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方法論記事

ラットにおける慢性頭蓋内多電極心波記録の術後回復と安定性

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DOI：

10.3791/69937

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2026年4月24日

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1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ラットにおける慢性多電極EEG移植後の術後評価のための標準化された枠組みを示し、信号質の逐次モニタリング、行動回復、神経炎症マーカーのモニタリングを行い、安定した長期記録の適切な開始を判断します。

要約

頭蓋内多電極埋め込みは脳領域を横断した神経信号の同時取得を可能にしますが、術後の乱れが生じ、データの品質や実験タイミングに影響を与える可能性があります。このプロトコルは、スプラグ–ドーリーラットにおける慢性多部位頭蓋内EEG電極移植および構造化された移植後評価の標準化されたワークフローを説明しています。タングステンワイヤー電極は、組織の破壊を最小限に抑える手術戦略を用いて、前帯状皮質、海馬CA1、内嗅皮質の3つのあらかじめ定められた頭蓋内部位に立体的に埋め込みます。

着床後、プロトコルは電極定位精度、局所電位の完全性、痛み関連行動、摂食行動、神経炎症マーカーの5つの領域にわたる縦断的評価を規定します。電気生理学的および行動的評価は、術後初期の影響の一貫したモニタリングを支援するために、あらかじめ定められた術後時刻点(ベースラインおよび1日目、4日目、7日目、10日目、13日目)で実施されます(n = 3)。組織学的解析は研究終了時の局所組織反応の特徴付けに用いられます(n=3回あたり)。

運用基準と評価間隔が提供され、実験準備状況や長期記録開始に関する意思決定を導きます。このプロトコルは着床後のモニタリングに構造化されたアプローチを提供し、下流の神経生理学的実験の適切なタイミングを判断します。

概要

頭蓋内脳波計(EEG)は、脳組織から直接信号を記録することで神経活動の高解像度測定を可能にします 1,2 これにより、頭皮EEGアプローチに比べて空間特異性と信号忠実度において優位性があります。3。多領域頭蓋内記録はネットワークレベルの相互作用に関する洞察を提供し、認知や疾患の神経動態を調査するために広く用いられ、機論的および縦断的研究の齧歯類モデルに一般的に実装されています 4,5。

タングステンワイヤー電極は、その機械的安定性と生体適合性のため、慢性記録に一般的に用いられます 6,7,8。しかし、移植には侵襲的な手術が必要であり、神経生理学、組織の完全性、動物の行動を一時的に妨げる可能性があります 9,10,11。急性手術ストレス、局所炎症、グリア反応、摂食行動や侵害受容行動の変化などの課題は、植込み後初期期間中に信号質や実験解釈に影響を与えることがあります。しかし、この回復期間は主に経験的であり、報告された回復ウィンドウは5日から7日の範囲です。逆に、長期間の遅延は組織の再構築や電極の置位に関連する追加の交絡因子を引き起こす可能性があります17。

慢性頭蓋内EEGの広範な利用にもかかわらず、電気生理学的、行動的、炎症的、組織学的評価を統合して実験的タイミングを判断する標準化された着床後モニタリングの枠組みは存在しません。したがって、本プロトコルはこのギャップを埋め、麻酔下のSprague–Dawley(SD)ラット(生後6週)における慢性頭蓋内多電極移植モデルにおける埋め込み後の状態を評価する構造化されたアプローチを示しています。前帯状皮質(Cg1)、海馬CA1、内嗅皮質(EC)に埋め込まれたタングステンワイヤー電極を用いて、プロトコルは2週間にわたる電極の安定性、EEG信号特性、行動指標、炎症マーカーの縦断的評価を規定しています。実用的な便宜上全身麻酔下で評価が行われますが、このアプローチは電極埋め込みと安定性の枠組みを確立するという主な目的には影響しません。このプロトコルは術後のモニタリングを指針し、下流神経生理学的研究を開始するための適切な時期の一貫した決定を支援することを目的としています。

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プロトコル

すべての動物処置は機関のガイドラインに従い実施され、首都医科大学の施設動物ケア・利用委員会(承認番号:AEEI-2024-391)によって承認されました。

1. 動物の調理

  1. 生後6週間のオスのSDラット(体重220〜230g)を入手してください。動物は特定の病原体のない環境(24 ± 2°C、湿度50 ± 10%、明暗サイクル12時間)で飼育してください。 自由に食事と水を提供してください。手術の7日前にラットを慣らしてください。
  2. 電極埋め込み後は、ヘッドステージの損傷を防ぐため、同じ環境条件下でラットを個別に飼育します。
    注:研究フローチャートおよび対応する測定値は 図1Aに示されています。試薬および機器 は材料表に記載されています。

2. 多電極埋め込み手術

  1. ラットにはイソフルラン(誘導3–4%、維持2%)で麻酔し、酸素を2L/分で投与します。
  2. ラットを立体誘導フレームに入れ、温度制御付きの温熱パッドを使って体温を37°Cに保ちます。角膜乾燥を防ぐためにエリスロマイシン眼軟膏を塗布します。
  3. 頭皮を剃り、0.5%ヨードホア溶液で消毒してください。
  4. 頭皮の中央に切開(1×2cm)を行い、頭蓋骨を露出させ、滅菌綿棒を使って骨膜を優しく除去します。
  5. 頭蓋骨の準備とドリル
    1. ブレグマとラムダを識別し、頭蓋骨を前後および内側側の両方で水平にします。
    2. 低速歯科ドリルと断続的な生理食塩水灌漑を用いて、目標座標に直径≤2mm)のバー穴を掘ります。
  6. 電極の準備と挿入
    1. ポリイミド絶縁タングステンワイヤー電極(シャンク径:300μm)を使用し、露出した先端は4〜8mm(フラッシュカット端)です。電極インピーダンス(|Z|)を測定してください。1kHzで;許容値は7〜10kΩの範囲で、位相角は1°から2°の範囲です。
    2. 電極をゆっくりと次の領域に挿入します:Cg1(前帯状皮質):AP +1.2 mm、ML −0.2 mm、DV −2.4 mm;CA1(海馬):AP −3.3 mm、ML −1.8 mm、DV −3.0 mm;EC(内嗅皮質):AP −6.7 mm、ML −4.0 mm、DV −8.0 mm。
    3. 対側のCA1領域にステンレス製の頭蓋骨スクリューを1本埋め込み、それを接地電極として使います。
  7. 電極固定と閉鎖
    1. 植入時に立体走位座標を用いて正しい電極深度とターゲットを特定します。電極の軌跡を組織学的に特定することで、事後的に電極の位置特定を確認します。
    2. 電極とネジはデンタルレジンで固定します(1層に30〜60秒硬化)。
    3. 電極のリードをヘッドステージコネクターに接続し、周囲の皮膚を縫合します。
  8. 麻酔を維持しながら、対応する時刻で30分間のベースラインEEG活動を記録します(図1A)。

3. 術後ケアと取り扱い

  1. 完全に歩けるようになるまで、温めパッドで回復させてください。
  2. ストレス軽減のために、温湿度と湿度を管理し、柔らかい寝床と自由 に食べ物や 水を自由に提供すること。
  3. 切開部位、電極の安定性、ヘッドステージの完全性を毎日点検してください。
  4. 家庭動物を個別に扱い、毎日の創傷ケア(0.5%ヨードフォー溶液)を提供し、薬理学的薬剤を使わずに福祉を監視して交絡作用を避けると、以前の研究と一致しています6,18。

4. 縦断EEG記録

  1. 着床後1日目、4日目、7日目、10日目、13日目に脳波検査を行ってください。
  2. イソフルランでラットに麻酔を施します(誘導3〜4%、維持1.5%)。
  3. 記録ケーブルを安定化させて、動きのアーティファクトや電磁ノイズを最小限に抑えましょう。
  4. 概日リズムの変動をコントロールするために、午前9時から30分間脳波を記録してください。
  5. 以下の取得パラメータを使用します:サンプリングレート:1,000 Hz;ハードウェアバンドパスフィルタ:0.5–40 Hz;ゲイン:8–10。追加のフィルタリングおよびアーティファクト除去はオフラインで実行してください。
  6. 許容可能な脳波信号は、安定した基準線、最小限のノイズやドリフト、生理学的に妥当な振幅および周波数成分を示します。これらの基準を満たさない記録は除外します。

5. 脳波信号解析

  1. 参照されたソフトウェアを使ってEEG信号を解析します。
  2. 信号を目視で確認し、動きや電気的なアーティファクトのあるセグメントを除去してください。
  3. FFT(プウェルチ関数)を用いてパワースペクトル密度(PSD)を計算します。
  4. あらかじめ定められた周波数帯域の PSD曲線下面積(AUCpsd) を計算することで振動活動を定量化します。
  5. 信号対雑音比(SNR)を、ターゲット信号帯(0.5–40 Hz)の電力と背景雑音帯(40–80 Hz)の電力比として計算します。
    注:安定信号は連続した記録日を通じて一貫したPSDプロファイルを示します。

6. 痛み評価

  1. 手術の1日前(ベースライン)およびすべての記録日に、ラットグリマススケール19,20を用いて痛みを評価してください。
  2. 観測室(25cm×15cm×15cm)を使い、カメラを左上隅に45°の角度で配置します。
  3. 顔画像を撮影し、画像の順序をランダム化し、眼窩の引き締め、鼻・頬の平坦化、ひげの変化、耳の位置(0–2スケール)をスコアリングします。
  4. 合計スコアを算出して、時間点ごとの動物ごとの総痛みスコアを算出します。

7. 摂食行動と体重

  1. ラットの体重を測り、毎日の食事摂取量を測定してください。24時間後に計量した食べ物から残りの食事量を差し引いて計算します。
  2. ビデオ録画システムを用いて24時間にわたりラットの行動を連続的に記録します。実験条件を盲目にした実験者によるオフラインの摂食行動を分析します。
  3. 給餌を継続的に監視してください。給餌の合図を、5秒から15分21秒続く≥1回のイベントと定義します。
  4. 体重調整摂取量(g×100/体重g)を計算します。1食あたり平均摂取量(g/食事イベント数);および摂取量(g/総給餌時間(ミニット単位)を計算します。

8. 神経炎症評価

  1. イソフルランの過剰投与と首切断でラットを安楽死させる。
  2. ベースラインおよび術後1日目、4日目、7日目、10日目、13日目に埋め込み半球から脳組織を採取します(各時刻あたりn=3)。
  3. ウェスタンブロッティング
    1. 脳組織から全タンパク質を抽出し、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを用いてタンパク質濃度を定量します。すべてのサンプルを最終濃度2μg/μLに調整し、100°Cで5分間変性させます。
    2. 120Vで10%のSDS-PAGE分タンパク質を90分間分離し、1レーンあたり20μgのタンパク質をロードします。
    3. タンパク質をPVDF膜に300 mAで1時間移します。
    4. 膜をブロックし、腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン6(IL-6)(1:1,000)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
    5. HRP結合二次抗体(1:20,000、2時間、室温)でインキュベートします。
    6. ECLでバンドを可視化し、化学発光イメージングシステムで自動露光モードを用いて画像化します。
    7. ImageJを使ってデンシトメトリーを行います。

9. 安全性と廃棄物処理

  1. イソフルランは能動的なスカベンジングシステムで扱う。
  2. シャープや生物組織は指定されたバイオハザード容器に保管してください。
  3. 化学試薬は機関の安全規則に従って処分してください。

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結果

21頭のSDラット全員が頭蓋内電極の挿入を許容し、研究プロトコルを完了しました。縦断的指標(EEG、体重、摂食行動、疼痛スコア)は同じ動物から時間点(n=3)で収集され、神経炎症評価は各時点で最終的な測定でした(n=1日あたり3ラット:ベースライン、1、4、7、10、13)。データはShapiro-Wilk検定を用いて正常性を評価しました。正規分布データはSEM平均±表され、一方通行または反復測定のANOVAとBonferroni補正を用いて比較されました。非パラメトリックデータはKruskal-Wallis検定とDunnのポストホック検定を用いて解析されました。両側p<0.05は統計的に有意とされました。EEG信号回復は、連続した時間点にわたるAUCpsdの停滞期と定義され、摂食、体重、RGSスコアはベースラインに戻った時点で回復したとみなされます。

電極の局在
13日目の組織学的検証により、電極先端がCg1、海馬CA1、EC内に正確に位置していることが確認されました。立体...

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ディスカッション

齧歯類における脳波モニタリングのための慢性頭蓋内電極移植は、高時間分解能で神経動態を研究する基盤技術として依然として重要である。適切な術後モニタリングおよび回復ウィンドウの設定は、信号信頼性と動物福祉の両面を確保するために極めて重要である。本研究は、SDラットにおける多電極移植後の電気生理学的安定性、行動転帰、炎症反応を評価するための構造化された枠組みを提供し、長期記録プロトコルでの実践的な指針を提供する。

脳波、行動、生理学的回復
電気生理学的、行動的、生理学的モニタリングの枠組みを用い、本プロトコルは多電極埋め込み後に頭蓋内EEG信号が予測可能な安定化過程を経ることを示しています。術後1日目にはEEGスペクトル出力が低下しましたが、すべての領域(Cg1、CA1、EC)で3〜4日以内に安定しました。この早期抑制は、術後のEEG障害を組織の乱れ、グリア活性化、電極軸周辺の局所炎症反応に起因するとされる以前の報告と一致しています(22,23<...

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

この活動は首都医科大学優秀若手プロジェクト(A2308)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
能動イソフルアラン掃討システムRDWR510-31-6
動物チャールズ川
BCAアッセイキットソーラービオPC0020
ケミドックイメージングシステムバイオ・ラッド17001401
デンタルレジン頂点XG473P03
ECL検出試薬ソーラービオPE0010
エリスロマイシン眼軟膏仁和1.00E+11
ヤギ抗ウサギ二次抗体プロテインテックSA00001-2
GraphPad プリズム 9.0GraphPadソフトウェア統計解析ソフトウェア
ヘッドステージアンプBIOPACシステムズ株式会社EEG100C
ヒートパッド玉炎技術S-100
イメージJ国立衛生研究所画像解析ソフトウェア
IL-6ポリクローナル抗体プロテインテック21865-1-AP
ヨードフォアクリーンブーム430-DFXDY100
イソフルラン後輪駆動R510–31
NeuroExplorerを用いたニューロレコーディング装置(バージョン5.012)プレクソンOPX-A1600-128-16C電気生理学データ解析ソフトウェア
PVDF膜シチバRPN303F
SDS-PAGEシステムバイオ・ラッド1658004
立体誘導装置中石科学技術ZS-PDC
TNF-およびα;多クローナル抗体プロテインテック17590-1-AP
転送装置バイオ・ラッド1703937
タングステン線A-Mシステム785500
ビデオ録画システムバスラーacA1920
&β;アクチンモノクローナル抗体プロテインテック2D4H5

参考文献

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