄され、7,500× g で4°Cで5分間遠心分離され、短時間の自然乾燥後、RNaseフリー水に溶解されました。RNA濃度と純度はUV分光光度測定で評価され、A260/A 280 比が約1.8-2.0のサンプルが下流解析に使用されました。必要に応じて、アガロースゲル電気泳動によって完全性が検証されました。

補完DNA(cDNA)は、市販の逆転写キットを用いて全RNAから合成され、製造元の指示に従いました。miR-181a-5pについては、推奨通り遺伝子特異的または茎ループプライマーを用いました。リアルタイム定量PCRは、リアルタイムPCRシステムと適切なマスターミックス(SYBR、グリーンまたはプローブベースの化学など)を用いて、cDNAテンプレートを含む20μLの反応体積と各プライマーの0.2〜0.4μMを用いて実施されました。典型的なサイクル条件は、95°Cで3分間の初期変性、その後95°Cで10秒、60°Cで30秒の40サイクル、適切な場合に溶融曲線解析を行い、アンプリコン特異性を確認するというものでした。NEAT1およびHMGB1の発現レベルはGAPDHに正規化され、miR-181a-5pの発現はU6の小さな核RNAに正規化されました。相対発現は2-ΔΔCt法を用いて計算され、対照群と比較してフォールド変化として表されました。プライマー配列とアンプリコンサイズは別のスプレッドシートにまとめられ、 補足表1として提出されました。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングでは、細胞を氷のように冷たいPBSで2回洗浄し、適切な放射免疫沈出法(RIPA)バッファーにプロテアーゼ阻害剤を添加して溶解しました。溶離液は氷上で15〜30分間培養され、時折優しく混合し、12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離して細胞残骸を除去しました。上清液を採取し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を測定しました。

同量のタンパク質(通常1レーンあたり40μg)をローディングバッファーと混合し、95°Cで5〜10分間沸騰させて変性タンパク質をし、適切なアクリルアミド濃度のドーデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル(例:HMGB1用10-12%)で分離しました。タンパク質は、分子量範囲に推奨される条件下で、湿式または半乾式の転移系を用いてポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜に転移しました。膜は、Trisバッファー付き生理食塩水で0.1%Tween-20(TBST)を含み、5%無脂肪乳または牛血清アルブミン(BSA)を室温で1時間ブロックし、その後4°Cで一晩HMGB1(例:1:500希釈)およびGAPDH(例:1:1,000希釈)に対する一次抗体をブロッキングバッファーで希釈して培養しました。TBSTで3回洗浄した後、適切なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体と室温で1時間培養しました。追加の洗浄後、強化された化学発光基質を用いてタンパク質バンドを可視化し、デジタルイメージングシステムでキャプチャしました。バンド強度は画像解析ソフトウェアを用いて定量化し、HMGB1信号をGAPDHに正規化し、相対発現をグループ間で比較しました。

デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ

予測されたmiR-181a-5p結合部位を含むNEAT1の野生型および変異断片とHMGB1 3′非翻訳領域(3′-UTR)をルシフェラーゼレポーターベクター19にクローニングしました。すべての構成要素はサンガーシーケンスによって検証され、挿入部位および突然変異部位が確認されました。RAW264.7細胞は24ウェルプレートにシードされ、一晩接着させました。その後、細胞はリポータープラスミドおよびmiR-181a-5p阻害剤、模倣剤、または対応する陰性対照群と共トランスフェクトされ、一般的なトランスフェクション手順で記載された脂質系トランスフェクション試薬を用いました。

約24〜48時間の培養後、細胞はPBSで洗浄され、適切な受動溶解バッファー(例:1ウェルあたり20μL)で溶解され、完全な溶解を確保するために優しく攪拌されました。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示に従い、デュアルルシフェラーゼ解析キットとルミノメーターを用いて測定されました。ホタルルシフェラーゼ活性をレニラルシフェラーゼ活性に正規化し、トランスフェクション効率を制御し、各グループの相対ルシフェラーゼ活性を対応対照群と比較していました。

トランスウェル移動アッセイ

マクロファージ移動は、細胞侵入アッセイに適した細胞外マトリックスゲルをあらかじめコーティングされたトランスウェルチャンバーを用いて評価されました。ゲルは血清フリー培地で1:6で希釈し、各挿入部の上表面に50μLの希釈溶液を加えました。プレートは37°Cで約4時間培養され、ゲルが固化するまで待った。トランスフェクトまたは処理済みのRAW264.7細胞を採取し、血清フリー培地に1 ×10 6 cell/mLで再懸濁させ、100 μLの細胞懸濁液(10 ×10 5 細胞)を上部チャンバーに追加しました。下部チャンバーには、10%の胎児用牛血清を含む化学誘導剤を含む600μLの完全培地が充填されました。

細胞は37°Cで5%のCO2 で24時間インキュベートされました。培養終了時に、膜の上表面に残っていた移動していない細胞は綿棒で優しく除去されました。下膜表面に付着した移動細胞は、室温で約20分間95%エタノールで固定され、その後0.5%の結晶バイオレット溶液で10〜15分間染色されました。余分な染料はPBSで洗浄して除去し、膜は自然乾燥させました。移動した細胞は光学顕微鏡で観察され、各挿入物ごとにランダムに選ばれた複数のフィールドの細胞を盲検的に数えて移動能力を定量化しました。

TUNELアポトーシスアッセイ

アポトーシス検出のために、RAW264.7細胞をガラスカバースリップで培養し、指定された処理またはトランスフェクションを投与しました。細胞は4%パラホルムアルデヒドで室温で30〜60分間固定され、PBSで洗浄されました。内因性過酸化物酵素活性は0.3%過酸化水素で20分間インキュベーションし、その後PBS洗浄で阻害されました。TUNELのアッセイキットを使用し、標識混合物を細胞を覆いに塗布しました。サンプルは37°Cで約60分間加湿チャンバーで培養され、キットの指示に従って反応が停止されました。ストレプタビジンHRPまたは同等の検出試薬で37°Cで30分間潜伏した後、3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)などの染色基質で核が可視化され、茶色く染まったアポトーシス核が明らかになるまで観察されました。スライドはヘマトキシリンでカウンターステインされ、エタノールで脱水され、キシレンでクリアされ、永久培地でマウントされました。アポトーシス細胞と全核を光学顕微鏡で観察し、アポトーシス指数はTUNEL陽性細胞の割合として算出されました。

免疫蛍光

免疫蛍光のために、パラフィン埋め込み組織切片をキシレンで脱臼し、段階的なエタノール系列で水と化しました。抗原回収は、抗体の推奨に従い、適切なバッファー(例えばシトレートバッファー、pH 6.0)およびマイクロ波または圧力鍋による熱誘発エピトープ回収を用いて行われました。冷却・洗浄後、切片を37°Cで1時間にわたりPBS中5%正常血清でブロックし、非特異的結合を減らしました。その後、組織は4°Cで一晩、マクロファージ分極および炎症性サイトカインのマーカー(CD206、TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導性一酸化窒素シンターゼ(iNOS)、IL-4、IL-10、Arg-1(一般的に1:500希釈)をブロックバッファーで希釈して投与しました。

翌日、切片をPBSで洗浄し、適切な蛍光色素結合二次抗体と共に37°Cの暗闇で1時間インキュベートしました。核は4′6-ジアミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)で5分間補色されました。最終洗浄後、切片はフェード防止マウンティングメディウムで装着され、適切なフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡で検査されました。画像はグループごとに一貫した露出設定で撮影され、すべての図のパネルと凡例にスケールバー(例:20μm)や倍率が示されていました。

CLP誘発敗血症マウスモデル

雄のC57BL/6マウス(24-32g)は手術の少なくとも1週間前から順応させられ、その後Sham、CLP、CLPプラスネガティブコントロールショートヘアピン、またはCLPプラスNEAT1ショートヘアピングループ(n=6組)にランダムに割り当てられました。マウスは閉鎖チャンバー内でエーテルを吸い込み、約1〜3分間麻酔をかけ、適切な呼吸機能を維持しながら正しい反射を誘発する用量と曝露時間のエーテルまたは他の機関承認麻酔薬を失いました。腹部の毛は剃られ、皮膚は適切な消毒液で消毒されました。約1〜2cmの正中開腹術が行われ、盲腸と隣接する腸を露出させました。

CLPの場合、盲腸は約3分の2の長さで無菌縫合糸で優しく外側に切除され、回腸弁を塞いだり腸系膜の血流を妨げたりしないよう注意しました。結紮された盲腸は、承認されたプロトコルで指定されたゲージ(例:21G)の滅菌針で2回刺し、少量の便を優しく押し出して穿刺部位の通透性を確保しました。その後、盲腸は腹腔に戻され、腹壁と皮膚は縫合糸で層状に閉じられました。偽手術マウスも結紮や穿刺なしで同じ開腹術と盲腸曝露を受けました。

NEAT1の in vivo ノックダウンを達成するために、shNEAT1をコードするアデノウイルスベクターと対応する陰性対照ベクターを定義された滴価(例:1 ×10 9 プラーク形成単位/mL)で調製しました。実験デザインで記載され倫理委員会に承認された通り、CLPに対して定められた時間(例:手術後1時間)に、定められた量のウイルス懸濁液(例:1匹あたり100μL)を尾部静脈から投与されました。手術後、マウスは標準的な術後ケアを受け、必要に応じて皮下液体蘇生を行い、敗血症や苦痛の臨床症状がないかモニタリングされました。あらかじめ定められた時間点で、動物は閉鎖チャンバー内でエーテルの過剰吸入を人道的に行い、呼吸を迅速に停止させるために約5〜10mLのエーテルを使用し、その後死亡確認を行い、サイトカイン分析のために血液を採取し、組織病理学、免疫蛍光、分子分析のために臓器を摘出しました。

統計解析

統計解析はSPSSバージョン23.0または同等の統計ソフトウェアパッケージを使用して実施されました。特に記載がない限り、データは平均±標準偏差(SD)として示されています。2つのグループ間の比較には、データが均一分散で正規分布の場合、ペアなしのStudent氏t検定が用いられました。3群以上の比較では、一方移動分散解析(ANOVA)を適用し、有意な全体効果が認められた場合は複数の比較に対して適切な事後検定を行った。両側p値<0.05は統計的に有意とされました。統計記号(例えばp < 0.05、*p < 0.01)の意味は図の凡例で定義され、生物学的複製の数は対応するテキストや凡例で示されています。

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結果

敗血症におけるNEAT1/miR-181a-5p/HMGB1発現および相互作用の検出

敗血症患者の血清では、NEAT1およびHMGB1のレベルが健康な対照群よりも有意に高かったのに対し、miR-181a-5pは著しく減少しました。同様の発現パターンはPBMCsおよびリポ多糖で刺激されたRAW264.7マクロファージでも観察されており、この軸は敗血症および敗血症様炎症状態において一貫して変化していることを示しています(図1A-C)。RAW264.7細胞におけるNEAT1のノックダウンにより、NEAT1発現が効率的に減少し、miR-181a-5pレベルが増加し、機能的研究に適したNEAT1欠損モデルの確立が確認されました(図1D)。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイでは、miR-181a-5pがNEAT1およびHMGB1 3′-UTRの予測結合部位と直接相互作用し、これらの部位の変異によりmiR...

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ディスカッション

敗血症は、過炎症と免疫抑制の段階が共存し、臓器不全や悪い予後を共存させる深刻でしばしば長期的な免疫調節障害を特徴とします(21,22)。蓄積された証拠によれば、長く非コードRNA(lncRNA)が炎症性シグナル伝達やマクロファージ分極を調節することでこれらの過程に関与していることが示されています23,24。例えば、lncRNA-MAAMTはSRSF1/NF-κB軸25を通じてマクロファージのリクルートと炎症促進活性化を促進すると報告されており、TCONS_00019715はM1の分極強化と関連しています。この文脈で、本研究のデータによると、NEAT1は敗血症患者およびLPS刺激マクロファージの血清およびPBMCで一貫して上位調節される一方、mi...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係を一切主張していない。

謝辞

著者らは河北大学付属病院の臨床および検査スタッフに対し、患者の募集、検体処理、動物ケアの支援に感謝します。この活動は河北省保健委員会(助成金第20220640号)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アデノウイルスベクター(shNEAT1)10692-V5ヴィジーン・バイオサイエンスNEAT1発現を体内およびin vitroで抑制するために用いられるアデノウイルス。
BCAタンパク質アッセイキット23227サーモ・フィッシャー細胞溶解液中のタンパク質濃度を定量するために使われるキット。
デュアルルシフェラーズリポーターアッセイキットE1910年プロメガmiR-181a-5p相互作用を測定するためのデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイに使用されたキット。
ELISAキット(サイトカイン)該当なしR&Dシステムズ血清および組織サンプル中のサイトカインレベルを測定するためのキット。
胎児用牛血清(FBS)16000-044ギブコ細胞増殖のための培養培地に使われるサプリメント。
GAPDH抗体2118S細胞シグナル伝達技術GAPDHに対する一次抗体はウェスタンブロットの負荷制御として使用されました。
ヘマトキシリン・エオシン染色キット該当なしサーモ・フィッシャー病理解析のための組織学的染色キット。
免疫蛍光抗体(CD206)14693-1-APプロテインテック組織切片中のM2マクロファージマーカーCD206検出に用いられる抗体。
リポポリサカリド(LPS)L2630シグマ・オルドリッチLPSはRAW264.7細胞における炎症性マクロファージ分極誘導に用いられました。
miR-181A-5P ミミック該当なし該当なしmiR-181a-5pのレベルを調節するために使われる合成miR-181a-5p模倣体。
NEAT1発現プラスミド該当なし該当なしRAW264.7マクロファージにおけるNEAT1の過剰発現に用いられるプラスミド。
RAW264.7 マクロファージ細胞TIB-71ATCCin vitro実験に用いられるマウスマクロファージ細胞株。
RIPA溶解バッファー89901サーモ・フィッシャー細胞を溶解して総タンパク質を抽出するためのバッファー。
RPMI-1640 ミディアム11875-093ギブコRAW264.7マクロファージの培養培地。
SYBRグリーンマスターミックス4385612サーモ・フィッシャー定量的リアルタイムPCR解析に使用される試薬。
トランスウェル移動分析室3422コーニングマクロファージの移動を評価するためのトランスウェル移動アッセイに用いられるチャンバー。
TUNEL アポトーシス分析キットAB66110アブカムTUNEL染色によるRAW264.7細胞のアポトーシス検出に使用されたキット。
ウェスタンブロッティング抗体(HMGB1)AB18256アブカムウエスタンブロッティングで使用されるHMGB1に対する一次抗体。

参考文献

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