レーザースペックル技術を用いたAPP/PS1マウスにおける脳血流への電気鍼治療効果の評価

サマリー

ここでは、レーザースペックル造影画像法を用いた脳血流を定量化し、Morris Water Mazeを組み合わせてAPP/PS1(ADモデル)マウスにおける電気鍼治療の効果を評価するプロトコルを紹介します。これはAD脳血管研究に有用です。

要約

アルツハイマー病(AD)は、進行性の認知機能低下と脳血管機能障害を特徴とし、脳血流(CBF)の減少や神経血管単位の障害を含みます。電気鍼治療(EA)は神経機能の改善に潜在的であることが示されており、そのメカニズムはCBFの調節に関連している可能性があります。レーザースペックルイメージングはCBFのリアルタイム評価のための広視野手法であり、脳血流の変化を正確に評価できます。本実験では、電気鍼治療がADモデルマウス(APP/PS1トランスジェニックマウス)におけるCBFおよび認知能力に与える影響を観察しました。マウスの中脳動脈およびその枝血管の血液灌流はレーザースペックルイメージングで観察されました。マウスの空間認知機能はモリス水迷路を用いて評価されました。結果は、EAがAPP/PS1マウスの認知機能を向上させる可能性があり、Morris水迷路テストでは脱出遅延が有意に減少したことが示されました(P<0.05)。さらに、レーザースペックル造影画像法(LSCI)により、ADモデルマウスで野生型対照群と比較して有意な脳低灌流が確認されました(P < 0.05)、さらに重要なことに、EA処理によりCBFが統計的に有意に増加し(P < 0.05)、ADマウスの脳低灌流が逆転しました。レーザースペックルイメージングは、EAによる脳血管改善を評価するための可視化技術です。これらの結果は、脳血管機能障害を標的としたアドマーツ病の補助療法としてのEAを支持しています。

概要

アルツハイマー病(AD)は、進行性の認知障害と記憶力の低下を特徴とする進行性の神経変性疾患です。細胞外ベータアミロイド(Aβ)プラーク、細胞内神経線維絡線(NFT)、およびニュー^{ロンの喪失}の病理的特徴を処理します。これらの古典的な特徴が治療研究の主な焦点であった一方で、増え続ける証拠は、^AD2の病因と進行における脳血流減少(CBF)の重要な役割を強調しています。CBF減少はAD発症初期に起こり、認知機能障害の重症度と関連しています^。したがって、脳血管損傷を改善する治療戦略は、ADの症状を緩和し、病気の進行を改善する効果的な方法です。

電気鍼治療(EA)は、伝統的な鍼治療と電気刺激を統合した現代的な技術であり、ADの認知機能改善に可能性が示されています。研究によると、EAはAβ沈着の減少、神経炎症の軽減、シナプス可塑性の促進など、複数のメカニズムを通じて有益な効果を発揮する可能性が示唆されています^。特筆すべきは、EAの神経保護効果が^CBF5の調節能力と密接に関連している可能性についての推測が増えていることです。しかし、ADモデルにおけるEAが脳血行動態に与える影響を示す直接的かつリアルタイムの証拠は限られています。そのような証拠の欠如は、EAが脳機能をどのように改善するかを包括的に理解することを妨げています。

光学イメージングの技術革新は、脳血行動態の調査に強力なツールを提供しました。高速で広視野の光学技術であるLSCIは、体積組織血流マップ⁶の可視化に高い時空間分解能を提供し、電気鍼による灌流動態のリアルタイムモニタリングを可能にします。最適な光学アクセスには頭蓋骨への露出が必要ですが、LSCIは侵襲的な組織の侵入を避けます。LSCIは1990年代に導入され、過去数十年にわたり神経科学で広く応用^{されています。}すべての画像診断技術と同様に、LSCIには固有の限界があります。光学的浸透深度が制限されており、表層皮質血管を有利にし、深部脳領域(例:海馬、基底核)へのアクセスを制限します。また、絶対的なCBF値ではなく相対的な血流(灌流単位)を定量化し、血管形態や組織の光学散乱の影響で精度が微妙に影響されます^8,9.しかし、これらの制限はLSCIの有用性を損なうものではなく、表層皮質血流のリアルタイム評価におけるその専門的な応用を定義しています。EA誘発皮質灌流変化に焦点を当てた研究において、LSCIは信頼性が高く実践可能なデータを提供します。具体的には、ターゲットROIの区分と最適化パラメータを備えた標準化されたLSCIプロトコルを確立し、APP/PS1マウスにおけるCBFを定量化し、脳血管改善と認知アウトカムを結びつけるMorris Water Maze試験を補完しました。

プロトコル

このプロトコルは北京中医科大学動物倫理委員会(BUCM20250708-005)によって承認され、中国の実験動物の飼育・使用に関するすべてのガイドラインに準拠していました。

1. 準備

1. この実験では、6か月のオスのAPP/PS1マウス1と6か月のオスのC57bl/6マウス6匹が使用されました。
2. すべてのマウスは北京中医薬大学動物実験センターに収容され、ケージに3匹ずつ飼育されていました。彼らは無菌の飲料水と標準的なペレット食を自由に利用できました。
3. 住宅環境は12時間の明暗サイクルで維持され、周囲温度は23 ± 2°Cで制御されていました。

2. 動物のグループ化と介入

1. 6か月齢のオスのAPP/PS1マウス1(体重27.88g±0.48g)を、アルツハイマー病(AD)モデル群と電気鍼治療(EA)治療群の2つの実験群(n=6/群)にランダムに割り当てます。
2. 野生型(WT)グループとして、6ヶ月齢のオスのC57BL/6マウス(体重29.90 g ± 0.81 g)を用います。
3. WT対照群およびADモデル群では、マウスを十分に通気されたマウス拘束器で優しく拘束し、実験的介入は行わないでください。
4. EA治療群では、WT対照群やADモデル群で使うマウス拘束器で優しく拘束し、過度な動きを抑えつつ呼吸が妨げられないようにします。この標準化された拘束条件下で、使い捨ての滅菌鍼(0.25 mm × 13 mm)を、頭部の白匯(GV20)および陰堂(GV29)の穴位(図1A)に鼻に向かって、2〜3 mmの深さを一定にして挿入します。EAデバイスの正極と負極をそれぞれこれら2つの経穴に接続し、15分間刺激を行います(図1B)。刺激パラメータを分散高密度波パターンとして構成し、強度0.1 mA、周波数2 Hzで設定します。
5. 各グループに48時間ごとに1回、各セッションは15分間、合計30日間のインターベンションを実施します。
   注意:2020年5月15日に中国鍼灸協会が発行した標準であるT/CAAM 0002-2020:実験動物用鍼穴の名前と位置 パート3:マウス¹⁰号に基づき、経穴の選択、位置特定、針刺術を実施してください。

3. MWMテスト

注:30日間の介入期間から24時間後、3つの実験群の全マウスをモリス・ウォーターメイズ(MWM)テストに投与し、隠れたプラットフォーム(位置ナビゲーション)試験とプロー^{ブ試験の両方}を含み^ます。正式な試験前に1日間の順応期間を設け、ストレスを最小限に抑え、マウスが実験室、MWM装置、取り扱い手順に慣れるようにしましょう。

1. 準備手続き
   1. MWM装置および関連する信号取得・処理システムを、音衰実験室に設置します。試験環境の周囲温度を約25°Cに保ち、照明条件を以下のように標準化します:迷路の4つの区画の上に、天井カメラに映らない高さで60WのLED管ライト4基を設置します。不透明なカーテンが試験エリア全体を囲み、外部からの環境干渉を防ぎ、意図しない空間的手がかりがマウスのナビゲーションに影響するのを防ぎました。
   2. MWMセットアップの中央に直径90cm×高さ50cmの円形の白いタンクを設置します。天井に取り付けたビデオカメラを自動追跡システムとレコーダーに接続し、テスト中も連続的にデータを取得します。
   3. タンクを北(北)、南(南)、東(東)、西(西)の4つの等しい領域に分け、さらに北東(NE)、北西(NW)、南西(SW)、南東(SE)の4つの合同な四分円に分割します。
   4. 各象限の外壁に、マウスの視線内に位置する明確な形状(正方形、三角形、円)を接頭し、空間的な基準点として配置します。
   5. 水槽に30cmの水を24 ± 1°Cで電気ヒーターで満たします。白い食用顔料を加えて水を不透明にします。
2. 隠れたプラットフォーム試験
   1. この試験期間中、SE象限に沈んだプラットフォームを固定してください。
   2. ネズミを3つの交互の区画(北東、北西、南西)からランダムにプールに放し、一貫性を保つために最初の向きを水槽の壁に向けます。
   3. 各マウスに最大60秒の時間を与えて、隠されたプラットフォームを独立して見つけましょう。
   4. 各試行ごとにエスケープレイテンシ(リリースからプラットフォーム上昇までの時間)を記録し、空間学習を評価します。
      注:各マウスは5日間連続で1日3回の試験を完了しました。60秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合、優しくプラットフォームに誘導され、空間記憶を強化するために10秒間そこに留まらせてから試験を終了しました。
3. プローブ・トライアル
   1. プラットフォームを撤去してください。
   2. ネズミを一度ずつ水槽の壁に向かってプールに放し、60分間自由に泳がせてください。
   3. 主要な成果指標:平均泳速と旧ホーム位置での渡河回数を記録します。
4. 検査後のケア
   1. 毎回のMWMセッション後は、柔らかいタオルでしっかり乾かし、電気ヒーターで優しく温めて低体温症を防ぎます。

4. レーザースペックルコントラストイメージング

1. 各グループからランダムに3匹のマウスを選び、LSCIシステムを使ってリアルタイムかつ全野でCBFを監視します。
2. 動物の準備:すべての動物手術は麻酔下で行います。マウスには1.25%トリブロモエタノール(0.02 mL/g)を腹腔内注射で麻酔し、連続的な自然呼吸を確保し、水平手術板に置きます。麻酔を受けたマウスを、37°Cに保温されたサーモスタティック加熱パッドの上に置き、体温を安定させます。頭皮を剃り、下の筋肉や髄膜を慎重に解剖して頭蓋骨を露出させます。乾燥を防ぐため、露出した頭蓋表面を0.9%の無菌生理食塩水で湿らせて処置中を保ちます。
3. 画像診断のセットアップ:システムのスキャンヘッドを露出した頭蓋窓に対して20cmの固定距離で垂直に位置させます。オートフォーカスおよびオートゲイン機能を有効にし、画像の鮮明さとコントラストを最適化し、すべての実験でゲイン値を140〜160の範囲内に自動的に維持します。追加の標準化イメージングパラメータを次のように設定します:露光時間=20ms、時間定数=1.0秒、動作モード=時間、フィルター=250フレーム、サンプル間隔=5000ms、画像解像度=1032×772。
4. データ取得:25Hzサンプリングレートで連続スペックル画像を取得し、事前設定された時間パラメータおよびフィルターパラメータに同期します。
5. ROI分析:解析ソフトウェアを使って前頭前野の関心領域(ROI)を定義し、特にこの大脳皮質領域内の前大脳動脈領域を標的とします。これらの血管領域のROIを明確にし、各ROIから平均フラックス値(灌流単位で表される)を抽出し、その後の統計的比較に備えます。

5. 統計分析

1. SPSS 27.0を用いて統計解析を行います。
2. 隠れたプラットフォームのグループ差を解析し、試験結果をプローブし、CBFを学生のt検定を用いて分析しました。統計的有意性をP < 0.05と定義し、高い統計的有意性をP < 0.01と設定します。

結果

ADモデルマウスにおけるEAが空間学習および記憶に与える影響

モリス水迷路テストの結果は 図2に示されています。 図2A は、隠れたプラットフォームテスト中の5日間の脱出遅延を示しています。AD群の脱出潜伏は変動傾向を示した一方で、WT群およびEA群は着実に減少しました。AD群の脱出遅延は4日目から5日目までWT群よりも有意に長く(P < 0.01)。EA群は4日目から5日目までの遅延がAD群に比べて有意に短く(P < 0.05)、

図2B はプローブテストの結果を示しています。泳速はAD群がWT群に比べて低く(P < 0.05)、プラットフォームクロスオーバー数に有意な違いは見られませんでした。

ディスカッション

本研究は、Baihui(GV20)およびYintang(GV29)経穴での長期EA介入が、Morris Water Maze隠蔽プラットフォームテストにおける脱出遅延の短縮に反映され、APP/PS1トランスジェニックマウスにおける空間学習障害を有意に改善することを示しています。この発見は、EAがAβ沈着の減少や神経炎症の減弱などのメカニズムを通じて、さまざまなADモデルにおける認知機能を改善するという以前の報告と一致しています¹³。特に、経点選択は伝統中国医学の理論に基づいており、認知障害の管理に応用する伝統的な根拠を提供しています¹⁴。

本研究の核心的発見は、LSCIによって定量化されたことで、APP/PS1トランスジェニックマウスにおいて野生型対照群と比較してCBFが有意に減少していることの確認です。この観察は、脳の低灌流がADの病因の顕著な特徴であることを示した広範な臨床および前臨床文献と一致しています。CBFの減...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鍼治療針	(北京中炎太和薬薬有限公司、中国	0.25 mm & 時間;13mm	鍼治療針
レーザースペックルコントラストイメージングシステム	Gene&私は科学的です。Ltd.	ムーアFLPI-2
マウス拘束器	恒台実験設備センター	HT-A2
トリブロモエタノール	南京愛北バイオテクノロジー有限公司およびnbsp;	M2910	麻酔