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研究記事

アキレス腱損傷に対する血漿代謝物の因果影響:メンデルランダム化研究

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DOI:

10.3791/69807

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2026年3月27日

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1Department of Orthopaedic Centre Hand-Foot Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 2Ningxia Yinchuan Energy College, Nursing College, 3General Surgery Department, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

この記事について

サマリー

ここでは、アキレス腱損傷の因果代謝物を特定するためのメンデル無作為化と実験検証の複合プロトコル、アキレス腱損傷に因果関係を持つ19種類の血漿代謝物の同定、そして5,6-ジヒドロチミンおよびヒドロキヤスパラギンの組織修復促進と炎症軽減への治療的応用を示します。

要約

アキレス腱損傷(ATI)の進行および回復に対する血漿代謝物の因果関係を調査するため、2つの大規模データセットの遺伝データを用いてメンデルランダム化(MR)を適用しました。ATIデータはIEU-OpenGWASプロジェクト(ebi-a-GCST90018895)から取得され、血漿代謝物データには1,400種類の代謝物が含まれていました。代謝物の有意な計測変数(IV)を特定し、5つのMR手法(IVW、MR-Egger、加重中央値、単純モード、加重モード)を適用して因果関係を評価しました。ATIが代謝物レベルに与える影響を調査するために逆MR解析が行われました。マウスアキレス腱組織における組織修復およびIL-6、TNF-α、VEGFA、TGF-β1の発現を、治療後7日目に5,6-ジヒドロチミン(Dih)およびヒドロキシアスパラギン(Hyd)を用いてH&E染色およびウェスタンブロットを用いて評価しました。MR解析により、ATIと有意な因果関係を持つ19種類の代謝物が特定されました。そのうち12種類の代謝物(Dihを含む)(IVW: OR = 1.197、95%信頼区間:1.074-1.334;P = 0.001)およびプレグナネジオール-3-グルクロンニド(IVW: OR = 1.098、95% CI: 1.023-1.177;P = 0.001)はATIの進行と正の関連を示しました。対照的に、Hyd(IVW: OR = 0.789、95%CI: 0.707-0.880;P < 0.001)はATI回復と関連していました。逆MR解析では、ATIが代謝物レベルに有意な因果作用を示すことはなく、一方向的な関係を示唆しました。X線およびH&E分析により、DihおよびHyd治療が用量依存的にアキレス腱の治癒を有意に促進することが示されました。さらに、DihおよびHyd治療はIL-6およびTNF-αの発現を著しく低下させ(P < 0.05)、一方でVEGFAおよびTGF-βレベルを上昇させ(P < 0.05)、炎症の減少と組織修復の促進を示しました。本研究では、特定の血漿代謝物とATIアウトカムとの間に潜在的な因果関係があることを特定しました。これらの発見は将来の治療戦略に役立ち、代謝物と疾患の関連を探るためのMRの有用性を浮き彫りにするかもしれません。

概要

アキレス腱損傷(ATI)は、特にアスリートや身体を動かす人々の間で広く、そして衰弱させる筋骨格系の疾患です。1,2。アキレス腱は人体で最も大きく強い腱であり、歩行、走る、ジャンプ(3、4、5、6)などの動作中にふくらはぎの筋肉からかかとへ力を伝達する重要な役割を果たします。限られた血流と高い機械的ストレスにより、使いすぎや怪我に対して特に脆弱です 2,7。ATIは軽度の腱症から完全な破裂まで様々な形態で現れ、激しい痛み、運動障害、長期リハビリテーションを引き起こします8,9。治療法の進歩にもかかわらず、ATIは持続的な痛み、可動性の低下、回復期間の延長、慢性合併症や再損傷のリスク増加をもたらすことが多いです。

最近の研究では、ATI13,14の治癒過程における血漿代謝物の重要な役割が強調されています。これらの代謝物は様々な生化学的経路に関与し、炎症、組織修復、腱の健康などの重要な要因に影響を与えると考えられています15。例えば、特定のアミノ酸や脂質はコラーゲン合成や酸化ストレスの管理に不可欠であり、どちらも腱病理学において非常に重要です16,17。PDGF、TGF-β、VEGF、IGFなどの成長因子を豊富に含む血小板富血漿(PRP)は、腱の治癒促進に潜在的であることが示されていますが、慢性アキレス腱症の治療における有効性については議論の余地があります。近年、メタボロミクスやプロテオミクスなどのハイスループットオミクス技術により、ATI18,19のような複雑な条件の分子構造を探求する前例のない機会が提供されています。高度なメタボロミクス技術により、ATIの結果に関連するバイオマーカーの同定が可能となり、特定の代謝物が損傷の進行や回復にどのように影響するかの洞察を提供しています。

代謝物プロファイリングと代謝経路の解析は、損傷に関連するバイオマーカーや経路を特定する強力な手法となっています20,21。メンデルランダム化(MR)は、遺伝的変異を計測変数(IV)として用いて、従来の疫学研究で一般的な交絡バイアスに対処する堅牢な因果推論手法です。MRは特に、血漿代謝物などの曝露とATIのようなアウトカムとの因果関係の研究に有用です。従来の観察研究が交絡や逆因果関係に影響しやすいのに対し、MRは遺伝的変異をIVとして用いて、より強い因果推論を提供します。血漿代謝物が腱の健康に与える影響についての深い理解は、治療戦略の進展と回復成果の向上に不可欠です。

これらの進展を基に、本研究ではMRを用いてATIにおける血漿代謝物の因果関係を調査します。代謝物レベルに関連する遺伝的変異を解析し、ATIの進行および回復に関連する特定の代謝物を特定しました。さらに、5,6-ジヒドロチミン(Dih)やヒドロキシアスパラギン(Hyd)などの候補代謝物は、動物モデルで実験的に検証され、ATIの経過と治癒への影響が明らかにされました。

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プロトコル

倫理承認と参加同意

すべての動物実験設計は、寧夏省実験動物管理措置に厳格に従って実施され、寧夏回族自治区人民病院倫理委員会、寧夏医科大学の承認を得ています。

研究デザイン

本研究では、1,400種類の血漿代謝物とATIの因果関係を2サンプルMR法を用いて調査しました。因果推論におけるIVの妥当性を確保するためには、3つの重要な前提を満たす必要があります。(1) 遺伝的変異が関心のある曝露と直接関連していること;(2) 遺伝的変異は曝露と結果の間の潜在的な交絡因子によって混同されない;(3) 遺伝的変異は、他の経路を介さず、曝露自体を通じて結果に影響を与える。

ATIのGWASデータの出典

ATI上のゲノムワイド関連研究(GWAS)のデータはIEU-OpenGWASプロジェクト(https://gwas.mrcieu.ac.uk/ 年)から取得し、特にebi-a-GCST90018895データセットを活用しています。GWAS分析はヨーロッパ系の357,658人を対象に、7,746件の症例と349,912件の対照群を含みました。品質管理手順を経て、合計19,072,056個の単一塩基多型(SNP)が同定されました。品質管理手順には、マイナーアレル頻度<0.01、ハーディ・ワインバーグ平衡P<1×10⁶、遺伝子型コール率<0.95のSNPの除去が含まれていました。集団層化は主成分分析を用いて評価され、ゲノムインフレーション係数(λ)を計算して体系的バイアスを評価しました。

血漿代謝物に関するGWASデータソース

曝露因子データセットには、1,400種類の血漿代謝物のGWASデータが含まれており、1,091の代謝物レベルと309の代謝物比率を含み、GWASデータベースにカタログ化されています(https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020)。MR解析はヨーロッパ系の個人に限定されました。データセットの詳細情報は 補足資料、表S1に記載されています。

IVの選択

IVの同定において、血漿代謝物関連SNPの統計的有意な閾値はP<1×10-5に設定されました。解析の独立性を確保するため、SNPはr2 = 0.001およびキロベース(kb) = 10,000の閾値を用いて集約し、r2 > 0.001、kb < 10,000の19,037,213 SNPを除外して連鎖不平衡(LD)効果を排除しました。F統計値が10<のSNPは異質性が高いためさらなる解析から除外され、基準を満たすSNPは34,843個の有効なIVとして保持されました。

動物と実験設計

すべての動物実験は、寧夏省実験動物管理措置に厳格に従って実施され、寧夏回族人民病院倫理委員会の承認を得ています。8週間齢のBALB/cオスマウス(SPFグレード)は北京バイタルリバー実験動物技術有限公司(北京、中国)から購入されました。マウスは1週間、管理された環境(気温23±1°C、湿度60±10%)で慣れさせ、標準的な餌と水を自由に提供し、12時間の光と12時間の暗いサイクルで過ごしました。順応後、マウス腱損傷モデルが確立されました。縦方向の皮膚切開後、左アキレス腱が露出され、微小外科的はさみを用いて腱の中央に標準化された全層横断が行われました。腱は直ちに6-0非吸収性縫合糸で立体顕微鏡で修復されました。手術直後、ATIマウスモデルの確立が成功したことを確認するためにX線画像検査が行われました。同時に、対照群のX線画像も同じ麻酔条件下で取得され、空白対照28として使用されました。すべての手術は、ペントバルビタールナトリウム(50 mg·kg-1)腹膜内注射による全身麻酔下で行われ、術後鎮痛は12時間ごとにブプレノルフィン(0.05 mg·kg-1、皮下投与)で48時間29分投与されました。モデルの誘導が成功した際、マウスは低用量(10 mg·kg-1、LD-Hyd)、中用量(30 mg·kg-1、MD-Hyd)、高用量(50 mg·kg-1、HD-Hyd)でDihを投与された対照群、モデル群、治療群にランダムに割り当てられました。サンプルサイズ計算:代謝物処理による治癒スコアの40%改善(SD = 15%)の予備データに基づき、n=6マウスが1グループあたり80%の検出力を提供できるとα = 0.05(両尾判定)と判断されました。ランダム化は、グループ割り当てを盲目化された研究者がコンピュータ生成の乱数を用いて実施しました。実験的手技およびアウトカム評価は、グループ割り当てを盲検化された研究者によって実施されました。30。

ヘマトキシリンおよび嗜酸(HE)染色

治療後7日目に、マウスはペントバルビタールナトリウム(100 mg·kg-1)腹腔内注射による深麻酔下で安楽死させられ、組織採取前に反射を完全に失うことが保証されました。損傷したアキレス腱組織と周囲の軟部組織の一部は慎重に採取・処理されました。アキレス腱を中心とした15 mm2 の皮膚片が切除されました。皮膚サンプルは室温で4%パラホルムアルデヒド溶液に48時間固定され、その後脱水、パラフィン埋め込み、5μmの切片処理が行われました。H&E染色を用いて、創傷皮膚の構造的特徴、肉芽組織の形成、炎症細胞浸潤を評価しました。組織学的評価のために、切片はキシレンで脱水(2×10分)、グレードエタノール(100%、95%、85%、75%各5分)で再水和され、蒸留水で洗浄されました。スライドはハリスヘマトキシリンで5分間染色され、流れる水道水で5分間洗浄され、1%酸性アルコールで10秒間分離され、0.2%アンモニア水で30秒間青みをつけられました。洗浄後、0.5%エオシンで2分間カウンターステインを施し、その後脱水、クリアリング、マウントを施しました。組織学的評価信頼性:測定の正確性を確保するため、無作為に選ばれたサンプルの20%を2人の盲検観察者によって独立して採点しました。評価者間信頼性はクラス内相関係数(ICC)を用いて評価されました。コラーゲン組織のICCは0.89(95%信頼区間:0.81-0.94)、組織変性では0.92(95%信頼区間:0.86-0.96)、炎症性細胞浸潤では0.87(95%信頼区間:0.78-0.93)で、非常に高い信頼性を示しました。評価者内信頼性は、1人の観察者が2週間間隔後にサンプルの15%を再評価し、すべてのパラメータ31でICC値>0.85を得て評価しました。

ウェスタンブロット解析

ウエスタンブロットでタンパク質発現を解析しました。タンパク質定量はBCAタンパク質濃度アッセイキットを用いて行われました。同量のタンパク質を10%のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離し、ニトロセルロース膜に移しました。膜は室温で0.1%Tween-20を含むTris緩衝食塩水に5%脱脂乳で1時間封じられました。膜は4°Cで一晩、VEGFA(1:1000、ab46154)、TGF-β1(1:1000、21898-1-AP)、IL-6(1:1000、26404-1-AP)、およびTNF-α(1:1000、17590-1-AP)と共にインキュベートされました。PBSで3回洗浄した後、膜は二次抗体(1:5000)と共に室温で90分間インキュベートされました。タンパク質バンドは、製造元のプロトコルに従いECL化学発光基板キット(詳細は 材料表 参照)を用いて可視化され、ImageJソフトウェア(バージョン1.8)で分析されました。国立衛生研究所)。GAPDH(10494-1-AP)が乗入制御として使用されました。

統計解析

統計解析はR Studioソフトウェアを使用して実施されました。TwoSampleMRおよびieugwasr Rパッケージは、露光データ抽出と有効なIVのスクリーニングに用いられました。これには、凝集(r² < 0.001、ウィンドウサイズ=10,000 kb)、対立遺伝子調和、F統計計算(F = β²_exposure/SE²_exposure)が含まれます。MRおよび逆MR解析では、VariantAnnotation、gwasglue、TwoSampleMRパッケージを活用し、堅牢な因果推論と感度検定を可能にしました。血漿代謝物に関連する形質を調べる2サンプルMR試験が実施されました。5つの異なる分析手法が用いられました:逆分散重み付け(IVW)、MR-Egger、加重中央値(WM)、シンプルモード、加重モードです。主要結果はIVW法を用いて決定され、統計的有意<はP 0.01に設定されました。IVW法は変動の影響を最小限に抑えるために重みを割り当て、より正確な効果推定を提供します。MR-エガー回帰分析は多面性(遺伝子が複数の形質に影響を与える現象)を評価するために用いられ、水平多面性は切片のP値(P > 0.05)で評価され、異質性はIVW法とMR-エッガーのQ統計量を組み合わせて検証されました。Pが0.05>時には有意な異質性は観察されませんでした。ベンジャミニ・ホッホバーグ偽発見率(FDR)法を用いて多重検定補正を行い、FDR<0.05が有意とされました。異質性はコクランのQ統計量とI2統計量を用いて定量化され、I2>50%は著しい異質性を示しました。I2の値は、Ioannidisらが説明した方法で95%信頼区間を算出しました。感度分析は、個々の変異体が全体結果に与える影響を評価するために、逐次各SNPを除去して実施しました。

測定信頼性を評価するため、主要なアウトカム指標(WB定量化および組織学的スコアリング)に対して、クラス内相関係数(ICC)を用いたテスト・再検査解析が行われました。ICCは、ウェスタンブロット(WB)定量および組織学的スコアリングの評価者間および評価者内信頼性を評価するために用いられました。基準は以下の通りに解釈されました:0.50未満(悪)、0.50から0.75の間(中等)、0.75から0.90の間(良好)、0.90以上(優秀)32。3人の独立した研究者が、同じサンプルセットを1週間間隔の2つの時点で盲目的に評価しました。IL-6、TNF-α、VEGFA、TGF-βのウェスタンブロット定量におけるICCは0.87から0.93の範囲で、非常に高い信頼性を示しました。組織学的スコアリングにおけるICCは、コラーゲン組織の評価で0.85、新生血管形成の評価で0.82でした。

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結果

1,400種類の血漿代謝物とATIの因果関係

ATIへの因果作用を評価するために、1,400種類の血漿代謝物の包括的なMR解析が実施されました。一次解析では、LDおよび潜在的な交絡因子を厳格にコントロールしたIVWアプローチを用いて、ATIの進行と回復に著しい影響を与える代謝物を特定しました。 図1 は、144種類の血漿代謝物とATIとの因果関係を示しており、本研究で用いられたMR解析手法のいずれかでP値<0.050に達した場合、その関連は統計的に有意とみなされました。 表1は 、P < 0.050におけるIVWに基づく潜在的な因果関連を示す69種類の血漿代謝物を示しています。ベンジャミニ・ホッホバーグFDR補正を複数検査に適用した結果、19の代謝物がFDR <0.05でATIと有意に関連していました。Q統計量を用いた異質性検定では、Q = 15.73(P = 0.15)、I2 = 24%(95% CI: 0-58%)となり、研究間で低〜...

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ディスカッション

本研究では、1,400種類の血漿代謝物とATIの因果関係を探る包括的なMR解析を実施しました。19種類の血漿代謝物がATIの進行および治癒に有意に関連しており、DihとHydがATIアウトカムに影響を与える主要な要因として浮上しました。その後の 生体内 実験により、これらの代謝物が腱の治癒促進に有益な役割を果たすことが確認されました。DihおよびHydによる治療により、炎症性サイトカインIL-6およびTNF-αの著しい用量依存的なダウンレギュレーションが見られました(P < 0.001)。同時に、血管新生および組織修復のVEGFAおよびTGF β重要マーカーの発現は、DihおよびHydの用量増加により著しく上位調節されました。これらの発見は、これらの代謝物が腱の再生を促進する治療的可能性を強調しています。

同定された19種類の代謝物のうち、12種がATIの進行と有意に関連しており、これらがATIの病態生理過程に寄与している可能性を示唆しています。本研究で特定された代謝マーカーは、腱の病態生理に関し...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

糖尿病足の慢性潰瘍の腸内菌相評価および段階的治療に関する臨床応用研究、銀川科学技術イノベーションプロジェクト(2024SF005)。寧夏主要研究開発プログラム(2019BEG3036)における、急性閉鎖性アキレス腱断裂の周囲組織血流および生体力学的修復に対する各種外科的手法の効果に関する応用研究(2019BEG3036)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5,6-ジヒドロチミン試薬696-04-8試薬
BCAタンパク質アッセイキット試薬P0012試薬
ECL化学発光基板キット試薬P0018S試薬
GAPDH抗体抗体10494-1-AP抗体
ヘマトキシリン・エオシン染色キット試薬G1120試薬
ヒドロキシアスパラギン試薬H1126試薬
IL-6抗体抗体26404-1-AP抗体
イメージJソフトウェアバージョン1.8ソフトウェア
ニトロセルロース膜消耗品HATF08130消耗品
パラホルムアルデヒド試薬P0099-3L試薬
RStudioソフトウェアバージョン 4.5.2ソフトウェア
SDS-PAGEジェル調製キット試薬P0012AC試薬
ナトリウムペントバルビタール麻酔200-323-9麻酔
TGF-&ベータ;抗体1抗体21898年1月AP抗体
TNF-およびα;抗体抗体17590-1-AP抗体
VEGFA抗体抗体AB46154抗体
X線システム楽器MX-20楽器

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