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方法論記事

骨肉腫細胞における特異的RNAのm6A修飾レベル検出のためのMeRIP-qPCRアッセイ

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DOI:

10.3791/69880

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2025年12月30日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、MeRIP-qPCRを用いて特定のRNAのm6A修飾レベルを評価する詳細なアプローチを提供します。

要約

RNAエピトランスクリプトミック修飾は、さまざまながんの発症と発生において重要な役割を果たしており、その中でもN-6-メチルアデノシン(m6A)は最も広く機能的に多様な修飾です。ここでは、MeRIP-qPCRを用いて、骨肉腫細胞における特定の転写産物のm6A修飾レベルを評価する効率的かつ再現性の高いプロトコルを提示します。このアッセイでは、全RNAが抽出され、その後、m6A修飾の免疫捕捉RNAに対して特異的な抗-m 6A抗体を用いたインキュベーションが行われました。その後、RNAを断片化し、タンパク質G磁気ビーズを用いてm6個のA修飾RNA断片の濃縮が達成されました。濃縮されたRNAはプロテイナーゼKの消化によって放出され、RNA結合ビーズによって精製されました。最後に、RNAを逆転写および定量ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で評価し、候補遺伝子中のm6Aレベルを評価しました。結果は、この手法がメチル化の違いを効果的に区別し、骨肉腫細胞におけるm6A修飾の機能的メカニズムを探る信頼できるツールを提供することを示しました。結論として、MeRIP-qPCRは変形肉腫細胞におけるm6A修飾を研究するためのシンプルかつ非常に特異的なアプローチを提供します。このプロトコルは、m6A調節ネットワークの解明と新規治療標的の特定に大きな可能性を秘めています。

概要

最新のエピトランスクリプトーム研究により、RNAN-6-メチルアデノシン(m6A)修飾、すなわちアデノシン上のN-6 位置のメチル化が、真核細胞におけるmRNAの最も豊富に知られている内在化学修飾であることが明らかになりました1。m6AはmRNAの安定性、スプライシング、核輸出、翻訳効率など幅広い生物学的プロセスに関与しています。重要なのは、蓄積された証拠が、m6A修飾の調節不全が、主に思春期および若年成人に影響を及ぼす非常に攻撃的な悪性骨腫瘍である骨肉腫を含む様々ながんの発症と発症に寄与していることを示唆している点です。

m6 A修飾の研究には、堅牢で信頼性の高い方法論が必要です。m6A修飾レベルを検出するために、m6Aドットブロット、m6A ELISA、MeRIP-seqなど、いくつかの手法が開発されています。m6Aドットブロットアッセイはシンプルでコスト効率が良いですが、感度が限られ定量化が不十分という問題があります。これは特定のRNAのm6A修飾レベルではなく、総RNAのm6A修飾レベルを提供します。m6A ELISAは比較的便利で高スループットの検出を提供します。しかし、交差反応性や低い精度は依然として大きな懸念事項であり、同様に転写本や部位特異的修飾を明らかにする能力も欠いています5。MeRIP-seqはm、6Aのトランスクリプトーム全体マッピングを可能にします。しかし、大量のRNA入力、比較的低い分解能、抗体依存性の要件により、MeRIPシーケンスの精度と再現性に制限があります。これに対し、MeRIP-qPCRは免疫沈殿と定量PCRを組み合わせ、特異的なRNA7上のm6Aの標的検出においてより高い感度と特異性を提供します。この方法は候補遺伝子における差異的なm6A濃縮の感度が高く標的的にも検出できるため、特にm6A関連がん研究の検証研究に適しています。この方法は、m6A媒介の調節機構を研究する研究室にとって、コスト効率が高くアクセスしやすい代替手段を提供します。

ここでは、MeRIP-qPCRを例に用いて、骨肉腫細胞におけるc-Mycのm6A修飾レベルを評価する詳細なプロトコル(図1)を提供しました。MeRIP-qPCRは、メチル化RNA断片の抗体ベースの濃縮と逆転写および定量PCRを組み合わせ、特異的RNA上のm6Aの存在および相対的存在を評価します。このアプローチがc-Mycのメチル化の違いを効果的に区別し、m6Aの骨肉腫細胞における機能的役割を調査する信頼できるプラットフォームを提供したことを示しました。本研究は、MeRIP-qPCRが骨肉腫におけるm6A修飾研究における実用的かつ特異的なツールとしての可能性を強調し、新規治療標的の特定に向けた基盤を築きます。

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プロトコル

1. RNAの調製

注意:RNA抽出はRNA抽出キットを使用して行われます。細胞やRNA試薬を扱う際は、清潔なバイオセーフティキャビネットの中で作業してください。適切な個人用防護具(白衣、手袋、防護用眼鏡)を着用してください。遠心分離機を4°Cまで予冷してから始めます。

  1. 独房の準備をしろ。
    1. 3.5cmの皿から培地を取り出し、事前に冷やしたPBSで細胞を優しく洗います。適切な量のRNA溶解バッファーを直接皿に加え、細胞を完全に溶解し、ピペットで優しく均質化します。
    2. 細胞懸濁液を1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
    3. 遠心分離機で1000 × g 、4°Cで5分間。
      注意:ローターのバランスと蓋のしっかり閉じていることを確認してください。
    4. 遠心分離後は慎重にマイクロ遠心分離機のチューブを取り出してください。
    5. 1mLピペットで上部清液を完全に吸引し、底部のペレットを乱さずに行います。
      注意:ピペットの先端で細胞ペレットに触れないでください。
  2. 溶解細胞。
    1. 細胞ペレットに300μLのリシスバッファーを加えます。
    2. チューブを30回逆さにして、溶液が透明で粘度が高く、塊が見えないまでよく混ぜます。
    3. チューブを室温で2分間孵化させます。
  3. 沈殿RNA。
    1. 溶解液に100%エタノール300μLを加えます(リシスバッファーの同量)。
    2. すぐにピペットを上下に優しく上下に動かして完全に混ぜます。
  4. RNAカラム結合を行います。
    1. 提供された2 mLの収集チューブにRNA精製カラムを置きます。
    2. 混合物全体を精製カラムに移します。
      注意:中央の白い膜に触れないようにしてください。
    3. キャップを閉じて遠心分離機を12,000×g で1分間保ちます。
    4. 下部の液体を捨て、吸収性の紙の上で集水チューブを逆さまに優しく叩いて残留液を取り除きます。
    5. 浄化カラムを収集チューブに戻してください。
  5. 不純物を洗い流す。
    1. 精製カラムにウォッシュバッファー(ヌクレアーゼフリー水)500μLを加えます。
      注意:中央の白い膜に触れないようにしてください。
    2. 12,000gで遠心分離機で1分間×、下液は捨てます。
    3. 残留液体を除去するために再び12,000 g ×遠心分離機で1分間行います。
    4. 精製カラムを清潔な1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
    5. キャップを開けて、カラムを室温で2分間置きます。
  6. RNAを溶出します。
    1. 精製カラムを新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに入れます。
    2. 膜の中心に直接25μLの溶出バッファーを加えます。
    3. 室温で5分間孵卵します。
    4. 下部チューブでRNAを採取するために12,000× g で1分間遠心分離機を使います。
    5. エリュートを膜に再度塗布し、12,000 × g で1分間遠心分離機で1分間分離し、収量を最大化します。
      注意:常にカラム膜の中心に直接溶出バッファーを加えてください。側面壁への添加は避けてください。これによりRNAの溶解が妨げられ、収量が大幅に低下する可能性があります。また、ピペットの先端で膜を突き刺さないでください。
  7. RNA濃度を測定する。
    1. 分光光度計のサンプルポートを1.5μLの溶出バッファーで洗い流します。
    2. 1.5μLの溶出バッファーをブランクとして使用してください。読み取り値がほぼゼロであることを確認してください。
    3. RNAサンプル1.5μLを装填し、濃度を測定します。
    4. 分光光度計(A260/A280 = 1.8-2.2、A260/A230 = 2.0-2.5)およびアガロースゲル電気泳動を用いてRNAサンプルの品質を評価します。

2. メチル化RNA免疫沈降(MeRIP)

  1. 免疫捕捉混合物の調製
    1. 新しい0.2 mLのPCRチューブを入手してください。
    2. 表1(ある反応の例)に記載された成分を追加します。
  2. 免疫捕捉
    1. チューブキャップをしっかり閉じてください。PCRチューブをローテーションシェーカーまたはローリングシェーカーに置きます。
    2. 室温で90分間孵化します。
      注意:溶液は連続的かつ優しく混ぜることを必ず確認してください。
  3. RNA切断
    1. インキュベーション後、各チューブに核消化促進剤(NDE)10 μLと切断酵素ミックス(CEM)2 μLを加えます。
    2. ピペットで上下に5〜6回やすりながら優しく混ぜます。
    3. 室温で4分間培養します。
    4. 入力RNA制御の調製
      1. 免疫沈殿(IP)と入力サンプルの整合性を確保するために、RNAの一部を並行処理して入力対照として処理します。
      2. 各サンプルから1μgの総RNA(10%入力)を別個のPCRチューブに移します。免疫捕捉バッファー(ICB)20 μL、NDE(瀕死分解物質)1.5 μL、CEM 1 μLを加え、室温で2分間インキュベークします。
  4. 磁気濃縮と洗浄
    1. PCRチューブを磁気スタンドに置きます。
    2. チューブを2分間置き、溶液が透明になり、ビーズがチューブの壁に固定されるまで放置します。
    3. ビーズを乱さないように慎重に吸引し、上澄液を捨てます。
    4. チューブを磁気スタンドに置き、ウォッシュバッファー(WB)を150μL加えます。
    5. チューブを磁石スタンドから外し、優しく逆さまに傾けてビーズを完全に再浮下させます。
    6. チューブを磁気スタンドに戻してください。溶液が透明になるまで1〜2分待ってから、上清液を捨てます。
    7. 洗う手順を3回繰り返します。
    8. 同じ方法で150μLのタンパク質消化バッファー(PDB)でビーズを再度洗浄します。
  5. 濃縮RNAの放出と回収
    1. プロテイナーゼKとPDBを1:9の比率で混合してタンパク質消化作業液を準備します。(各反応ごとに20μLを準備します:2μLのプロテナーゼK+18μLのPDB。)
    2. 最終洗浄後、チューブを磁気スタンドから取り出してください。
    3. ビーズペレットに新たに調製したタンパク質消化作業液20μLを加え、優しく混ぜます。
    4. PCRチューブをサーマルサイクラーに入れ、55°Cで15分間培養します。
    5. PCRチューブを磁気スタンドに戻します。溶液が透明になるまで(約2分)待ちます。
    6. 上清液全体(約20μL)を新しい0.2 mLのPCRチューブに慎重に移します。
      注:RNAは現在上清液に存在しています。ビーズは捨てろ。
  6. RNA精製
    1. 各サンプルチューブ、ネガティブコントロールチューブ、入力チューブに20μLのRNA精製液(RPS)を加えます。
    2. 160μLの100%エタノールを加えます。
    3. ボルテックスRNA結合ビーズで再懸浮させましょう。
    4. 各チューブに2μLの再懸濁RNA結合ビーズを加えます。
    5. 少なくとも10回は上下によく混ぜてください。
    6. 室温で5分間培養してRNA結合を促します。
    7. チューブを磁気スタンドに置きます。溶液が透明になるまで(約2分)待ちます。
    8. ビーズを乱さずに上清液を慎重に捨ててください。
    9. チューブを磁気スタンドに置き、新たに調製した90%エタノールを150μL加えます。30秒ほど孵化します。
    10. 90%エタノールは捨ててください。90%エタノールの洗いをもう一度(合計2回)繰り返します。
    11. 磁気スタンドからチューブを外してください。
    12. 乾燥したビーズに13μLの洗脱バッファを加えます。
    13. 室温で5分間培養してRNAを溶出します。
    14. チューブを磁気スタンドに戻します。溶液が透明になるまで(約2分)待ちます。
    15. 約13μLの上清液全体を新しいRNaseフリーPCRチューブに慎重に移します。
    16. RNAはすぐに使用するか、-20°Cで保存してください。

3. RT-qPCR

  1. m6 AリッチRNAを逆転写してcDNAに変換します
    1. 逆転写のためにm6A-IP、Input、またはIgG群から精製RNAを使用します。
    2. 逆転写(RT)反応をセットアップします。
      注意:下流qPCR解析で信頼性の高い比較を行うために、すべてのグループでRNA入力が均等であることを必ず確認してください。
  2. qPCR増幅
    1. SYBR Green化学を用いてqPCR反応を準備します。各チューブにSYBRグリーンマスターミックス10 μL(2×)、フォワードプライマー0.5 μL(10 μM)、リバースプライマー0.5 μL(10 μM)、ddH2O7 μL、cDNA 2 μL を加え、十分に混合し、短時間遠心分離してからqPCR装置にロードします。
      注意:各cDNAサンプルに対して3つの複製ウェル(入力、IgG、m6A-IP)を設定してください。プライマーの一覧は 表2 を参照してください。
    2. qPCRプログラムを実行してください。
      1. リアルタイム熱サイクラーでqPCR反応を次のプログラムで実施します:初期変性を95°Cに設定し、30秒間、95°Cでの変性15秒、58°Cでのアニーリング10秒、72°Cでの伸長30秒の40サイクルを実行します。
      2. 増幅後、溶解曲線解析を行い、変性を95°Cに15秒、60°Cで1分間冷却し、さらに0.5°C/sのランプ速度で徐々に温度を95°Cまで上げ、蛍光を連続的に取得して増幅生成物の特異性を確認します。
  3. データ分析
    1. ターゲット群と対照群のCt値を解析します。
    2. 濃縮量を計算する方法のいずれかを用いてください:
      1. メソッド1:入力法の割合
        %入力 = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        注:Ct(Input)とCt(IP)はそれぞれInputサンプルとIPサンプルのサイクル閾値を表し、希釈係数(DF)はqPCRで使用される入力割合の逆数です(例:総RNAの10%が入力として使われた場合、DF = 10)。
      2. 手法2:比較Ct法(2^-ΔΔCt 法)
        ΔCtサンプル=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCt治療−ΔCt対照、Fold=2−ΔΔCt。
        注意:RNA入力量、反応設定、プライマー効率はすべてのサンプルで一貫性を保つこと。

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結果

ここでは、meRIP-qPCR解析の代表的な結果、hFOB1.19および143B細胞におけるc-Mycのm6A修飾レベルを示します。 図2に示すように、抗M6A抗体によるc-Myc濃縮は、背景レベルのみを示したIgG対照群と比較して有意に高かったため、抗M6A抗体が効果的かつ特異的であることを示唆しています。また、c-Mycのm6A修飾レベルは143BでhFOB1.19細胞よりも有意に高かった(P < 0.001)。この発見は、c-Mycが骨肉腫細胞でより多くのm6A修飾を経験していることを示唆しており、これは腫瘍の開始および発生に関与する役割と密接に関連している可能性があります。したがって、m6A修飾はc-Mycの安定性や翻訳効率を調節し、骨肉腫細胞における悪性表現型の維持に寄与する可能性があります。

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ディスカッション

MeRIP-qPCRは、RNA m6A修飾を研究するための有用なツールとして広く応用されています。特に、高スループットのシーケンス結果の検証や、メカニズム的研究において標的遺伝子の特定領域内で修飾部位を正確に局在させることに有用です。さらに、この方法は比較的低コストかつ操作の簡便さから、ほとんどの分子生物学研究室で容易に実装可能であり、エピトランスクリプト体研究において効率的かつ実用的なアプローチとなります8。

成功を確実にするためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、RNAの完全性と品質が不可欠であり、分解されると信頼性の低い結果につながる可能性があります。次に、非特異的結合によるバイアスを排除するためには、入力対照とIgGの両方の制御を含めることが重要である。第三に、抗体の選択が重要です。高い親和性と高特異性を持つM6A抗体のみが信頼性の高い濃縮を保証できます。9...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は、国立自然科学財団(82174408、82374477、82474535、82205145)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100%エタノール上海タイタン科学有限公司、アメリカ1158566
143BATCC、アメリカATCC CRL-8303TM
2×SYBR グリーン qPCR ミックス北京啓恒星バイオテクノロジー有限公司、中国FS-Q1002
デノヴィックス DS-11 デノヴィックスDS-11 分光光度計
DMEM媒体WISENT CORPORATION、中国319-005-CL
DMEM/F-12中型Gibco、アメリカ11320033
エピクイックカット&RUN m6A RNAリッチメント(MeRIP)キットエピゲンテック、アメリカP-9018-24
胎児用牛血清WISENT CORPORATION、中国086-150
hFOB1.19中国科学院細胞バンク(中国)GNHu14
m6A RNAメチル化アッセイキットアブカム、イングランドAB185912
マイクロRNA逆転写キットEZBioscience-EZB、アメリカA0010CGQ
リアルタイムシステムバイオ・ラッド、アメリカCFX96
トータルRNA抽出キットEZBioscience-EZB、アメリカB0004DP
TrypLEエクスプレス酵素Gibco、アメリカ12604021

参考文献

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
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  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

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