腎虚血/再灌流障害による急性から慢性腎臓への移行のマウスモデル

サマリー

本論文では、片側腎IRIを用いた虚血性CKDモデルと、サンプル採取の前日に行われた対側腎摘出術を提示します。このプロトコルにより、血清ベースの機能評価、高い生存率、28日および42日のCKD病理の再現性が可能となり、機序的および介入的研究のための多用途なプラットフォームを提供します。

要約

腎脚の外科的一時性閉塞は腎虚血再灌流損傷(IRI)を誘発します。IRIは、マウスにおける急性腎障害(AKI)および慢性腎疾患(CKD)への進行を研究するために広く使われているモデルです。しかし、従来のプロトコルでは血清を用いた機能評価を排除したり、高い死亡率を招くことが多いです。既存の片側および両側の腎IRIモデルは再現性を強調していますが、CKDの進行研究に適した一貫した損傷重症度と長期生存率の達成には課題が残っています。ここでは、虚血性AKIからCKDへの移行の堅牢かつ再現性の高いモデルを提供する背側アプローチプロトコルを提示します。背側アプローチは腎臓へのアクセスを容易にし、腹部内の操作を最小限に抑えます。当院では、片側腎IRIと反対側腎摘出術を組み合わせて、採血・組織採取の前日に行います。このアプローチには主に2つの利点があります。(1) 両側損傷に伴う不整合を回避することで変動を最小限に抑えること、(2) 腎摘出術が早期に行われ死亡率が高いプロトコルと対照的に、損傷を一貫した状態に保ちつつほぼ100%の生存率を達成できることです。機能評価は血清BUNとクレアチニンで行われ、間質性線維症は腎IRI後28日および42日目にマッソンのトリクロム系コラーゲン沈着およびCKDマーカー遺伝子によって定量化されます。これらの結果は機能障害と組織病理の発達に関する補完的な洞察を提供します。このプロトコルは、マウスにおける虚血性CKDの信頼性が高く多用途なモデルを確立し、メカニズム的調査を行っています。

概要

AKIは入院患者によく見られる合併症であり、依然として世界的な重大な健康問題です。疫学的研究によると、AKIは入院患者の最大20%、重症患者の30〜60%に発生します。^1,2。一部の患者は腎機能を回復しますが、他は完全回復ができず、CKD³の素因となることがあります。AKIからCKDへの移行は、長期的な転帰の主要な決定要因としてますます認識されており、メカニズム的研究や治療研究の焦点となっています(^4,5,6)。分子メカニズムの研究や治療法の検証には、再現可能な動物モデルが不可欠です。

腎ペディクル(動脈と静脈)の外科的一過閉塞は腎IRIを誘発し、これはマウスのAKI研究に最も広く使われているモデルの一つです。この手術は急性の小管上皮損傷を引き起こし、炎症反応を引き起こし、慢性間質性線維症へと進行する^{ことがあります。}しかし、従来の腎IRIプロトコ....

プロトコル

本研究で行われた動物実験は、ピッツバーグ大学施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。プロトコル番号23103811)、機関のガイドラインに従って。適宜偽手術の対照群を含めることができ、通常は血管クランプや対側腎摘出術なしで外科的曝露を受けます。使用された工具や機器の詳細については、材料セクションをご覧ください。針、メスの刃、クリップなどの鋭利品は、指定された鋭利器容器に捨てなければなりません。組織や遺体を含む生物廃棄物は、機関のバイオハザード廃棄物プロトコルに従って取り扱い・処分されなければなりません。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 動物の準備と手術準備

1. すべての手術器具は使用前にオートクレーブ消毒してください。複数の動物の手術を行う際は、手術の合間に器具から血液や破片を取り除き、熱いビーズ滅菌器で10〜15秒間滅菌します。再利用前に器具を冷やしてください。
2. 水循環式の加熱パッドを設置し、手術フィールドの上に赤外線ランプを設置します。
3. マウスを麻酔誘導チャンバーに入れ、イソフルラン(酸素中1.5%-2%、1-2 L/min)(機関承認プロトコルに従い)で麻酔を誘発します。ネズミが意識を失ったように見えたら、足の指をつまんで麻酔深度を確....

結果

手術中に観察された腎臓の色の特徴的な変化は、均一な腎虚血の誘発と成功した再灌流を裏付けました。成功した虚血は、腎の色が黒から濃い紫色に変化し、血管クランプを除去した後に改善し再灌流が確認されることで示されます。腎虚血が誘発されない場合、腎臓の色の変化はごくわずかで、その後の損傷は一貫しないことがあります。本研究では、FVB/NJオスマウスに30分間の腎虚血を投与し、その後再灌流して腎損傷を誘発しました。代表的な結果は 図2に示されています。血清はカンザス州獣医診断研究所による腎プロファイル分析で行われ、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの分析が含まれます。マッソンのトリクロム染色された腎臓切片は、ImageJによって間質性コラーゲン沈着のために画像化・分析されました。 Acta2 および Col1a1のリアルタイムqPCR解析については、前回の論文¹⁶を参照してください。

ディスカッション

このプロトコルは、持続的な腎機能障害と進行性間質性線維症を特徴とするAKIからCKDへの移行の再現可能な腎IRI誘導モデルを提供し、これらは^CKDの特徴と広く認識^{されています。}片側尿管閉塞(UUO)は広く使われている慢性腎臓病(CKD)モデルであり、閉塞性腎症を誘発し、主に持続的な管閉塞を介して線維化を引き起こします^18,19。腎虚血再灌流は、尿細管上皮損傷と内皮・微小血管機能障害を併せて誘発し、虚血性AKIおよび^CKDへの進行の主要なメカニズム^です。UUOは持続的な閉塞性損傷を誘発しますが、私たちの虚血性CKDモデルは一過性です。したがって、虚血性CKDモデルは虚血ストレスおよびAKIからCKDへの移行.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔ガスフィルター	A.M. ビックフォードとnbsp;	F-AIR
麻酔誘導室、加温	AIMSラボ製品	WCS8
採血チューブ	BDマイクロテイナー	365967
エタノール	デコン・ラボ	2701
エティカXR(徐放性ブプレノルフィン)	フィデリス動物健康	NDC 86084-100-30
眼軟膏	アコーン	NDC 17478-062-35
ガーゼパッド、滅菌用など;	ダイナレックス	3353
小動物用のヘアクリッパー	ウォール	CLP-9868
ヒートランプ、赤外線	物理楽器	HL-1
温水循環用のヒートポンプ	ブレインツリー・サイエンティフィック	HTP-1500
小動物用の熱・麻酔システム、Versaflex	ブレインツリー・サイエンティフィック	EZ-7150
熱保持型手術用カーテン	ブレイントリー・サイエンティフィック	SPDR-MPS
ホットビーズ滅菌器	サイモン・ケラー	ステリ250
イソフルラン溶液	コヴェトルス	29405
結紮クリップアプリアー	うわっ	533140
結紮クリップ	うわっ	533837
直腸温度のためのマイクロプローブ	物理温度	RET-3
マイクロプローブ温度計	物理温度	BAT-12
顕微鏡、光学	ライカ	DM2500
顕微鏡、スライダースキャナー	ライカ	Aperio CS2スライドスキャナー
マウス(FVB/ニュージャージー)	ジャクソン研究所	001800
針(23G)	BD	305145
ポビドンヨウ素スワブスティック	ダイナレックス	1201
メスブレード	ファインサイエンスツール	10020-00
メスハンドル	ファインサイエンスツール	10060-13
外科用鉗子、非ギザギザ	ロボズ外科機器	RS-5228
外科用鉗子、ギザギザ	ファインサイエンスツール	11051-10
手術用鉗子、歯付き	ファインサイエンスツール	11019-12
手術用手袋	CTI	SPGF750
外科用組織分離用ハサミ	ファインサイエンスツール	14072-10
縫合糸、ポリグリコール酸(PGA)/吸収性 (5-0)	ダイナレックス	9131
縫合、シルク(4-0)	オアシス	MV-683-V
注射器(3ml)	BD	309628
タオルドレープ、滅菌・及び;	ダイナレックス	4410
ピンセットを装着する血管クランプ	ファインサイエンスツール	15057-14
血管クランプ、外傷性はないもの。	ファインサイエンスツール	18055-03
創傷クリップアプライアー	ファインサイエンスツール	12020-09
創傷クリップ	ファインサイエンスツール	12022-09