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方法論記事

LncRNAノックダウン骨肉腫細胞の増殖能力を検出するコロニー形成アッセイ

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DOI：

10.3791/69910

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2026年1月16日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この実験プロトコルは、lncRNAのノックダウンとコロニー形成アッセイを組み合わせ、lncRNAが骨肉腫細胞増殖に与える影響を定量化する、安定的でコスト効率が高く効率的な方法を提供します。

要約

異常な長非コードRNA(lncRNA)の発現は、骨肉腫細胞の細胞増殖に大きな影響を与え、これらが治療標的となる可能性を示唆しています。しかし、lncRNAの機能的研究は主に理論的であり、検証は限られています。単一細胞の最終的な増殖運命を具体的に反映したコロニー形成アッセイは、長期的な増殖能力を評価するためのゴールドスタンダードとされています。本プロトコルは、lncRNAノックダウン細胞におけるコロニー形成アッセイを用いて、lncRNAが骨肉腫細胞の増殖能力に与える影響を評価する信頼性の高い実験プロトコルを確立しました。この実験プロトコルは、lncRNAが骨肉腫細胞増殖に与える調節効果を評価するための、安定的で費用対効果が高く効率的なアッセイを提供します。このアプローチは骨肉腫細胞の研究に適しているだけでなく、他の腫瘍におけるlncRNA制御細胞増殖能力の実現可能なツールとしても機能します。本研究には、lncRNAノックダウンおよびコロニー形成アッセイの詳細な検出プロトコルが含まれ、骨肉腫細胞における小さな核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)のノックダウン例(143B)が行われました。実験結果はSNHG6発現の効率的な抑制が認められ、コロニーの数とサイズの著しい減少を伴いました。これらの発見は、SNHG6が骨肉腫細胞の長期的な増殖能力を維持するために不可欠であることを示唆しています(143B)。

概要

タンパク質コードポテンシャルを持たない200ヌクレオチドを超える転写産物と定義される長非コードRNA(lncRNA)は、近年多様な生物学的プロセスの重要な調節因子として浮上しています1,2。これらは、骨肉腫、前立腺がん、肺がんなど、さまざまながんの発症や発症において重要な役割を果たします。骨肉腫において、蓄積される証拠は異常な長非コードRNA(lncRNA)発現が細胞増殖に深い影響を与えることを示唆しています。例えば、lncRNA POU3F3のサイレンシングは骨肉腫細胞(MG63およびU2OS)の増殖を有意に抑制し、アポトーシスを促進しました6。同様に、lncRNA HOXA-AS3のノックダウンはU2OSおよびSW1353細胞のコロニー形成を減少させ、増殖を抑制しました7。制御されていない増殖はがん生物学の特徴であり、治療戦略の主要な決定要因であることを踏まえ、特に骨肉腫における腫瘍におけるlncRNA制御細胞増殖の解明は依然として非常に重要かつ必要不可欠です。

細胞増殖を評価するためのいくつかのアプローチが存在するものの、それぞれに固有の限界があります。CCK-8やMTTのような比色法や代謝アッセイは、便利で迅速かつ高スループットです。しかし、これらは主に短期的な読み取りを行い、代謝変動によって混乱しやすく、使用される試薬による光学的または光化学的干渉のリスクも伴います。BrdUやEdU組み込みを含むDNA合成ベースの手法は、長期的な増殖アウトカムを反映しないS期侵入のスナップショット解析に限定しつつ、より高い特異性を提供します(9,10)。同様に、Ki-67のような増殖マーカーの免疫染色は、細胞周期の即時活動のみを示し、クロノジェネーション能力10の予測には至らない。RTCAのようなリアルタイムモニタリングシステムは、高い再現性を持つ連続成長曲線解析を可能にしますが、高コストと短期・中期評価に限定されているため、実用性は低下します11。対照的に、クロンジェニックアッセイは単一の細胞が無限に増殖し、目に見えるコロニーを形成する能力を独自に捉え、その最終的な運命を直接反映しています。労力と時間のかかるものの、クロンジェニックアッセイは長期的な増殖の可能性を評価するゴールドスタンダードであり、短期的または代替的なアッセイでは得られない洞察を提供します。

ここでは、143B骨肉腫細胞におけるSNHG6ノックダウンの例を含むlncRNAノックダウンおよびコロニー形成アッセイの詳細な検出プロトコルを含みます。このアプローチは骨肉腫研究に応用できるだけでなく、他の腫瘍におけるlncRNA媒介増殖の調査にも有効なツールとなります。

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プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. プラスミドトランスフェクション

  1. 10cm培養皿あたり5個×143B細胞5個(合計2皿)を植え、細胞を完全培地(DMEM + 10% FBS)で37°Cの5%CO2インキュベーターで培養します。
  2. 24時間後にトランスフェクション試薬を準備し、プラスミド(shNCおよびshSNHG6)、PEI、Opti-MEMを含む。
    注意:使用前にボルテックスを使い、すべてが常温に平衡されていることを確認してください。
  3. 1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブを4本取り出し、プラスミド(shNCとshSNHG6)とPEI(2本)をマーカーペンで標識します。
  4. 各チューブに500μLのOpti-MEMを加えます。
  5. プラスミドチューブ(shNCまたはshSNHG6)にプラスミド10μgを加え、各PEIチューブにPEIを30μL(1μg/μL)追加します。
  6. 上下に優しく混ぜ、室温で5分間孵育します。
  7. プラスミドチューブとPEIチューブを組み合わせ、優しく混ぜて室温で20分間培養します。
  8. インキュベーターから143B細胞を取り出し、培地を優しく吸引します。各皿に7mLの血清フリー培地を加えます。添加するプラスミド(143B shNCまたは143B shSNHG6)を示すラベルを付けてください。
  9. あらかじめ準備されたトランスフェクション混合物を、対応する培養皿に滴りずつ加えます。
    注意:混合物をピペットで円を描くようにゆっくり加え、外縁から皿の中央に均等に注ぎます。CO2濃度5%のインキュベーターで37°Cで培養します。
  10. 8〜12時間後に上清液を廃棄し、各10cm培養皿に10mLの完全なDMEM培地を加えます。細胞は5%CO2 インキュベーターで37°Cで培養します。
  11. 上澄液を捨てて完全なDMEM培地に置き換えた後、72時間後に蛍光顕微鏡で観察してください。

2. コロニー形成アッセイ

  1. 10cm培養皿(shNCおよびshSNHG6)から培地を取り出し、1.5 mLのトリプシン-EDTAを加えて細胞を消化し、ピペットで優しく剥離し、最後に5mLの全培地を加えて消化を終えます。
  2. 細胞懸濁液を15 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
  3. 20μLのセル懸濁液を取り出し、セル数を数えます。
    注意:shNCグループとshSNHG6グループの細胞数が一貫していることを確認するために、セルカウントは複数回行う必要があります。ここでは、SNHG6ノックダウン効率のRT-PCR検証のために3×10個の5 細胞を採取します。
  4. 6ウェルプレートに10個の3 セル×2個シード。完全なDMEM培地を最終体積2 mLに加え、細胞を37°Cで5%CO2 インキュベーターで培養します。
    注意:培地は1日おきに新しい完全なDMEM培地に交換してください。
  5. コロニー形成を毎日監視してください。
    注意:対照群(shNC)のほとんどのコロニーが≥50個の細胞を含むか、10〜14日間の潜伏後のいずれか早い方で培養を終了してください。
  6. インキュベーターから細胞を取り出し、上清液を捨てます。
  7. 1ウェルごとに1mLのPBSで細胞を2回洗浄し、各洗浄後にPBSを廃棄します。
  8. 細胞を10%ホルマリン溶液1mLで15分間固定し、その後10%ホルマリン溶液を廃棄します。
  9. 1ウェルごとに1mLのPBSで細胞を2回洗浄し、各洗浄後にPBSを廃棄します。
  10. 細胞を0.5%のクリスタルバイオレット染色液1mLで10〜30分間染色し、その後廃棄します。
  11. ゆっくり流れる水道水で細胞を優しく洗います。
  12. 室温で自然乾燥をします。
  13. カメラで画像を撮影しましょう。

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結果

lncRNA SNHG6が骨肉腫細胞の増殖能力に与える影響を評価するため、私たちはプラスミド媒介によるノックダウンシステムを確立し、コロニー形成アッセイを実施しました。実験ワークフローには、143B細胞のプラスミドトランスフェクションおよびコロニー形成アッセイが含まれていました(図1)。

143B細胞のトランスフェクション効率は、トランスフェクションから72時間後に蛍光顕微鏡で確認されました(図2)。結果は、対照群(shNC)およびSNHG6ノックダウン群(shSNHG6)の143細胞の蛍光強度が一貫していることを示し、対照群とノックダウン群の両方のプラスミドが143B細胞に成功裏にトランスフェクトされたことを示唆しました。

RT-qPCR解析により、shSNHG6プラスミドをトランスフェクトした143B細胞におけるSNHG6のノックダウンが...

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ディスカッション

がん関連lncRNAを治療的に標的化し、バイオマーカーとしての診断的有用性を活用することは、がん管理における新たなアプローチを示しています。lncRNAが骨肉腫の病因に果たす役割を定義することは、診断、治療、予後を進める上で極めて重要です。

このアッセイの成功を確実にするためには重要な手順を踏む必要があります。まず、単一の細胞懸濁液を確立することは信頼性の高いクローンアッセイの絶対的前提条件であり、細胞集合体の存在は偽コロニーを引き起こし、結果の妥当性を損なう可能性があるためです12。信頼性の高い単一細胞懸濁液を確立するために、トリプシン-EDTAを用いて細胞解離を行い、その後優しくピペッティングして凝集体を除去します。優しいピペッティングを繰り返し行うことで、プレート12、13の前に完全な解離が確認されます。次に、シーディング密度の最適化も重要です。...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は、国立自然科学財団(82174408、82374477、82474535、82205145)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL マイクロチューブメルクAXYMCT150C
10%中性緩衝ホルマリンヴィクトレックス5205000
100 - 1000 & mu;L 拡張グラデーションブルーチップ上海バイオサイエンス有限公司BS10401ML
100mm細胞培養皿実験室無錫NESTバイオテクノロジー有限公司704001
143BATCCATCC CRL-8303TM
15 mL遠心分離機チューブ上海バイオサイエンス有限公司BL2002150
6ウェル細胞培養プレート無錫NESTバイオテクノロジー有限公司703001
CO2インキュベーターサーモフィッシャーテクノロジー(中国)有限公司300583057
クリスタル・バイオレットTCI上海C0428
DMEM媒体ワイント・コーポレーション319-005-CL
エッペンドルフ・リサーチ・プラスエッペンドルフ3123000233
FBS - 優れた品質ワイント・コーポレーション086-150
マークペンゼブラ・トレーディング(深圳)有限公司およびnbsp;YYST5
オプティMEMギブコ31985070
パスツール・ピペットラブギックBS-XG-O3L
PBSバッファー(ドライパウダー)ラブギックBL601A
PEIポリサイエンス24765
ピペットの先端メルクAXYT200Y
TrypLEエクスプレス酵素ギブコ12604021
トリプシン/EDTAギブコR001100

参考文献

  1. Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
  2. Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
  3. Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
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  5. Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
  6. Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
  7. Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
  8. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
  9. Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
  10. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
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  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
  13. Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
  14. Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
  15. Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).

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