このプロトコルは、MeRIP-qPCRを用いて特定のRNAのm6A修飾レベルを評価する詳細なアプローチを提供します。
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方法論記事
骨肉腫細胞における特異的RNAのm6A修飾レベル検出のためのMeRIP-qPCRアッセイ
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
RNAエピトランスクリプトミック修飾は、さまざまながんの発症と発生において重要な役割を果たしており、その中でもN-6-メチルアデノシン(m6A)は最も広く機能的に多様な修飾です。ここでは、MeRIP-qPCRを用いて、骨肉腫細胞における特定の転写産物のm6A修飾レベルを評価する効率的かつ再現性の高いプロトコルを提示します。このアッセイでは、全RNAが抽出され、その後、m6A修飾の免疫捕捉RNAに対して特異的な抗-m 6A抗体を用いたインキュベーションが行われました。その後、RNAを断片化し、タンパク質G磁気ビーズを用いてm6個のA修飾RNA断片の濃縮が達成されました。濃縮されたRNAはプロテイナーゼKの消化によって放出され、RNA結合ビーズによって精製されました。最後に、RNAを逆転写および定量ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で評価し、候補遺伝子中のm6Aレベルを評価しました。結果は、この手法がメチル化の違いを効果的に区別し、骨肉腫細胞におけるm6A修飾の機能的メカニズムを探る信頼できるツールを提供することを示しました。結論として、MeRIP-qPCRは変形肉腫細胞におけるm6A修飾を研究するためのシンプルかつ非常に特異的なアプローチを提供します。このプロトコルは、m6A調節ネットワークの解明と新規治療標的の特定に大きな可能性を秘めています。
概要
最新のエピトランスクリプトーム研究により、RNAN-6-メチルアデノシン(m6A)修飾、すなわちアデノシン上のN-6 位置のメチル化が、真核細胞におけるmRNAの最も豊富に知られている内在化学修飾であることが明らかになりました1。m6AはmRNAの安定性、スプライシング、核輸出、翻訳効率など幅広い生物学的プロセスに関与しています。重要なのは、蓄積された証拠が、m6A修飾の調節不全が、主に思春期および若年成人に影響を及ぼす非常に攻撃的な悪性骨腫瘍である骨肉腫を含む様々ながんの発症と発症に寄与していることを示唆している点です。
m6 A修飾の研究には、堅牢で信頼性の高い方法論が必要です。m6A修飾レベルを検出するために、m6Aドットブロット、m6A ELISA、MeRIP-seqなど、いくつかの手法が開発されています。m6Aドットブロットアッセイはシンプルでコスト効率が良いですが、感度が限られ定量化が不十分という問題があります。これは特定のRNA
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プロトコル
1. RNAの調製
注意:RNA抽出はRNA抽出キットを使用して行われます。細胞やRNA試薬を扱う際は、清潔なバイオセーフティキャビネットの中で作業してください。適切な個人用防護具(白衣、手袋、防護用眼鏡)を着用してください。遠心分離機を4°Cまで予冷してから始めます。
- 独房の準備をしろ。
- 3.5cmの皿から培地を取り出し、事前に冷やしたPBSで細胞を優しく洗います。適切な量のRNA溶解バッファーを直接皿に加え、細胞を完全に溶解し、ピペットで優しく均質化します。
- 細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
- 遠心分離機で1000 × g 、4°Cで5分間。
注意:ローターのバランスと蓋のしっかり閉じていることを確認してください。 - 遠心分離後は慎重にマイクロ遠心分離機のチューブを取り出してください。
- 1mLピペットで上部清液を完全に吸引し、底部のペレットを乱さずに行います。
注意:ピペットの先端で細胞ペレットに触れないでください。
- 溶解細胞。
- 細胞ペレットに300μLのリシスバッファーを加えます。
- チューブを3....
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結果
ここでは、meRIP-qPCR解析の代表的な結果、hFOB1.19および143B細胞におけるc-Mycのm6A修飾レベルを示します。 図2に示すように、抗M6A抗体によるc-Myc濃縮は、背景レベルのみを示したIgG対照群と比較して有意に高かったため、抗M6A抗体が効果的かつ特異的であることを示唆しています。また、c-Mycのm6A修飾レベルは143BでhFOB1.19細胞よりも有意に高かった(P < 0.001)。この発見は、c-Mycが骨肉腫細胞でより多くのm6A修飾を経験していることを示唆しており、これは腫瘍の開始および発生に関与する役割と密接に関連している可能性があります。したがって、m6A修飾はc-Mycの安定性や翻訳効率を調節し、骨肉腫細胞における悪性表現型の維持に寄与する可能性があります。
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ディスカッション
MeRIP-qPCRは、RNA m6A修飾を研究するための有用なツールとして広く応用されています。特に、高スループットのシーケンス結果の検証や、メカニズム的研究において標的遺伝子の特定領域内で修飾部位を正確に局在させることに有用です。さらに、この方法は比較的低コストかつ操作の簡便さから、ほとんどの分子生物学研究室で容易に実装可能であり、エピトランスクリプト体研究において効率的かつ実用的なアプローチとなります8。
成功を確実にするためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、RNAの完全性と品質が不可欠であり、分解されると信頼性の低い結果につながる可能性があります。次に、非特異的結合によるバイアスを排除するためには、入力対照とIgGの両方の制御を含めることが重要である。第三に、抗体の選択が重要です。高い親和性と高特異性を持つM6A抗体のみが信頼性の高い濃縮を保証できます。9.......
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開示事項
著者たちは何も明かすことはありません。
謝辞
この研究は、国立自然科学財団(82174408、82374477、82474535、82205145)からの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100%エタノール | 上海タイタン科学有限公司、アメリカ | 1158566 | |
| 143B | ATCC、アメリカ | ATCC CRL-8303TM | |
| 2×SYBR グリーン qPCR ミックス | 北京啓恒星バイオテクノロジー有限公司、中国 | FS-Q1002 | |
| デノヴィックス DS-11 | デノヴィックス | DS-11 | 分光光度計 |
| DMEM媒体 | WISENT CORPORATION、中国 | 319-005-CL | |
| DMEM/F-12中型 | Gibco、アメリカ | 11320033 | |
| エピクイックカット&RUN m6A RNAリッチメント(MeRIP)キット | エピゲンテック、アメリカ | P-9018-24 | |
| 胎児用牛血清 | WISENT CORPORATION、中国 | 086-150 | |
| hFOB1.19 | 中国科学院細胞バンク(中国) | GNHu14 | |
| m6A RNAメチル化アッセイキット | アブカム、イングランド | AB185912 | |
| マイクロRNA逆転写キット | EZBioscience-EZB、アメリカ | A0010CGQ | |
| リアルタイムシステム | バイオ・ラッド、アメリカ | CFX96 | |
| トータルRNA抽出キット | EZBioscience-EZB、アメリカ | B0004DP | |
| TrypLEエクスプレス酵素 | Gibco、アメリカ | 12604021 |
参考文献
- Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
- Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during ....
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再版と許可
