シリアンゴールデンハムスターの高血圧に対する標準化された腎動脈結紮手術の確立

サマリー

本研究はシリアハムスターにおける部分腎動脈結紮モデル(2K1C)を確立・最適化し、高脂血症を背景にRAS関連の二次性高血圧を安定的に誘発し、心血管研究の再現性の高い基盤を提供しました。

要約

高血圧は世界的な重大な健康リスクとされており、血管の再形成、心不全、心筋梗塞、末期腎疾患などの重篤な合併症を引き起こす可能性があります。シリアンゴールデンハムスターは、自然に発現するコレステリルエステルトランスファータンパク質(CETP)を持つモデルですが、食事誘発性の高脂血症にかかりやすいです。腎動脈狭窄症(RAS)、二次性高血圧、心血管疾患の関係を研究するための信頼性が高く再現性の高いハムスターモデルを確立するために、2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットモデルが用いられました。本研究は、部分腎動脈結紮 による シリアゴールデンハムスターのRAS誘導のための高度な外科的手法を詳述し、外科的分離技術や結紮材料の選択といった重要な要素が結果に大きく影響することを強調しています。この標準化された外科プロトコルの実施により、治療されたハムスターの約90%が収縮期血圧が一貫して25〜30 mmHgの上昇を示しました。この最適化された腎動脈結紮手術は、高一貫性、再現性向上、心血管疾患研究への有用性を持つ高血圧ハムスターモデルの堅牢な生成方法を提供します。

概要

腎動脈狭窄症(RAS)は二次性高血圧の主な原因であり、心血管疾患の重大なリスク因子を構成します¹。臨床研究における主な課題は、脂質異常、高血圧、末端臓器損傷を結びつける因果経路の特定が難しいことです。併存症や併用薬が患者研究を混乱させることが多いためです。これは、この複雑な病態生理を制御された再現可能な実験環境で正確に再現する動物モデルの重要性を強調しています。

2腎臓1クリップ(2K1C)ゴールドブラットモデルは、齧歯類における腎高血圧を誘発する確立された手法です。しかし、マウスやラットのような従来型種にはかなりの制約があります。特筆すべきは、これらの齧歯類がヒトの高密度リポタンパク質代謝に関与する重要な酵素であるコレステリルエステルトランスファータンパク質(CETP)を欠^{いていることです。}その結果、食事誘発性の高コレステロール血症や動脈硬化に耐性があり、RAS患者に一般的に見られる代謝プロファイルを模倣できません。さらに、これらのモデルにおける腎動脈切断に対する高血圧反応はしばしば弱く、大きな変動があります。例えば、C57BL/6マウスは血圧の上昇がほとんど見られないのに対し、スプラグ・ドーリーラットは個体間でかなりのばらつきを示し、再現性のある機構的および治療的研究を妨げ^{ています。}

対照的に、シリアゴールデンハムスター(Mesocricetus auratus)は、そのような研究において独自の生理学的利点を持っています。CETPの自然発現により、高脂肪・高コレステロールの食事を摂ることで、LDL-Cの上昇とやや増加したHDL-Cを含むヒトに似たリポタンパク質プロファイルが発達し、大動脈および冠動脈に自然に動脈硬化病変が形成されます⁵。これは心血管疾患の研究に非常に関連性の高い代謝および血管の背景を提供します。さらに、最近の証拠では、ハムスターはマウスやキイマーゼに比べてレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系(RAAS)の活性化に対して有意に強い血圧反応を示しており、特に高^{血圧研究に}適しているとされています。

これらの利点にもかかわらず、ハムスター2K1Cモデルの有用性は標準化され生存可能な手術プロトコルの欠如により制限されてきました。既存の技術は、高い死亡率を伴う完全接続からオペレーター依存的な部分接続まで多岐にわたりますが、結果に不一致で再現性も低い^7。したがって、ハムスターの代謝性および高血圧性疾患に対する二重感受性を最大限に活用するため、2K1Cモデルに対して洗練され再現性の高い外科的アプローチを開発しました。この最適化されたプロトコルは、食事誘発性脂質異常を背景に一貫して高血圧を誘導することを確保し、RAS、高脂血症、心血管損傷の相乗効果を調査するための強固で統合された実験プラットフォームを提供します。

プロトコル

動物プロトコルは江門国際健康イノベーション研究所(N2023008)および北京大学(DLASBE0730)の実験動物倫理委員会によって承認されました。実験には生後10〜12週のオスのシリアゴールデンハムスターが使用されました。使用された試薬や装置の詳細は 材料表に記載されています。

1. 術前準備

1. 動物には通常のチャウフードを与え、標準的な条件(温度21〜24°C、湿度40%〜60%、12時間の明暗サイクル)で透明な水を与えます。
2. 使用前にすべての手術器具や材料を滅菌してください。手術用プラットフォームを75%エタノールで消毒してください。手術前に約38°Cまで温熱パッドを預熱してください。
3. ハムスターを3%イソフルランが供給された麻酔誘導チャンバーに入れます(機関承認のプロトコルに従い)。
4. 足の引き込み反射がないことで深麻酔を確認しましょう。鼻のコーン で 1.5%〜2%のイソフルランを使った麻酔を維持します。
5. 電動クリッパーを使って左腰の中央の毛を除去します。
6. 露出した皮膚をポビドンヨードで消毒してください。

2. 手術

1. メスを使って左腰椎の中央線に沿って皮膚に約1.5〜2cmの縦切開を行います。下の筋肉を鈍く剥離して広背筋と腸肋筋層を分離します。筋繊維の方向に沿って約1cmのアクセスチャネルを作ります。
2. 鈍い鉗子を使って後腹膜脂肪を優しく引き抜き、腎臓を露出させます。左腎臓の外側を解剖し、腎の脚を特定してください。鈍器鉗子を使って腎動脈と静脈を分離してください。
3. 直径0.27mmの針を腎動脈の隣に置きます。6-0ポリプロピレン縫合糸を動脈と針の両方に巻きつけます。オーバーハンドノットを一つだけゆるく結びます。
   1. 針を慎重に引き抜き、円周的な収縮を残して管径を0.27mmに減らします。腎の色の軽度の変化を伴う血流の目に見える狭窄(完全な停止ではない)を観察し、狭窄の成功を確定します。
4. 腎臓を腎窩に戻してください。筋肉層と皮膚はそれぞれ4-0と3-0の非吸収性ポリプロピレン縫合糸で別々に閉じます。手術部位をポビドンヨードで消毒し、その後エタノールを消毒します。
5. 動物を温熱パッドに置き、意識が戻るまで呼吸状態をモニターしてください。手術後最大3日間、カルプロフェン(5 mg/kg、皮下投与)を投与してください。ハムスターは少なくとも1週間は個別に飼いましょう。

3. 血圧測定

注意:術後2週間および4週間に、Tail-cuff血圧測定システムを用いて非侵襲的に血圧を測定してください。

1. 3%イソフルランが供給されたチャンバーでハムスターを麻酔します。
2. 動物を手術台に伏せさせ、麻酔を維持するためにマスクを装着します。
3. 前肢にカフを装着し、各動物の血圧を少なくとも2分間測定します。

4. 超音波検査

注意:手術後4週間以内に、カラードップラーおよび三次元体積超音波システムを用いて腎血行動態および構造適応を評価してください。

1. 3%イソフルランが供給されたチャンバーでハムスターを麻酔します。
2. 動物を手術台に伏せさせ、麻酔を維持するためにマスクを装着します。
3. 腹部の毛は脱毛クリームで除去し、最適な音響接触を確保しましょう。超音波プローブを置く前に結合ジェルを塗布してください。
4. プローブを左腎臓の上に置き、鮮明な縦方向のBモード画像を取得します。
5. キャリパー関数を使って腎長と皮質の厚さを測定してください。
6. カラードップラーモードを起動し、腎血流を視覚化してください。
7. 収縮期のピーク速度、拡張末期速度を記録し、抵抗率を計算します。
8. 腎容量を再構築するために三次元スキャンを行いましょう。
9. すべての画像と測定データを保存してください。
10. プローブを外し、動物の回復まで様子を見てください。

結果

この研究では、これらのハムスターを無作為に2つのグループに分けました。偽手術グループに8頭、手術グループに11頭です。特に記載がない限り、すべてのデータは標準偏差±平均として提示されています。おおよそ1匹あたり20〜25分の作業時間でした。術中の死亡はなく、手術後9週間以内の生存率は100%でした。手術後2週間で非侵襲的血圧を測定しました。結紮の有無にかかわらず、手術は食欲への影響が小さく、両群の体重も同様の変化を示しました(図1A)。結紮群の収縮期血圧±拡張期血圧はそれぞれ125.516.97および85.33 ± 13.06(mmHg)であり、偽群はそれぞれ79.50±13.92および53.50±18.79(mmHg)でした。また、結紮群の平均血圧は偽群と比べて有意に1.5倍増加しました。両群の心拍数は類似していました(図1B–E)。

腎動脈結紮術2週間後に血液...

ディスカッション

2腎臓1クリップ(2K1C)モデルは、腎血管性高血圧研究における古典的な動物モデルです。歴史的な起源は20世紀に遡り、ヒト腎透性高血圧の病因を効果的にシミュレートします。その根本的なメカニズムは腎動脈狭窄による虚血であり、これがレニン-アンジオテンシン系(RAS)を活性化し、最終的に全身性高血圧を引き起こします。このモデルは人間の高血圧の病理的進行をほぼ正確に反映するだけでなく、操作の簡便さや高い再現性といった大きな利点も提供しています。

比較すると、1K1Cモデルはより顕著な高血圧を誘発しますが、2K1Cモデルに見られる補償的メカニズムは欠けています。遺伝子組み換えモデルは特定の遺伝子機能の精密な探求を可能にしますが、複雑な手順と高いコストを伴います。 薬物誘導法はRAS⁸内の複雑な相互作用を包括的に解析することを可能にします。複数のモデルを統合することで、RAS内の複雑な相互作用を包括的に分析することが可能になります。したがって、2K1Cモデ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.37径のワイヤー縫合	ジョンソン&ジョンソン・メッドテック、中国	JH-18-5100
6-0ポリプロピレン縫合	揚州環宇医療機器有限公司、中国	該当なし
動物麻酔装置	ミッドマーク・コーポレーション、アメリカ	V2330299
カルプロフェン	マックリン、中国	C830557-5g
コレステロール検査キット	中国、中生北空	100000180
カラードップラー超音波システム	マインドレイ医療、中国	レゾナ8
グルコース検査キット	中国、中生北空	100000240
高密度リポタンパク質コレステロール検査キット	中国、中生北空	100020235
LDLRがシリアン・ゴールデンハムスターをKOさせる	中国、北京大学	該当なし
室町 MK-2000ST マウスおよびマウス用非侵襲血圧計ネズミ	室町機械株式会社、日本	140305MU
ペット用ヒーター	中国、メイタイ	DXT30*35-1X
ラット・レニン ELISAキット	コロナ、中国	KWD-E7398R-B
縫合針	ジョンソン&ジョンソン・メッドテック、中国	JH-18-5037
トリグリセリド検査キット	中国、中生北空	100000220
垂直圧力蒸気滅菌器	ヤマトサイエンティフィック、日本	J3170372