このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ

553 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/69860

⸱

2026年2月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ドットブロットを用いて全体のm⁶Aレベルを半定量的に評価するプロトコルを提示します。全RNAは抽出され、変性され、ナイロン膜に斑点を検出し、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。ImageJグレースケール解析で定量化された信号強度は相対的なメチル化存在比を反映し、研究のための再現性のあるワークフローを提供します。

要約

N-6-メチルアデノシン(m⁶A)は、真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)における最も豊富な内部修飾であり、転写後遺伝子発現の重要な調節因子として機能します。m⁶Aの調査方法は、グローバル定量、ヌクレオチド特異的検出、特定の転写産物の解析など、複数の解像度レベルで応用可能です。その中で、ドットブロットアッセイは、全体的なm⁶A修飾レベルの半定量的評価において、簡潔で迅速かつコスト効率の高いアプローチを提供します。このアッセイでは、まず細胞が全RNAを抽出するために処理され、その後希釈・変性されます。RNAサンプルはナイロン膜にスポットされ、抗m⁶A抗体でプローブされ、化学発光によって可視化されます。信号強度はメチル化の相対的な存在比を示します。最後に、信号強度の定量化と比較はImageJでグレースケール値を測定することで行われます。シーケンスや質量分析法と比べて、DOTブロットは最小限の機器や技術的専門知識を必要とし、特に日常的なスクリーニング、予備的な機能研究、比較分析に適しています。このプロトコルは、基礎研究およびトランスレーショナルアプリケーションの両方でm⁶Aドットブロットアッセイを実装するための詳細かつ再現性の高いワークフローを提供します。

概要

N6-メチルアデノシン(m⁶A)は真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)における最も広く見られる内部修飾であり、RNAの安定性、スプライシング、分解、翻訳、輸出を含む転写後の調節に不可欠な役割を果たします1,2,3。m⁶A修飾の調節異常は、腫瘍の開始、進行、転移など多様な生理学的および病理学的プロセスに関与しているとされています4,5。骨肉腫では、細胞株と組織の両方でm⁶Aレベルの上昇が観察されており、疾患生物学における異常なRNAメチル化の役割を示唆しています6,7。したがって、骨肉腫に関連する転写物や調節経路の変化とともに、全体的なm⁶A存在比の体系的な評価は、骨肉腫におけるRNAメチル化の生物学的メカニズムと臨床的意義を明らかにするために不可欠です。

m⁶A修飾を研究するためのいくつかの解析手法が利用可能である8,9。液体クロマトグラフィー質量分析/質量分析法(LC-MS/MS)10および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースのアッセイ11は、いずれもグローバルなm/Aレベルを測定するために用いられます。前者は高い感度を提供しますが、専門的な機器と専門知識を必要とし、後者は相対的にm6Aレベルとなり、ドットブロットアッセイよりもコストが高くなります。MeRIP-qPCRは特定の転写産物の標的評価を可能にしますが、免疫沈降効率に強く影響されます12。MeRIP-seq13、m⁶A-seq14、m⁶A-SAC-seq15はシーケンスベースのアプローチであり、m⁶Aメチル化部位を正確にマッピングできます。しかし、それらは高価であり、広範なバイオインフォマティクス解析が必要です。

m⁶Aドットブロットアッセイは、RNAにおける全体的なm⁶A修飾レベルを決定するための簡易で迅速かつコスト効率の高い方法を提供します。半定量免疫測定法として、主な利点は専門機器や複雑なバイオインフォマティクス解析を必要とせずにm⁶Aの存在比全体を生成できることにあります。これにより、m⁶Aドットブロットアッセイは、通常のスクリーニング、予備的な機能検証、臨床研究において価値あるツールであると同時に、高度なシーケンス解析や質量分析に基づくアプローチの実用的な補完手段となります。現在のプロトコルは詳細なステップバイステップのワークフローを提供し、再現性のある検出と広範な適用性を確保しています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

注:プロトコルはRNA調製、ドットブロットアッセイ、定量の3つのセクションで構成されています。 材料表 は必要な材料をまとめ、 補足表1は 試薬の配合を詳細に示し、 図1 は実験ワークフローを示しています。

1. RNA製備

  1. 細胞調製
    1. 安定したSNHG21ノックダウン(shSNHG21)、陰性対照細胞(shCtrl)、および3-デアザアデノシン(3-DAA)で処理された細胞を除去します。[100μM、24時間])メクロフェナミン酸(MA;[100μM、24時間])37°Cのインキュベーターから。
    2. 細胞の融合率が約80〜90%であること、そして顕微鏡で細胞の状態が良好であることを確認しましょう。
    3. 培地を取り出し、その後1mLのPBSで細胞を2回洗い流します。
    4. PBSを取り除き、6cmの皿ごとに1mLのトリプシンを加えます。
    5. トリプシンを均等に分散させるために優しく振って1分間孵育します。
    6. トリプシンを除去し、10%FBSを含む培地1mLを加えて消化を終えます。
    7. 細胞の懸濁液を何度もピペットで分散させます。
    8. 細胞懸存液を1.5 mLのRNaseフリーマイクロ遠心分離管に移します。
      注意:使用前にチューブにラベルを貼ってください。ステップ1.1.3から1.1.8は無菌条件下で実施しなければなりません。
    9. 1000 × g で遠心分離機で3分間加熱し、その後上清液を完全に除去します。
  2. RNA抽出
    注:RNA抽出はEZ-pressのRNA精製キットを使用して行われます。
    1. ペレットに600μLの溶解バッファー(RNA精製キットに含まれている)を加え、細胞を完全に溶解するために徹底的に渦を巻いて5分間放置します。
      注:RNA単離には約2×10個の6 細胞が使用されます。
    2. 100%エタノールを同量に加え、よく渦を巻きます。
    3. 600μLの混合物を収集チューブで組み立てたスピンカラムに加えます。
      注意:使用前にスピンカラムと集水チューブを組み立て、使用前にチューブにラベルを貼ってください。
    4. 12,000gで遠心分離×1分間処理し、液体を収集チューブに捨てます。
      注意:カラム底部と液体またはオペレーターとの接触を避けてください。
    5. 残りの混合物に対して上記のステップ1.2.3-1.2.4を繰り返します。
    6. 各スピンカラムに500μLの洗浄バッファー(RNA精製キットに含むもの)を加え、室温で1分間置きます。
    7. 12,000 g × 遠心分離機で1分間処理し、液体を収集チューブに捨てます。
    8. 空のカラムを12,000 g で再度遠心分離し、残留液体を除去×
    9. スピンカラムを新しい1.5mLのRNaseフリーチューブに移し、蓋を開けて2分間自然乾燥させます。
      注意:使用前にチューブにラベルを貼ってください。
    10. スピンカラムの中央に25〜50μLのエリューションバッファー(酵素不使用水)を加えます。
    11. 室温で2分間培養します。
    12. 12,000 g で遠心分離機で1分間RNAを溶出×
    13. スピンカラムを捨て、RNAを氷の上に置きます。
      注意:使用までRNAは-80°Cで保存してください。
  3. RNA希釈
    1. DS-11分光光度計を用いて、143B shSNHG21細胞、143B shCtrl細胞、3-DAAおよびMAで処理された細胞のRNA濃度を測定しました。
    2. 各細胞株から総RNA1μgを準備します。
    3. ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水でRNAを400 ng、200 ng、100 ngに連続希釈します。
      注意:濃度勾配は必要に応じて調整してください。
  4. RNA変性
    1. RNAサンプルを95°Cで3分間希釈しました。
    2. すぐにサンプルを氷に移して冷ます。
      注意:変性RNAは4°Cで最大1週間保存可能です。

2. ドットブロット

  1. RNAスポッティング
    1. 正に帯電したナイロン膜を希望のサイズに切ります。
    2. 基準線を描き、検体名を膜にラベル付けします。
    3. RNAを優しく渦巻かピペッティングで十分に混ぜます。
    4. 各RNAサンプルを膜の指定された位置に1〜2μLのスポットを塗ります。
      注意:RNaseフリーのピペットチップは常に使用してください。ピペットの先端と膜の直接接触は避けてください。RNAが自然に膜上で拡散できるようにしましょう。各サンプルごとに新しいピペットの先端を使いましょう。不規則な拡散を防ぐために、1スポットあたり2μLを超えないようにしてください。
  2. RNA架橋
    1. 膜を3分間自然乾燥させます。
    2. 膜を254nm、120 mJ/cm²のUV架橋剤で照射してRNA架橋を行います。
      注意:代替手段として、膜を37°Cで30分間培養してください。
    3. 10mLの1x TBSTで膜を揺らす台の上で5分間洗浄し、結合していないRNAを除去します。
  3. 膜遮断
    1. 5%のBSA溶液を準備します。
      注意:使用前にこの溶液は新鮮に準備してください。
    2. 膜を室温のブロッキング溶液で2時間培養します。
  4. 抗体インキュベーション
    1. 膜を抗m⁶A抗体とともに4°Cで一晩培養します。
      注意:使用前に抗体1:1000を5%BSA溶液に希釈してください。膜を揺らす台の上でゆっくり振って孵化させます(50rpm)。
    2. 10mLの1x TBSTで10mLの膜を揺らす台の上で3回洗い、10分間洗います。
    3. ホースラディッシュ過酸化酵素(HRP)結合の二次抗体で室温で1時間培養します。
      注意:使用前に抗体1:1000を5%BSA溶液に希釈してください。
    4. 10mLの1x TBSTで10mLの膜を揺らす台の上で3回洗い、10分間洗います。
  5. 化学発光検出
    1. 化学発光HRP基質を膜に均等に落下して塗布します。
      注意:膜を基質と共に室温で1分間、優しく揺らしながら孵化してください。
    2. 化学発光イメージングシステムを使って信号を検出します。
    3. 化学発光イメージングシステムの自動露出機能を初期の事前スキャンとして使用してください。
      注意:最も明るい信号が65%未満の飽和度がある場合のみ自動時間を受け入れてください。そうでなければ、露出を半分にして再取得し、ピーク信号が30〜60%以内に下がるまで再取得します。
  6. メチレンブルー(MB)染色
    1. 膜をMB染色液で1分間培養します。
    2. 10mLの1x TBSTで5分間、揺らす台の上で膜を3回洗い、負荷コントロールとして画像を撮ります。
      注意:化学発光に使われる膜と同じものを染色してください。染色液中の堆積物を乱さないようにしてください。MBは除去が難しいため、防護服とマスクを着用してください。
    3. 画像撮影後、1%SDSを含む溶液をロッキングプラットフォーム上で15分間脱染し、記録や再プロービングを容易にします。

3. 定量化

  1. グレースケール値測定
    1. 画像をImageJソフトウェアにインポートしてください。
    2. 画像を8ビット形式に変換するには 、画像>タイプ>8ビットを使用します。
    3. プロセスで背景を差し引く>背景を 差し引く。
      注意:半径:50.0ピクセル、 背景のライトを確認してください。
    4. Rectangleツールを使って解析領域を選択してください。
    5. Analyze > Gels>Select First Laneでレーンを順番に定義してください。
    6. プロ ットレーン>Analyze > Gels を使って強度プロファイルを作成し、ピークを測定します。
    7. それぞれm⁶AとMBのグレースケール値を測定します。
  2. データを表にコピーして分析します。
  3. 信号強度を比較して、全体のm⁶A修飾レベルを評価してください。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

ドットブロットアッセイの性能を厳密に検証し、SNHG21が全体のm6 Aレベルを調節する役割を調べるために、143B細胞にm6 Aメチル化を抑制または増強する薬理学的摂動を受け、m6 Aの存在量を両方向で監視しました。

グローバルm6 のドット・ブロット定量化 A存在量
まず、このアッセイがm6Aレベルの減少を検出できるか、m6Aのメチル化を阻害するかどうかを評価しました(図2)。図2Aに示すように、メチルトランスフェラーゼ阻害剤3-DAA(100μM、24時間)による処理により、全域m6A信号が著しく減少しました。SNHG21単独のノックダウンは、ベースラインm6 Aレベルを同等に低下させ、さらに3-DAA処理により...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

本研究では、骨肉腫143B細胞におけるSNHG21のノックダウンによりm/Aシグナル強度が低下し、遺伝子改変がRNAメチル化に影響を与えるかどうかを評価する上でこのアッセイの価値を示しました。さらに、このアッセイは複数の応用に使われるツールとして機能します。1) 機能的研究および機構的検証:このアッセイは、全体的なm⁶Aレベルが細胞分化、ストレス応答、腫瘍進行など特定の生物学的プロセスに関連しているかどうかを迅速にスクリーニングするために使用できます16.また、m⁶A調節因子(「書き手」「消しゴム人」「リーダー」)の機能的役割を評価するため、その操作が全体的なメチル化存在比に測定可能な変化をもたらすかどうかを評価します(17,18)。2) 特定のRNA集団の解析:このアッセイはmRNA、lncRNA、rRNAなど定義されたRNAサブセット内でm⁶A濃縮を検出し、RNAクラス特異的なメチル化パターンの洞察を提...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは利益相反を報告していません。

謝辞

この研究は国立自然科学財団(82174408、82374477、82474535)からの助成金によって支援されました。図1は BioRender.com で作成されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-デアザアデノシン(3-DAA)MCEヒー W013332A1mg
抗m6Aモノクローナル抗体プロテインテック68055-1-Ig50 & mu;L
牛血清アルブミン(BSA、フラクションV)バイオフロックス4240GR100 100 g
ケミドックMPイメージングシステムバイオ・ラッド12003154
DMEM高血糖WISENT319-005-CL500 mL
DS-11分光光度計デノヴィックスDS-11
EZ-press RNA精製キットEZB B0004DP100 Preps
FBS- 優れた品質WISENT086-150500 mL
HRP結合ヤギ抗マウスIgG(H+L)ビヨタイムA02161 mL
Immobilon Western chemiluminescent HRP 基質 nbsp;ミリポールWBKLS05002 & 倍;250 mL
メクロフェナミン酸(MA)MCEHY-1172751mg
メチレンブルー染色溶液ソーラービオG13000.1%、100 mL
ナイロントランスファー膜ラボセレクトTM-NY-XS-457.4 & times;8.5 cm、0.45 & mu;m、10 PCS/バッグ
PBSバッファー(すぐに使えるドライパウダー)バイオシャープBL601ApH:7.2〜7.4、2リットル/袋
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)シグマL5750-500G500 g
TBSバッファープレミックスパウダーサンゴン A510025-00011EA(243.9 gの火薬)
TrypLEエクスプレス酵素ギブコ12604-0211×500 mL
トゥイーン-20サンゴンA600560-0500500 mL
UV架橋剤UVPCL-1000

参考文献

  1. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  2. Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).
  3. Hsu, P. J., et al. The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs. J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).
  4. Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. The role of m6A RNA methylation in human cancer. Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).
  5. Li, Y., et al. Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types. Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).
  6. Hu, Y., Zhao, X. Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review). Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).
  7. Zhang, Y., et al. N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review. Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).
  8. Zhu, W., et al. Detection of N6methyladenosine modification residues (review). Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).
  9. Wang, Y., Jia, G. Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine. Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).
  10. Stejskal, S., et al. Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence. RNA. 31 (4), 514-528 (2025).
  11. Ensinck, I., et al. m6A-ELISA, a simple method for quantifying N6-methyladenosine from mRNA populations. RNA. 29 (5), 705-712 (2023).
  12. Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nat Cell Biol. 20 (9), 1074-1083 (2018).
  13. Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data. Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).
  14. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  15. Mishra, T., Phillips, S., Zhao, Y., Wilms, B., He, C., Wu, L. Epitranscriptomic m6A modifications during reactivation of HIV-1 latency in CD4+ T cells. mBio. 15 (11), e0221424(2024).
  16. Li, J., et al. METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression. Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).
  17. Ren, F., Cai, Y., Song, Y. OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).
  18. Chen, Y., et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).
  19. Gu, Y., et al. Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma. Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).
  20. Ura, Y., et al. Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues. Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).
  21. Reed, K. C., Mann, D. A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).
  22. Herrin, D. L., Schmidt, G. W. Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).
  23. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  25. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate. Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).
  26. Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

N6m6ARNAImageJ
グローバルN6-メチルアデノシンRNA修飾レベル検出のためのドットブロットアッセイ
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。