組織工学応用のためのヒト皮膚細胞内のトンネルナノチューブ検出の標準化方法

サマリー

ここでは、膜およびFアクチン標識とZスタック共焦点イメージングを用いてヒト表皮ケラチノサイトと皮膚線維芽細胞間のトンネルナノチューブを可視化する標準化されたプロトコルを示し、オプションでα組織工学的応用における再現性検出と細胞骨格特性評価を可能にします。

要約

トンネルナノチューブ(TNT)は、細胞小器官やシグナル伝達貨物の長距離移動を可能にする薄いアクチンベースの細胞間導管です。複数の細胞タイプで広く報告されていますが、人間の皮膚細胞における存在は十分に説明されていません。本記事では、ヒト表皮ケラチノサイトと真皮線維芽細胞間のTNTをin vitroで検出・特徴付ける標準化されたプロトコルについて説明します。この手法は、一次細胞の共培養、脆弱なTNTを保護するための穏やかな固定、小麦胚細胞凝集素による膜標識、ファロイジンによるFアクチン染色、そして逆向き共焦点顕微鏡による系統的なZスタックイメージングを含み、基質上に懸浮しているTNTと付着する糸足を区別します。αチューブリンに対する任意の免疫染色により、微小管の組み込み評価が可能です。TNTは3つの特徴によって定義されます:2つ以上の細胞をつなぐ細くまっすぐな突起、F-アクチンの存在、そして連続光学断片における細胞対間の連続性です。代表的な結果は、TNTが細胞骨格組成(F-アクチン単独またはF-アクチンとα 4-チューブリン)を結びつけることを示しています。重要なステップには、穏やかな固定、新鮮な試薬の使用、誤分類を避けるための十分なz面の取得が含まれますが、一般的なアーティファクトにはTNTの破損や不完全な染色が含まれます。これらの最適化されたステップを合わせることで、皮膚細胞系におけるTNTの再現性検出が可能となり、皮膚生物学および再生におけるTNT媒介コミュニケーションの将来の研究方法論的基盤を提供します。

概要

トンネルナノチューブ(TNT)は、細胞小器官やシグナル分子の直接的な細胞間移動を可能にするナノスケールのアクチンベースのチャネルです。通常、長さ6〜100μm、直径50〜500nmで、一部は厚さ700nmに達すること^{もあります。}空の膜突起とは異なり、TNTは細胞骨格フィラメント、特にF-アクチンを含み、構造の剛性を提供しミトコンド^{リア輸送を}支^えます。二次元培養において、TNTは3つの特徴によって定義されます。2つ以上の細胞をつなぐ薄い(20〜700 nm)の直線的な突起、Fアクチンフィラメントの存在、貨物の移送能力も備えています。

Rustomら5によるPC-12細胞での初同定^以来、TNTは心血管^系6系、免疫^系7系^、呼吸系8系、角膜上皮^系9、腫瘍^系10、神経系^11,12など複数の系で研究されてきました。これらは免疫シグナル伝達、アポトーシス、物質輸送、血管新生などの生理学的および病理学的プロセスに寄与します13,14,15。TNTはミトコンドリア、小胞体、核酸、イオン、さらにはウイルスなど、多様な貨物の長距離輸送を媒介^{することができます。}

皮膚は構造的に複雑な器官であり、表皮と真皮は恒常性、創傷治癒、付属肢の再生のために絶え間ないコミュニケーションに依存しています(18,19,20)。TNTは免疫系、神経系、角膜上皮など多くの組織で報告^{されていますが、}人間の皮膚細胞での存在は発表文献では報告されていません。Sáenz-de-Santa-Maríaらが述べた方法論的枠組みを基^に、免疫蛍光染色と逆焦点顕微鏡を組み合わせて表皮ケラチノサイトと真皮線維芽細胞間のTNT検出を標準化かつ最適化したプロトコル²²を提示します。

他のTNT検出手法と比較して、このプロトコルは感度とアクセスの両立を実用的に保っています。ライブセルイメージングはTNTの動態を捉えることができますが、光毒性とTNTの短寿命性により制限^{されます。}電子顕微鏡は超微細構造の詳細を提供しますが、長いTNTスパンを保存できず、一次皮膚細胞の日常的解析には実用的ではありません^。リポーターベースのナノチューブシステムはリアルタイム追跡を可能にしますが、一次ケラチノサイトや線維芽細胞では通常非効率的である遺伝子操作が必要です^24,26。これに対し、本プロトコルは標準的な免疫蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡を用い、独立に調製された皮膚細胞培養間でTNTを再現可能にしつつ、脆弱な一次細胞との適合性を維持しています。

この方法は、細胞骨格組成やTNTの有病率が関心のある固定サンプル解析に特に適しています。TNTは非常に脆弱であるため、固定や取り扱いの手順が重要な制約であり、リアルタイムのTNT動態を捉えることはできません。それでも、一次ヒト皮膚細胞を扱う研究室にとって、この標準化されたワークフローはTNTを可視化しやすく一貫した方法を提供し、組織工学や再生におけるその潜在的な機能の研究を支援します。

プロトコル

本研究で使用されたすべての皮膚細胞は、割礼手術で廃棄された包皮から得られたヒトの皮膚組織から単離された一次細胞であり、完全に同定除去されました^。人間の皮膚サンプルの採取は寧波大学付属人民病院泌尿器科で行われ、研究プロトコルは機関倫理委員会(プロトコル番号2024104、承認日:2024年10月30日)によって承認されました。

1. ヒト一次皮膚表皮ケラチノサイトおよび真皮線維芽細胞におけるTNTの同定

1. 溶液調製
   1. 固定液1(200μL)を、PFA4%(100μL)、グルタルアルデヒド2.5%(4μL)、HEPES1m(40μL)、PBS1x(56μL)を加えて準備します。新鮮な調理をし、使用前に37°Cまで予温してください。
   2. 固定液2(200μL)を8%PFA(100μL)、1MのHEPES(0.4μL)、1xPBS(99.6μL)を加えて準備します。新鮮な調理をし、使用前に37°Cまで予温してください。
   3. 固定液3(200μL)を8%PFA(100μL)、2.5%グルターアルデヒド(4μL)、1xPBS(96μL)を加えて準備します。新鮮な調理をし、使用前に37°Cまで予温してください。
2. 細胞培養
   1. 適切な培地を用いて60mmの皿でヒト表皮ケラチノサイトおよび皮膚線維芽細胞を解凍・培養します。蘇生時に最終濃度5μMのY-27632をケラチノサイト培養に補足します。培養液は加湿インキュベーターで37°Cの温度で、細胞が~80%のコンバーシティに達するまで維持します。
   2. 培地を取り出し、1mLの1x PBSで細胞を短時間洗浄します(洗浄時に生理的なpHと浸透圧を維持するために使用)。PBSを吸引してください。
   3. 0.05%トリプシンEDTAを1mL加え、均等に分散させ、37°Cで1.5〜2.5分間インキュベートします。
   4. ピペッティングで優しく細胞を再懸濁させます。培地を2mL加え、15mLのチューブに移し、室温で200 x g で5分間遠心分離します。
   5. 上澄液を捨て、ペレットを1〜2mLの培地に再懸浮させます。自動カウンターを使ってセル数を数えます。
   6. 最終体積400μLの8ウェルチャンバースライドの各ウェルに12,000個の真皮線維芽細胞または20,000個のケラチノサイトをシードします。シード後は、細胞を均等に分散させるためにチャンバーをよくクロスシェイクします。37°Cで~24時間培養します。
   7. 約24時間の培養後、顕微鏡で細胞の合流を観察します。80%以上に達したら、次の固定手順に進みます。
3. 固定
   1. 培養液が~80%のコンバーシティに達したら、細胞をプレフィックスするために数滴の固定液1をチャンバーウェルに直接優しく加えます。室温で4分間孵育します。固定液が細胞を乱さずに均等に広がるようにしてください。
      注意:TNTの妨害を避けるため、慎重に取り扱ってください。固定液にはPFAやグルターアルデヒドなどの有害成分が含まれているため、必ず保護手袋、防護服、マスクを着用し、換気フードで取り扱ってください。その後は必ず手をよく洗ってください。PFAおよびグルターアルデヒド固定廃棄物は、ラベル付きの容器に別々に収集し、有害化学物質の処分に備えてください。
   2. 前固定剤を吸引し、140μLの新鮮固定液1に置き換え、井戸全体を覆い尽くします。37°Cで15分間孵化します。
   3. 固定液1を除去し、固定液2を140μL加えます。37°Cで15分間孵化します。 溶液が細胞を完全に覆い、均一な固定を維持してください。
   4. 固定剤を除去し、残留アルデヒドを焼き入れるために100 mM NH₄Clを140 μL加えます。室温で10〜30分培養します。
   5. サンプルを室温で30秒間、1xPBSで3回洗い流し、細胞を洗い流したりTNTを破損させないようにチャンバー壁に沿って優しくピペットで流します。
4. 膜染色および細胞骨格染色
   1. 細胞を140μLの1:300(v/v)WGA(小麦胚凝集素)-アレクサフルオリエンジュート(膜由来のTNTの可視化用に標識する化合物)を、室温の暗い場所で1x1倍のPBSで20分間インキュベートします。
      注意:次のステップは暗い環境で行う必要があります。
   2. PBSを1回(各30秒)で3回洗います。1:250(v/v)希釈したファロイジン共役140μLを1%のBSAに、室温の暗い場所で30分間インキュベークします。
   3. PBSを1回(各30秒)で3回洗います。140 μLのDAPI溶液を室温の暗闇で5分間キュベーキングします。
   4. PBS1×で3回洗います。マウンティングメディウムを2〜3滴加え、室温で20分間培養し、暗闇で4°Cで少なくとも20分間保存してイメージングします。
5. イメージング
   1. 逆立共焦点顕微鏡で40倍対物レンズを使い画像を取得します。ランダムなフィールドを選び、セルの下から上へZスタック(10〜20層)を集めます。画像取得に使用される顕微鏡の具体的なパラメータは以下の通りです。
      共焦点レーザー走査顕微鏡:ZEISS LSM 900
      レーザーライン:トラック1(561 nm、4.0%)、トラック2(488 nm、16.0%)、トラック3(405 nm、60.0%)
      検出器利得:525V
      Zステップサイズ:20の光学セクション(総深さ:5.32μm)

2. 表皮細胞と皮膚細胞の共培養

1. 1.2.1-1.2.5の手順でケラチノサイトと線維芽細胞を準備します。
2. 400μLの培地に10,000個のケラチノサイトと6,000個の線維芽細胞を1チャンバーにシードします。シード後は、細胞を均等に分散させるためにチャンバーをよくクロスシェイクします。37°Cで24時間培養します。
3. 約24時間の培養後、顕微鏡で細胞の合流を観察します。80%以上に達したら、次の固定手順に進みます。
4. ステップ1.3-1.4で説明されているように膜を固定し染色します。
5. 細胞を0.1%のトリトンX-100で透過させ、抗体が細胞内標的にアクセスしやすくし、室温で3分間洗浄し、その後PBSを1倍で3回洗浄します。
   注意:0.1%のTriton X-100は使用前に新しく準備してください。
   注意:トリトンX-100は水生生物に有害であり、化学廃棄物として処分し、決して排水口に流してはいけません。
6. 2%BSAを140μLでブロックし、室温で20分間非特異的抗体結合を減少させます。
   注意:2%のBSAは使用前に新たに準備されるべきです。
7. 抗サイトケラチン5抗体を2%BSAで1:200(v/v)希釈した状態で4°Cで一晩インキュベートします。
8. PBSを1回洗い、その後Alexa Fluor 594結合二次抗体と共に室温暗い環境で1〜2時間インキュベートします。
9. PBS1×で3回洗います。核をDAPIと画像で染色し、ステップ1.4.5-1.5.2の通りにします。

3. TNTの細胞骨格成分の同定

1. 細胞培養
   1. ステップ1.2-1.3のように細胞を培養・固定します。0.1%のTriton X-100で室温で3分間浸透させ、その後PBSで1回洗います。
   2. 2%BSAで室温で20分間ブロックします。抗αチューブリン抗体とともに4°Cで一晩培養します。
   3. PBSを1回3回洗浄し、Alexaフルオナ結合二次抗体で暗い室温で1〜2時間インキュベートします。
      注意:次のステップは暗い環境で行う必要があります。
   4. PBSを1回使って3回洗います。ファロイジンと画像でFアクチンをラベル付けし、手順1.4.3-1.5の通りに画像を付けます
2. 細胞の共培養
   1. ステップ2.1-2.2のように共培養を準備します。固定液3を室温で15分間固定液で固定します。
   2. 100 mM NH₄Clの140 μLに置き換え、室温で10〜30分培養します。PBSを1回使って3回洗います。
   3. まず、2.4-2.8の手順で説明された通りに、透過化、ブロッキング、CK5免疫染色を行い表皮細胞を特定します。
   4. 次に、ステップ3.1.2-3.1.4に従ってα-チューブリン免疫染色を行います。
   5. 最後にファロイジンでFアクチン染色し、手順1.4.2-1.5.2に従って画像診断を進めます。

結果

この標準化されたプロトコルを用いて、トンネルナノチューブ(TNT)は単一培養および共培養条件下の両方でヒトの皮膚細胞内で成功裏に同定されました。抗体特異性の検証のために、実験解析前にすべての抗体に対して陽性および陰性対照染色が実施されました(補 足図1、補足図2、補足図3、 補 足図4に示されています)。代表的な画像は、細胞をつなぐ薄いアクチンを含むチャネルとしてTNTを再現可能に検出できることを示しています。

単細胞集団におけるTNTの検出
皮膚線維芽細胞培養では、TNTが隣接細胞をつなぐ長く細い突起として観察されました。WGA(緑)による膜染色とファロイジン(赤)によるF-アクチン標識により、その同一性が確認され、基質の上にTNTが懸浮し、黄色の矢じりで強調されました(図1)。TNTを基質付着糸足とさらに区別し再現性を高めるために、zスタック画像...

ディスカッション

このプロトコルの重要なステップは、固定および染色の際にTNTを保存することです。これらの構造は非常に脆弱で簡単に破壊されやすいためです。固定時の優しい取り扱い、適切なタイミング、そして新鮮な固定剤の使用がTNTの完全性を維持するために不可欠です。Zスタック共焦点イメージングの使用は、基質の上に懸浮しているTNTを、糸足やその他の付着突起と区別するために同様に重要です。これらは誤認の原因となる可能性があります。これらの考慮事項は、特に強い基質接着や顕著なアクチン系突起を示す皮膚細胞において、実験室間でTNTの再現性を確立するための標準化手順の必要性を強調しています。これらの細胞は、基質の接着が強く、目立つアクチンベースの突出部がTNTの識別を複雑にすることがあります。

固定プロトコルは、異なる実験ニーズに対応するため、3つの異なる解決策で設計され、細かい構造的保存と抗原性のバランスを達成しています。その基本原則は、主要な染色ターゲットの品質を優先し、組成や工程を調整しることにあります。固定液1には2%のPFA、0.0...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15mLチューブ	キルゲン	KG2611	無菌、RNase/Dnase、発熱性フリー
37 & deg;Cインキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	51032877	37度のCO2インキュベーターは理想的なin vitro環境を提供します。
アクチントラッカー レッドローダミン	ビヨタイム	C2207	アクチントラッカーレッドローダミンプローブは蛍光色素ローダミンで標識されたファロイジンで、最大励起波長は540nm、最大放出波長は565nmです。
小麦胚凝集素のAlexaフルオリエン(WGA)	分子プローブ	W11261	Alexa Fluor 488 コンジュゲート
抗αチューブリン抗体	アブカム	AB7291	抗αチューブリン抗体 - ローディングコントロール(ab7291)は、αチューブリンを検出するマウスのモノクローナル抗体です。人間、ネズミ、ネズミに適している。
抗サイトケラチン5抗体およびnbsp;	アブカム	AB52635	抗サイトケラチン5抗体 - 細胞骨格マーカー(ab52635)は、ウサギ用モノクローナル抗体でサイトケラチン5を検出します。人間、ネズミ、ネズミに適している。
アクアポリ/マウント	ポリサイエンス	18606	水溶性で蛍光性のないマウンティングメディウム。水溶液からのセクションを取り付けるために配合されています。蛍光染色を強調・保持するため、免疫蛍光技術に有用です。
自動セルカウンター	カウントスター	IC1000	高速で正確な細胞カウントのための自動セルカウンター
ベンチトップ遠心分離機	バイオリッジ	TD5	実験室環境での迅速かつ効率的なサンプル分離のためのベンチトップ遠心分離機
生物学的安全キャビネット	サーモ・サイエンティフィック	1379	生物安全キャビネットは、空気中の病原体をろ過し、微生物学作業中の交差汚染を防ぐことで、オペレーター、サンプル、環境をバイオハザードから守る無菌封じ込め装置です。
牛血清アルブミン(BSA)	ヨビビオ	U5010-10g	BSAは、583個のアミノ酸残基を含み、分子量66.430 kDa、等電点4.7を含むウシ血清中のグロブリンです
細胞培養皿(60×15 mm)	エッペンドルフ	30701119	組織培養処理済み 無菌で、検出可能な発熱物質、RNase、およびDNase、DNA。
セルヴィスチャンバースライド8チャンバー	セルヴィス	C8-1.5H-N	共焦点顕微鏡などの高解像度イメージング用に設計されています。
DAPI染色溶液	ビヨタイム	C1006-10 mL	DAPI染色液は、すべての一般的な細胞や組織の核染色に適しています。
ヤギ抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor 405)	アブカム	AB175660	ヤギ抗マウスIgG H&L(Alexa Fluor 405)は、最大吸収波長401nm、最大放出波長421nmの二次抗体です。
ヤギ抗ウサギIgG H&LはAlexa Fluor 405に接合	アブカム	ab175652	ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor 405)は、最大吸収波長401nm、最大放出波長421nmの二次抗体です。
ヤギ抗ウサギIgG H&L はAlexa Fluor 594に共役	アブカム	AB150080	ヤギ抗ウサギIgG H&L(Alexa Fluor 594)は、最大吸収波長590nm、最大放出波長617nmの二次抗体です。
逆位置共焦点蛍光顕微鏡	ライカ	TCS SP8 X	ライカSP8 Xレーザー走査共焦点顕微鏡は、先進的な蛍光検出およびライブセル解析能力を備えた比類なき高解像度イメージングを提供します。
逆位置共焦点蛍光顕微鏡	アンドール	BC43	Andor BC43はコンパクトで高速な共焦点顕微鏡で、従来のシステムより10倍高速なイメージングを実現し、ワンクリックの2D/3Dイメージング機能を備えています
NH4Cl	メドケムエクスプレス	HY-Y1269	塩化アンモニウムはpH調節のための極性化合物として使われています。
ファロイジン共役 オレゴン グリーンTM488	ライフ・テクノロジーズ	O7466	色:緑。励起波長範囲:496/520。
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	ビバ・セル・バイオサイエンス	C3582-0500	その役割は培地のpHを生理的な範囲内に保ち、細胞内外の浸透圧バランスを維持することです。
トライトン-X 100	ソーラービオ	T8200-100ml	これは、温和な変性条件下で膜の成分を修復するために使われる多用途な非イオン性界面活性剤です。
トリプシン-EDTA溶液	GIBCO	25300054	消化力の高さから、トリプシンは細胞解離、通常の細胞培養パシング、一次組織解離に広く用いられています。
Y-27632	メドケムエクスプレス	HY-10071	Y-27632は経口活性でATP競合性のあるROCK-IおよびROCK-II阻害剤です