本論文では、片側腎IRIを用いた虚血性CKDモデルと、サンプル採取の前日に行われた対側腎摘出術を提示します。このプロトコルにより、血清ベースの機能評価、高い生存率、28日および42日のCKD病理の再現性が可能となり、機序的および介入的研究のための多用途なプラットフォームを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
腎脚の外科的一時性閉塞は腎虚血再灌流損傷(IRI)を誘発します。IRIは、マウスにおける急性腎障害(AKI)および慢性腎疾患(CKD)への進行を研究するために広く使われているモデルです。しかし、従来のプロトコルでは血清を用いた機能評価を排除したり、高い死亡率を招くことが多いです。既存の片側および両側の腎IRIモデルは再現性を強調していますが、CKDの進行研究に適した一貫した損傷重症度と長期生存率の達成には課題が残っています。ここでは、虚血性AKIからCKDへの移行の堅牢かつ再現性の高いモデルを提供する背側アプローチプロトコルを提示します。背側アプローチは腎臓へのアクセスを容易にし、腹部内の操作を最小限に抑えます。当院では、片側腎IRIと反対側腎摘出術を組み合わせて、採血・組織採取の前日に行います。このアプローチには主に2つの利点があります。(1) 両側損傷に伴う不整合を回避することで変動を最小限に抑えること、(2) 腎摘出術が早期に行われ死亡率が高いプロトコルと対照的に、損傷を一貫した状態に保ちつつほぼ100%の生存率を達成できることです。機能評価は血清BUNとクレアチニンで行われ、間質性線維症は腎IRI後28日および42日目にマッソンのトリクロム系コラーゲン沈着およびCKDマーカー遺伝子によって定量化されます。これらの結果は機能障害と組織病理の発達に関する補完的な洞察を提供します。このプロトコルは、マウスにおける虚血性CKDの信頼性が高く多用途なモデルを確立し、メカニズム的調査を行っています。
概要
AKIは入院患者によく見られる合併症であり、依然として世界的な重大な健康問題です。疫学的研究によると、AKIは入院患者の最大20%、重症患者の30〜60%に発生します。1,2。一部の患者は腎機能を回復しますが、他は完全回復ができず、CKD3の素因となることがあります。AKIからCKDへの移行は、長期的な転帰の主要な決定要因としてますます認識されており、メカニズム的研究や治療研究の焦点となっています(4,5,6)。分子メカニズムの研究や治療法の検証には、再現可能な動物モデルが不可欠です。
腎ペディクル(動脈と静脈)の外科的一過閉塞は腎IRIを誘発し、これはマウスのAKI研究に最も広く使われているモデルの一つです。この手術は急性の小管上皮損傷を引き起こし、炎症反応を引き起こし、慢性間質性線維症へと進行することがあります。しかし、従来の腎IRIプロトコルにはいくつかの課題があります。片側腎IRIは死亡率が最小限であり、長期的な検査に広く用いられています。しかし、腎機能(例:血清化学、尿分析、糸球体ろ過率)の評価は実現不可能である。両側腎IRIや片側腎IRIと同時または早期の対側腎摘出術を組み合わせたモデルは死亡率の増加と関連しており、慢性研究での利用が制限されています。これらのモデルの堅牢なバリエーションは最近調査されていますが、慢性的な研究環境での適用は慎重に検討する必要があります。さらに、一部のプロトコルでは腹側正中開腹術が用いられ、腹腔内臓器を操作して腎脚を露出させます。これにより、手術の侵襲性や技術的な複雑さが増す可能性があります。Skrypnykらは、片側虚血後8日間に行われた対側腎摘出術が、損傷後の腎機能の血清学的評価を可能にしつつ、高い生存率を維持していることを報告しました11。このプロトコルは、AKIからCKDへの進行を最大42日間にわたって評価するために最適化された体系的な手順を提供します。
本研究は、片側腎IRIを用いた虚血性AKI-CKDモデルを示し、その後腎臓および血液サンプル採取の1日前に遅延性の反対側腎摘出術を実施します。私たちはこれまでにAKIモデルとして同様の手法を複数の論文12、13、14、15で用いています。このアプローチを拡張して、AKIからCKDへの移行を研究することに成功しており、28日目と42日目までにCKDの明確な兆候が現れます(図1 は概説)。このアプローチは優れた生存率を提供し、損傷した腎臓に高度に線維化した表現型を誘導し、採取した血液を用いて腎機能の評価を可能にします。したがって、このアプローチは血清学的評価(片側腎IRIのみと異なり)および生存率の向上(両側腎IRIと比較して)を必要とする研究に特に有用です。背側側からのアプローチが用いられ、腎臓に直接アクセスしました。腹側正中線開腹術と比較して、このアプローチは腹腔内操作を最小限に抑え、腎臓および肺門周辺組織に限定することで、処置の一貫性を向上させます。
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プロトコル
本研究で行われた動物実験は、ピッツバーグ大学施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されました。プロトコル番号23103811)、機関のガイドラインに従って。適宜偽手術の対照群を含めることができ、通常は血管クランプや対側腎摘出術なしで外科的曝露を受けます。使用された工具や機器の詳細については、材料セクションをご覧ください。針、メスの刃、クリップなどの鋭利品は、指定された鋭利器容器に捨てなければなりません。組織や遺体を含む生物廃棄物は、機関のバイオハザード廃棄物プロトコルに従って取り扱い・処分されなければなりません。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 動物の準備と手術準備
- すべての手術器具は使用前にオートクレーブ消毒してください。複数の動物の手術を行う際は、手術の合間に器具から血液や破片を取り除き、熱いビーズ滅菌器で10〜15秒間滅菌します。再利用前に器具を冷やしてください。
- 水循環式の加熱パッドを設置し、手術フィールドの上に赤外線ランプを設置します。
- マウスを麻酔誘導チャンバーに入れ、イソフルラン(酸素中1.5%-2%、1-2 L/min)(機関承認プロトコルに従い)で麻酔を誘発します。ネズミが意識を失ったように見えたら、足の指をつまんで麻酔深度を確認し、反射の喪失を確認します。
- マウスを加熱した手術パッドに移し、鼻のコーン で 麻酔を維持します。
- 術後の鎮痛のためにエティカXR(徐放性ブプレノルフィン;3.25 mg/kg、S.C.)を投与します。
- マウスを手術パッドの上でうつ伏せの姿勢に置きます。必要に応じて手足をテープで固定し、動きを最小限にしてください。
- 切開部周辺の背毛をクリッパーで剃ります。
- 処置中の乾燥を防ぐために眼科軟膏を目に塗布してください。
- 直腸プローブを挿入し、テープで固定し、体温計に接続して継続的にモニタリングします。
- 手術部位を10%ポビドンヨウ素と70%エタノールを交互に消毒し、その後無菌のカーテンで覆います。
2. 片側腎のIRI
- 腎臓レベルを横切る3〜4cmの背側皮膚の切開を行ってください。
- 組織分離用のハサミで皮膚を皮下層から切り離します。
- 皮膚を触診して腎臓の位置を特定してください。
- 腎臓が見える位置、左側脊椎から約1cm外側に、縦方向に1〜1.5cmの筋肉切開を行います。
注意:切開が長すぎると腎臓が腹腔内に滑り込み、その後の操作が複雑になることがあります。最小限の皮膚切開で腎臓を外側に保つことができます。 - 背側切開から腎臓を優しく外側に出します。薄い膜がアクセスを妨げている場合は、鈍く解剖してください。
- ギザギザのない鉗子で腎を安定させる際、上部および下部の腎脚の周囲の壁門脂肪と結合組織を鈍く剥離し、「血管クランプ」を設置するための「管」を作ります。
- 虚血を誘発する前に、体温が十分に暖かい(36.8〜37.2°C)であることを確認しましょう。腎動脈と静脈に束として外傷性のない血管クランプを当てます。
注意:血管がクランプのジョーズの中心に位置し、一定の圧力で圧縮されていることを確認してください。クランプは壁門の一定の位置に当てます。クランプを血管軸に垂直に合わせてください。このクランプは約10件の動物処置に再利用可能です。 - 皮膚を引っ張って腎臓を覆い、できるだけ体温に近い状態に保つ。
- 虚血期には、ヒートポンプを38〜39°C(必要に応じて調整)に設定し、赤外線ランプをオン・オフして目標の体温を維持し(必要に応じて距離を調整)、体温を36.8〜37.2°Cに保ちます。
注:この「サンドイッチ」加熱システムは、水循環式の加熱パッドと赤外線ランプから構成されており、体温を36.8〜37.2°Cの狭い範囲内に効果的に維持します。 体温を毎分記録し、36.8〜37.2°Cで維持してください。 - 虚血期間が30分経ったら、クランプを外し、綿棒で腎臓を腹腔に戻します。
注意:脱去する前に腎臓全体が均一に白く見えるか確認してください。クランプを外した後、再灌流が成功していることを確認します。再灌流が著しく遅れ、例えば30秒以上かかる場合は、再灌流が不完全であることを示し、その後の分析から除外することを検討すべきです。腎IRIへの感受性およびその後のCKDの重症度は、年齢、性別、背景ストレスによって有意に影響を受けます。最適な虚血期間を決定するためのパイロット実験を行うことは、各研究設計において不可欠です。 - 筋肉層を5-0の吸収性縫合糸で閉じ、その後傷口クリップ(例:9mm)で皮膚を閉じます。
注意:手術後10日以内に創傷クリップを外してください。 - イソフルラン麻酔を中止し、マウスが清潔なケージで回復するのを待ちましょう。動物が麻酔から回復し、苦痛や低体温症の兆候がない場合は、ケージを動物の管理室に戻してください。術後の動物の痛みや不快感は監視され、必要に応じて追加投与されます。動物の苦痛を最小限に抑えるため、IACUCの機関ガイドラインに従って人道的エンドポイントが設定されます。
注意:エティカXRは最大3日間の鎮痛効果を提供します。初回投与から72時間以内に動物に痛みや不快感の兆候が見られた場合は、追加の投与を行います。
3. 対側腎摘出術
- ステップ1、動物の準備ステップに従ってください。
- ステップ2.1および2.2で説明された皮膚切開を行います。
- 右腎臓が見える位置、右側脊椎から約1cm外側に、縦方向の筋肉切開(1〜1.5cm)を行います。
- ギザギザのない鉗子で腎臓を保持しつつ、耳門周囲脂肪と結合組織を鈍く剥離して腎脚を露出させます。
- 副腎を慎重に分離し、副腎はそのままにして血管損傷を防ぎます。
- 結紮用クリップ(クリップサイズ:小さめ)と4-0シルク縫合糸で結紮腎ペディクルを結紮し、腎側の血管を切断します。その後、尿管を切断し、腎臓を摘出します。
- ステップ2.11で説明した通り、切開部を閉じます。
4. 血液および腎臓組織の採取
- イソフルラン(酸素中1.5%-2%、1-2 L/分)でマウスに麻酔を誘導し、足の指をつまんで麻酔深度を確認して反射喪失を確認します。
- マウスを仰向けにし、中央線に切開して横隔膜を外します。
- 心臓を慎重に露出させ、3mLの注射器に23Gの針を左心室に挿入します。
- ゆっくりと(600〜1,000μL)採血してください。
- 溶血を防ぐために針を外し、血液を採血管に移します。
- 左腎臓を切除し、検査の要件に従って、柄に取り付けられた刃で切開します。
- 麻酔下で心臓を摘出して安楽死を行います(機関で承認されたプロトコルに従い)。
- 切除組織は研究要件(例:固定、スナップフリージング)に従って処理します。
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結果
手術中に観察された腎臓の色の特徴的な変化は、均一な腎虚血の誘発と成功した再灌流を裏付けました。成功した虚血は、腎の色が黒から濃い紫色に変化し、血管クランプを除去した後に改善し再灌流が確認されることで示されます。腎虚血が誘発されない場合、腎臓の色の変化はごくわずかで、その後の損傷は一貫しないことがあります。本研究では、FVB/NJオスマウスに30分間の腎虚血を投与し、その後再灌流して腎損傷を誘発しました。代表的な結果は 図2に示されています。血清はカンザス州獣医診断研究所による腎プロファイル分析で行われ、血中尿素窒素(BUN)およびクレアチニンの分析が含まれます。マッソンのトリクロム染色された腎臓切片は、ImageJによって間質性コラーゲン沈着のために画像化・分析されました。 Acta2 および Col1a1のリアルタイムqPCR解析については、前回の論文16を参照してください。
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ディスカッション
このプロトコルは、持続的な腎機能障害と進行性間質性線維症を特徴とするAKIからCKDへの移行の再現可能な腎IRI誘導モデルを提供し、これらはCKDの特徴と広く認識されています。片側尿管閉塞(UUO)は広く使われている慢性腎臓病(CKD)モデルであり、閉塞性腎症を誘発し、主に持続的な管閉塞を介して線維化を引き起こします18,19。腎虚血再灌流は、尿細管上皮損傷と内皮・微小血管機能障害を併せて誘発し、虚血性AKIおよびCKDへの進行の主要なメカニズムです。UUOは持続的な閉塞性損傷を誘発しますが、私たちの虚血性CKDモデルは一過性です。したがって、虚血性CKDモデルは虚血ストレスおよびAKIからCKDへの移行...
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謝辞
この作業はNIDDK K01-DK133635、UPMC VMI P3HVB賞;サミュエル&エマ・ウィンターズ財団賞;UPMC CHP RAC スタートアップ助成金;UPMC CHP財団子ども信託助成者賞;ジョージ・M・オブライエン腎臓資源アライアンス機会プールプログラム(OKRA OPP)(TCへ)、NIDDK R01-DK121758;DK134346;R25-DK119180(SSLへ)、NIDDK R01-DK125015;R01-DK137410(JHへ)、キャロリンとマーク・スナイダー家、そしてスナイダー家(JHとSSLへ)。組織学およびスキャン画像の支援をいただいたUPMC CHP組織学コアラボラトリー、血清化学支援をいただいたカンザス州立大学獣医診断ラボラトリーに感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 麻酔ガスフィルター | A.M. ビックフォードとnbsp; | F-AIR | |
| 麻酔誘導室、加温 | AIMSラボ製品 | WCS8 | |
| 採血チューブ | BDマイクロテイナー | 365967 | |
| エタノール | デコン・ラボ | 2701 | |
| エティカXR(徐放性ブプレノルフィン) | フィデリス動物健康 | NDC 86084-100-30 | |
| 眼軟膏 | アコーン | NDC 17478-062-35 | |
| ガーゼパッド、滅菌用など; | ダイナレックス | 3353 | |
| 小動物用のヘアクリッパー | ウォール | CLP-9868 | |
| ヒートランプ、赤外線 | 物理楽器 | HL-1 | |
| 温水循環用のヒートポンプ | ブレインツリー・サイエンティフィック | HTP-1500 | |
| 小動物用の熱・麻酔システム、Versaflex | ブレインツリー・サイエンティフィック | EZ-7150 | |
| 熱保持型手術用カーテン | ブレイントリー・サイエンティフィック | SPDR-MPS | |
| ホットビーズ滅菌器 | サイモン・ケラー | ステリ250 | |
| イソフルラン溶液 | コヴェトルス | 29405 | |
| 結紮クリップアプリアー | うわっ | 533140 | |
| 結紮クリップ | うわっ | 533837 | |
| 直腸温度のためのマイクロプローブ | 物理温度 | RET-3 | |
| マイクロプローブ温度計 | 物理温度 | BAT-12 | |
| 顕微鏡、光学 | ライカ | DM2500 | |
| 顕微鏡、スライダースキャナー | ライカ | Aperio CS2スライドスキャナー | |
| マウス(FVB/ニュージャージー) | ジャクソン研究所 | 001800 | |
| 針(23G) | BD | 305145 | |
| ポビドンヨウ素スワブスティック | ダイナレックス | 1201 | |
| メスブレード | ファインサイエンスツール | 10020-00 | |
| メスハンドル | ファインサイエンスツール | 10060-13 | |
| 外科用鉗子、非ギザギザ | ロボズ外科機器 | RS-5228 | |
| 外科用鉗子、ギザギザ | ファインサイエンスツール | 11051-10 | |
| 手術用鉗子、歯付き | ファインサイエンスツール | 11019-12 | |
| 手術用手袋 | CTI | SPGF750 | |
| 外科用組織分離用ハサミ | ファインサイエンスツール | 14072-10 | |
| 縫合糸、ポリグリコール酸(PGA)/吸収性 (5-0) | ダイナレックス | 9131 | |
| 縫合、シルク(4-0) | オアシス | MV-683-V | |
| 注射器(3ml) | BD | 309628 | |
| タオルドレープ、滅菌・及び; | ダイナレックス | 4410 | |
| ピンセットを装着する血管クランプ | ファインサイエンスツール | 15057-14 | |
| 血管クランプ、外傷性はないもの。 | ファインサイエンスツール | 18055-03 | |
| 創傷クリップアプライアー | ファインサイエンスツール | 12020-09 | |
| 創傷クリップ | ファインサイエンスツール | 12022-09 |
参考文献
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再版と許可
