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研究記事

脊髄損傷のラットモデルにおけるGualou Guizhiの抗痙生顆粒が痙縮およびPANoptosisに与える治療効果

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DOI:

10.3791/69894

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2026年2月10日

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1Department of Neurosurgery, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation for Medical Institutions in Fujian Province (Fujian University of Traditional Chinese Medicine), 3Department of Rehabilitation, Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Ultrasound, The Second Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究は、Gualou Guizhi Antispasmodic Granules(GLGZ)が脊髄損傷(SCI)によって引き起こされる痙生に対する影響を、行動的、生体力学的、画像診断、組織学的手法を用いて評価し、PANopsosisに関連するメカニズムを探ります。

要約

脊髄損傷(SCI)後の筋肉痙縮は生活の質に深刻な影響を与え、効果的な治療法は限られています。グアロウ貴治抗けいれん顆粒(GLGZ)は、病院で開発された伝統中国医学(TCM)製剤で、痙攣を緩和することができます。本研究は、脊髄損傷による痙縮におけるGLGZの有効性と、PANopsosis(アポトーシス、ネクロプトーシス、ピロプトーシスを含む新規プログラム細胞死)との関連を評価することを目的としました。

体重180〜200gのオスのスプラグ・ドーリーラットが使用されました。脊髄損傷はアレン体重減少法によって誘発されました。成功したモデルラットは、モデル群またはGLGZ用量群のいずれか(高用量、中用量、低用量)に無作為に割り当てられました。シャムラットは脊髄損傷なく椎弓切除術を受けました。介入は4週間続きました。介入後、四肢の運動機能はバッソ・ビーティー・ブレズナハン(BBB)尺度を用いて評価されました。大腿筋の硬直は超音波せん断波エラストグラフィー(SWE)で評価され、脊髄の完全性は磁気共鳴画像法(MRI)で測定されました。ヘマトキシリン・エオシン(HE)、ニッスル、ルクソールの速速青色染色を行って組織病理学的変異を観察しました。多重免疫蛍光染色を用いて、CARD(ASC、緑色)、カスパーゼ8(オレンジ色)、および受容体相互作用セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ3(RIPK3、黄色)を含むアポトーシス関連スペック様タンパク質を標識し、PANopsosisを評価しました。

GLGZは用量依存的にBBBスコアを改善しました:シャム(21.00 ± 0.00)、モデル(5.8 ± 1.1)、高用量(10.6 ± 1.3)、中用量(8.5 ± 1.2)、低用量(7.1 ± 1.0)。SWEでは筋肉のこわばりが低下しました:モデル(6.68 ± 0.74 m/s)、高線量(2.19 ± 0.36 m/s、P < 0.001)、中線量(3.04 ± 0.45 m/s、P = 0.002)、低線量(4.08 ± 0.65 m/s、P = 0.031)とモデルの比較。モデル群(3.65 ± 1.03 mm²)と比較して、GLGZは全用量群(全<てのPが0.05)で脊髄病変の大きさを減少させました(高用量で1.33 ± 0.79 mm²、中用量で1.94 ± 0.67 mm²、低用量群で2.50± 0.79 mm²)。組織学ではGLGZがニューロンを保存し、ミエリン修復を促進していることが明らかになりました。GLGZは用量依存的にASC、カスパーゼ8、RIPK3の発現を低減させました。

概要

筋肉痙攣は脊髄損傷(SCI)の一般的な合併症であり、患者の生活の質に深刻な影響を与えます。その病理学的過程には、初期の機械的損傷、二次炎症、酸化ストレス、アポトーシス、神経再生の障害などが含まれます。現在の治療(外科的減圧、薬物療法、リハビリテーション)は効果が限定的で、長期服用は薬剤耐性などの副作用を引き起こします。したがって、新しいメカニズムや治療法を探ることが極めて重要です。

最近の研究では、PANopsosis(プログラムされた細胞死であり、アポトーシス(カスパーゼ依存)、ネクロトーシス(RIPK3/MLKL依存)、ピロプトーシス(カスパーゼ-8/GSDMD依存)4が、SCIにおける二次損傷の主要な病理的メカニズムであることが特定されています。(ASC、カスパーゼ8、RIPK3)の異常な活性化はニューロンの喪失とグリア瘢痕の形成を誘発し、痙縮5を悪化させます。PANopsosisを標的化することは、SCIの二次損傷カスケードを断ち切る有望な戦略として浮上しています。

伝統中国医学(TCM)は、抗炎症作用や抗酸化ストレスなどの多重効果により神経疾患の治療で注目を集めています6。Gualou Guizhi 抗痙寒顆粒(GLGZ)は、張中京の『黄金室概要』に由来し、病院用準備として最適化されています。その成分には トリコサンテス・キリロウィ (天華芬)、 シナモム・カッシア (桂芝)、 パエオニア・ラクティフローラ (白韶)、 グリキュリザ・ウラレンシス (甘藻)、ナジュブ、そして生姜8が含まれます。予備的研究では、GLGZが神経伝達物質の調節や炎症の抑制により、中枢神経系損傷後の痙攣を緩和することが示されています。しかし、脊髄損傷による痙縮への影響やPANopsosisとの関連可能性については、まだ解明されていません。

単一標的の従来の薬剤とは異なり、GLGZは多成分構造であることがSCIの複雑な病理ネットワークと一致しており、炎症、神経細胞の喪失、ミエリン損傷、そして場合によってはPANopトーシスにも同時に対処します。本研究はGLGZが脊髄病理修復を促進し(炎症の減少、ニューロンの保存、ミエリン修復)、PANopsosisの抑制を通じて脊髄病理学的修復を促進することで、脊髄損傷ラットの筋肉痙縮を緩和すると仮説を立てています。この仮説を検証することで、症状緩和とSCIのコア病理的修復を統合した有望な治療法としてGLGZを実験的証拠を提供することを目指しています。

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プロトコル

動物モデリング
本研究は福建中医薬大学第二附属病院の倫理委員会(承認番号)によって承認されました。FJPSPH-IAEC2024114)を運営し、動物福祉ガイドラインに準拠して実施されました。体重180〜200gのオスのスプラグ・ドーリーラットは、22〜26°C、湿度40〜70%の管理された環境で飼育されました。脊髄損傷はアレンウェイトドロップ法10によって誘発されました:3-4%のイソフルラン吸入麻酔、T10の正中切開、T9-T11セグメントの露出、椎板切除術(硬膜は無傷)、衝撃(先端2mm、速度0.5 m/s、深さ1.3 mm、持続時間1秒)。シャムラットは椎板切除術を受けましたが、影響はありませんでした。加入基準:術後24時間時点でBBBスコア<8;除外基準:感染、脊髄切断。術後ケア:鎮痛(ブプレノルフィン、0.1 mg/kg、12時間ごとに3日間)、膀胱発現(1週間毎回6時間)、無菌創傷ケア。成功したモデルラットはモデル群にランダムに割り当てられ、高(2.32 g/kg、n = 10)、中(1.16 g/kg、n = 10)、低用量(0.58 g/kg、n = 10)GLGZ群に割り当てられました。

運動機能解析
バッソ、ビーティー、ブレズナハン(BBB)のスコアリングはブラインドで行われました。ラットは5分間、開けた野原で観察され、後肢関節の動き、体重負荷、歩行、協調性を記録しました。

大腿直筋剛性測定のためのせん断波エラストグラフィー
リニアアレイプローブを用いたドップラー超音波システム(18L6)が使用されました。ラットは側方横臥(筋弛緩)状態に置かれました。SWEは、プローブを筋肉に対して90°の角度で、深さ1〜2cmで配置して実施されました。関心領域(ROI)は0.5 × 0.5 cmに設定され、1回の測定で10フレームが取得されました。最終的な剛性値は、3つの有効な測定値の平均を表しました。せん断波速度(SWV)が記録されました。グリーン品質管理は有効な画像を示しました。11。

MRI検査
MRIはT2加重脂肪抑制配列と動物特異的コイルを用いた7.0Tスキャナーで実施されました。取得パラメータは以下の通りです:繰り返し時間(TR)3,800 ms、エコー時間(TE)72 ms、スライス厚さ 1 mm、ボクセルサイズ 0.1 × 0.1 × 1 mm、マトリックス 256 × 256、視野角(FOV)25.6 × 25.6 mm、4つの信号平均、呼吸ゲーティング。病変面積は画像処理ソフトウェアを用いて測定されました。

組織学的染色
HE染色は、連続脱硫、再水和、5分間のヘマトキシリン染色、流水での洗浄、1%塩酸・エタノールでの30秒分化、2分間のエオシン染色、脱水、透明化、マウントによって実施されました。視覚的なチェックポイントとして、染色切片から青色核と赤色細胞質が確認されました。

ニッスル染色は、脱硫、再水和、0.1%トルイジンブルーで50〜60°Cで30分間培養し、その後蒸留水で洗浄、エタノール分化、脱水、透明化、マウントによって行われました。視覚的なチェックポイントとして、偽のグループには濃紺色の日産車体がはっきりと確認されました。

ルクソールファストブルークレシルバイオレット染色は、脱脂、再水和、60°Cでルクソールファストブルーで2時間培養、95%エタノールで洗浄、リチウム炭酸塩で30秒分化、その後70%エタノール分化、クレシルバイオレットカウンターステイン10分、脱水、クリア、マウントによって実施されました。クレシルバイオレットの作動濃度は0.1%でした。視覚的なチェックポイントとして、シャム群では濃紺色のミエリンが観察されました。

多重免疫蛍光染色は、脱脂、再水和、抗原回収を用いて、クエン酸バッファー(pH 6.0)を95°Cで20分間行った。切片は3%過酸化水素で10分間処理し、その後37°Cで5%BSAで1時間ブロッキングしました。一次抗体は4°C(ASC: 1:500;カスパーゼ8:1:400;RIPK3: 1:500)。PBS-T(0.1% Tween-20、3×5分)で洗浄した後、切片をHRP標識二次抗体(1:1000)で37°Cで1時間インキュベートしました。その後、フルオロクロム標識を塗布しました:ASCにはYTR520 Plus、Caspase8にはTYR570 Plus、RIPK3にはTYR690 Plus(30分)、その後5分間DAPI核染色を行いました。スライドが装着され、蛍光顕微鏡を用いて500ms露光、ゲイン1.0、倍率×200、フィルターセットがそれぞれの蛍光色素に適合した画像撮影が行われました。

キシレンとエタノールの場合、すべての操作はフムフード内で行われ、使用時は手袋とゴーグルを着用していました。染色試薬については、皮膚に直接接触することは厳しく避けられました。すべての廃棄物試薬は指定された有害廃棄物容器に処分されました。バイオハザード物質については、最終処分前に徹底的なオートクレーブ滅菌が行われ、生物的汚染の可能性を防いでいます。

統計解析
群比較には一方向ANOVAを用いたLSD事後検査が用いられました。P < 0.05は統計的に有意とされました。

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結果

BBBスコア
シャム群BBBスコアは21.00±0.00で、モデルのもの(5.8±1.1、P<0.001)を大きく上回りました。GLGZの用量依存的BBBスコアは増加しました:高用量(10.6 ± 1.3、P < 0.001)、中用量(8.5 ± 1.2、P = 0.003)、低用量(7.1 ± 1.0、P = 0.028)とモデル比較(図1)。

大腿直筋剛性のせん断波エラストグラフィー解析
せん断波エラストグラフィー(SWE)は、色マッピングや数値値を用いて筋肉の剛性の変化を反映できます。左の画像は品質管理図を示しており、緑色は良好な画質を示します。右の画像は筋肉の剛性の色のスケールを示しており、高い剛性は赤または黄色の部分、低い剛性は青または緑の部分で示されています。シャムのSWVは1.27±0.31 m/sでした。モデルSWV(6.68 ± 0.74 m/s)は有意に高く...

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ディスカッション

本研究は、脊髄損傷ラットにおけるGLGZの筋肉痙縮に対する改善効果を体系的に評価し、神経保護およびPANopsosisとの関係を探りました。結果は、GLGZが用量依存的に脊髄損傷ラットのBBBスコアを改善し、筋肉のこわばりを軽減できることを示しました。また、GLGZの作用機序が神経保護、ミエリン修復、PANopsosisの阻害に関連している可能性も示されました。現在、脊髄損傷後筋痙生に対する臨床的薬物治療は主に症状の緩和にとどまり、脊髄損傷の根本的な病理的問題には対処していません。この研究は動物実験を通じて、GLGZが筋肉痙縮の症状を効果的に改善するだけでなく、脊髄損傷の主要な病理過程を標的に修復することを確認しました。これにより、GLGZを脊髄損傷治療に利用する実験的証拠が示されています。

結果は、GLGZがSCIラットのBasso-Beattie-Bresnahan(BBB)スコアを有意に改善していることを示しました。モデル群と比較して、高用量群、中用量群、低用量群はそれぞれBBBスコアが82.76%、46....

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

本研究は福建省衛生委員会の主要科学研究プロジェクト(2024ZD01006)、2023年臨床研究所オープンプロジェクト(LC2023001-研究所)、福建省自然科学基金(2024J01733)、福建衛生委員会医療イノベーション研究プロジェクト(2022CXA052)、福建中医大学の主要科学技術イノベーションプロジェクトのリストリーダーシップ採用プロジェクト(XJB2022003-3)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノール 240403A1 脱水
無水エタノール 241101A1染色
抗蛍光減衰フィルムコーティング剤(DAPI含有)およびnbsp;MA0221  免疫蛍光染色
ASC抗体Bs-6741RPANopsosis解析(1:300)
カスパーゼ8抗体13423-1-APPANopsosis分析(1:400)
蛍光顕微鏡 ニコンECLIPSECi-L 
完全自動デジタルガラススライドスキャナー GCell-60スライドスキャナー
ヘマトキシリン・イオシンキットR23718ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色
画像解析ソフトウェアNIHImageJ 1.53k
ルクソール・ファストブルーR23193ルクソールファストブルークレシルバイオレットステイン
MRIスキャナーブルーカー7.0T
多重蛍光染色キット 240522 免疫蛍光染色
骨髄染色キット G3245 骨髄性着色 
中立 バルサム  MB9899 染色後の取り付け
NisslステインキットR23093 ニッスル染色
RIPK3抗体Bs-3551RPANopsosis分析(1:400)
SPSS 22.0統計分析ソフトウェア 
スプラグ・ドーリーのネズミとnbsp;福州の漢怡バイオテクノロジー企業
酒石酸、トリポリリン酸ナトリウム10019418染色
超音波システムシーメンス・アクソン リニアアレイプローブ(18L6)
キシレン240904A2染色

参考文献

  1. Sezer, N., Akkuş, S., Uğurlu, F. G. Chronic complications of spinal cord injury. World J Orthop. 6 (1), 24(2015).
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  4. Li, P., et al. PANoptosis: cross-talk among apoptosis, necroptosis, and pyroptosis in neurological disorders. J Inflamm Res. 2025, 8131-8140 (2025).
  5. Lou, J., et al. TRIM56 modulates YBX1 degradation to ameliorate ZBP1-mediated neuronal PANoptosis in spinal cord injury. Adv Sci. 11 (42), 2407132(2024).
  6. Lu, Y., et al. Research progress in use of traditional Chinese medicine for treatment of spinal cord injury. Biomed Pharmacother. 127, 110136(2020).
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