移植研究のためのドナー心臓リンパアブレーションによる電気焼灼術 の マウスモデル

サマリー

心臓移植におけるドナー心臓リンパアブレーションの新しいマウスモデルを開発しました。このモデルは、ドナーリンパ管の破壊が急性拒絶反応を弱め、心筋損傷を減少させ、移植片の生存率を延ばすことを示し、移植免疫における心臓リンパ機能に関する新たな知見を提供します。

要約

近年、心臓リンパ管の研究が注目を集めていますが、ドナー心臓リンパ系と心臓移植における急性拒絶反応との関係はまだ解明されていません。

心臓の電気生理活性は、正常マウスのリンパアブレーション前後に心電図(ECG) によって 評価されました。ドナー心臓の主要なリンパ管はエバンスブルー注射で可視化され、 その後電気焼 灼でアブレーションされました。リンパアブレーションを受けた心臓を用いて、ドナー心臓リンパ機能障害を特徴とする心臓移植モデルが確立されました。心臓移植片の機能は心エコー、ウエスタンブロッティング、ELISA を用 いて評価した。ドナーリンパアブレーションが急性拒絶反応に与える影響は、ヘマトキシリン・エオシン(HE)染色およびグラフト生存期間のモニタリングによって評価されました。

心電図の結果はリンパアブレーション前後の心臓電気生理に有意な変化が見られず、主要な心臓血管が損傷していないことを確認しました。エヴァンス・ブルーは心臓の頂点に注射され、リンパ管の標識を付けました。主要なリンパ系は電気焼灼でアブレーションされました。アブレーション手術終了後、マウスはヘパリン化され、その後心臓を採取しました。大動脈と肺動脈を切断し、上・下大静脈および肺静脈を結紮しました。準備(アブレーションされた)ドナー心臓は移植されました。cTnIおよび駆出率の値は、リンパアブレーションが心疾患を悪化させないことを示しました。HE染色は、ドナー心臓リンパの焼灼が急性拒絶反応を緩和し、心筋損傷を減少させ、移植片の生存期間を延ばすことを示しました。

ドナー心臓リンパ機能障害を対象としたマウス心臓移植モデルを確立し、ドナー心臓リンパの焼灼術が急性拒絶反応の軽減、心筋損傷の軽減、移植片の生存延長につながることを示しました。これらの発見は、心臓移植における心臓リンパ系の役割を理解するための新たな知見と基盤を提供します。

概要

心臓同種移植拒否反応は、心臓移植後の最も一般的かつ深刻な合併症の一つであり、主に急性細胞拒絶反応と抗体介在拒絶反応に分類されます。現代の免疫抑制療法は移植片の生存率を大幅に向上させましたが、拒絶反応は移植結果の主要な決定要因であり続けています。文献によると、約12%の患者が移植後1年以内に少なくとも1回中等度または重度の急性拒絶反応を経験しています^1。

心臓リンパ系は、移植拒絶反応におけるその役割の可能性について、ますます注目を集めています。液体バランスや免疫監視という確立された機能に加え、リンパ系は免疫応答の調節において重要な役割を果たしています。リンパ管は免疫細胞^が組織に出入りする主要な導管として機能します^2,3。心臓では、リンパネットワークがリンパ球を含む免疫細胞の輸送と再循環の基本的なインフラを提供しています。この経路を通じてリンパ球は血流から間質空間に移動し、免疫監視を行います。その後、リンパ節に排出され、最終的に全身循環に戻されます^2,4。さらに、研究によると、T細胞およびそのサブセットは急性拒絶反応の中心的な役割を果たし、これらの細胞の活性化や移動はリンパ系の影響を受ける可能性があります⁵。

リンパ管は心臓に存在し、血管に似たネットワークを形成することが知られていますが、その重要性は長年にわたり同等の注目を集めていません。研究により、機能的なリンパ管の欠如は顕著な心臓肥大と浮腫を引き起こし、リンパが心臓組織の恒常性維持に重要な役割を果たすこと^{を示しています。}さらに、リンパ管排出が障害または欠如すると炎症細胞の除去効率が低下し、局所的な炎症反応を悪化させ、心臓の再構築過程に影響を与える可能性があります⁷。

心臓疾患では、リンパ管を標的としたさまざまな介入法が存在します。マウスモデルでは、Vegfc+/-マウス8を生成することで心リンパ欠損を誘発^{できます。}臨床的には、インターベンショナル縦隔リンパ塞栓術⁹および低侵襲心膜ウィンドウ手術¹⁰が軟液質心膜液出の治療に用いられます。フォンタン循環生理学の患者では、リンパの減圧は外科的¹¹、経皮的胸管減圧¹²、またはリンパ静脈吻合¹³の確立によって達成されることがあります。閉塞技術には胸管塞栓術¹⁴、選択リンパ管塞栓術¹⁵、胸管結紮^術16が含まれます。しかし、心臓リンパ管自体を直接的に標的とした介入は依然として限られています。

心臓リンパ管の重要な役割を踏まえ、私たちはドナー心臓の主要なリンパ管を電気焼灼 で 焼灼することで、新しいマウス心臓移植モデルを確立しました。このモデルは、ドナー移植片リンパ機能障害が移植後の急性拒絶反応に与える影響を調査するために用いられました。

プロトコル

オスのC57BL/6JおよびBALB/cマウス(オス、生後6〜8週、体重25〜28g)は、特定の病原体なし条件下で維持されました。すべての実験手順は、フーワイ病院動物倫理委員会(承認番号:0108-7-800-ZX(X)-019)に基づき実施されました。

マウスの心臓リンパ管の可視化と焼灼
心臓リンパ機能障害を模擬するために、主要な心臓リンパ管を電気焼灼 で アブレーションしました。

すべてのマウスは、1.25%トリブロモエタノールを腹腔内注射で、10g体重あたり0.2mLの用量で麻酔し、手術中は機械的換気が行われました。トリブロモエタノールによる麻酔後、BALB/cマウスは22ゲージカテーテルを用いた気管挿管を受け、心電図(ECG)リードに接続されました(図1A、補足図S1)。人工呼吸器のパラメータでは、呼吸比が1:1または1:2に設定され、潮水量は0.3 mL、呼吸数は100回/分でした。カテーテルを人工呼吸器に接続した後、マウスの状態を綿密に監視しました。マウスの呼吸数が人工呼吸器と一致している場合、呼吸率が不安定または腹部膨張の場合は再挿管が必要と認められ、挿管は成功とみなされました。その後、左側の3〜4肋間隙に約1cmの切開部で開胸術を行い、リトラクターを用いて心臓全体を露出させました(図1B)。その後、心尖に5μLのエバンスブルー染料を注射し、リンパ管を可視化するために注射後1分間の待機期間を設けて完全な不透明化を目視しました(図1C、E;補足図S2A-B)では、エバンズブルーは非常にゆっくりと注射すべきだと指摘されています。可視化後、主要な心臓リンパ管の位置は、既に報告された解剖学データ^17,18と比較することで確認され、電気焼灼ペンを10Wで連続モードで使用し、凝固時間は約3〜7秒で行われました(図1D,F)。血管損傷の有無を確認するため、アブレーション前後に心電図(ECG)を監視しました(図1G,H)。最後に、大規模なリンパアブレーションの後、マウスはヘパリン化され、その後のドナー心臓採取に備えました。手術手順の概略図は図2に示されています。

腹部異所性心臓移植
マウスの腹腔内でのヘテロトピア心臓移植は、^前述の通り行われました。簡単な手順は以下にまとめます。

ドナー手術
BALB/cマウスの白線に沿って開腹手術を行い、下大静脈に50 U/mLの50 U/mLヘパリン生理食塩水1 mLを下大静脈に注射し、腹部大動脈を切開して全身性肝素化を誘導しました。その後、ハートが露出し、8-0左上大静脈と右の下腔静脈を結紮するために縫合糸を使用し、その後、縫合線の遠位端で切断されました(図3A,B)。その後、大動脈を周囲の脂肪組織から分離し、大動脈弓付近で切断しました(図3C)、同様の処置で肺動脈を分離し切断しました(図3D)。胸椎区間の下大静脈は8-0で結紮されました縫合線と遠位端の横断(図3E)、その後肺静脈は7-0シルク編み縫合糸で結紮・横断されました(図3F)。最後に、切除されたドナー心臓は生理食塩水で4°Cの生理食塩水で保存され、すべての心臓は約30分間同じ期間保存され、実験的な一貫性を確保しました。

受領手の手続き
腹部心臓移植の準備としてC57BL/6J受容マウスに麻酔をかけます。白線に沿って開腹術を行い、受容マウスの腹部大動脈と下大静脈を露出させました(図4A)。下大静脈の背側枝血管を10-0ナイロン縫合糸で結紮した後、血管クランプを用いて腹大動脈および下大静脈の血流を遮断しました(図4B)。その後、受容マウスの腹部大動脈と下大静脈に窓が開かれ、ヘパリン生理食塩水で血管から血液を洗浄しました。11-0ナイロン縫合糸を用いて、両端から側面への吻合術を行い、ドナー心臓の肺動脈をレシピンの下大静脈に、ドナー心臓の大動脈と腹部大動脈を接続しました(図4C-E)。最後に、血管クランプを解除し、受容マウスへの血流を回復させました(図4F)。

実験設計
実験群:BALB/cマウスの心臓リンパ管をエバンスブルー染料で可視化し、電気焼灼ペンでアブレーションした。リンパ管を消融したBALB/cマウスの心臓はC57BL/6Jマウスに移植されました。

対照群:BALB/cマウスの心臓リンパ管はエバンスブルー染料を用いて可視化したが、アブレーションは行われなかった。BALB/cマウスの心臓はC57BL/6Jマウスに移植されました。

本研究では、サンプルサイズをすべての実験群と時点で標準化し、心臓移植後24時間のアッセイではn=5マウス、移植後7日のアッセイではn=5、心臓移植片生存期間の観察はn=5群としました。

採取されたドナー心臓は、心臓移植前に4°Cの氷で冷たい生理食塩水に30分間保存されました。実験群および対照群ドナー心臓は、同じ期間生理食塩水で維持されました。

心臓移植片の拍動時間は両群で毎日触診 で 評価されました(n=5群あたり)。

組織学的評価および実質拒絶(PR)スコアリング
心筋組織サンプルは10%ホルマリンに48時間固定され、その後、段階化されたエタノール系列(70%、80%、95%、100%)、キシレンクリアリング、パラフィン埋め込み、ミクロトーム切片(4μm)による脱水処理が行われ、切片はヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色されました。移植片の拒絶反応はPRスコアを用いて評価され、移植片損傷の程度は盲検方式で評価^{されました。}

心エコー検査
心機能は超音波システム(40MHz 550プローブトランスデューサー)を用いて評価されました。マウスは360度回転可能な動物プラットフォームの上で仰向けに配置されました。腹部の毛を除去した後、1.0%イソフルラン麻酔下で心機能が評価されました。心臓移植片の駆出率(EF)はMモード心エコー で 測定されました。

心筋損傷マーカーの検出
心筋組織損傷の程度は、血清中の心筋細胞特異酵素の発現を測定することで評価されました。心臓トロポニンI(cTnI)のレベルは製造元の指示に従って分析されました。

ウェスタンブロッティング
心臓移植後24時間に、対照群および実験群の心臓移植片の主リンパ管領域から心筋組織を採取しました。前述のプロトコル²¹に従い、リンパ管関連マーカーの発現を解析しました。心臓組織はプロテアーゼ阻害剤(フェニルメタン、スルホニルフッ化物)を含むRIPA溶解バッファーで徹底的に溶解されました。熱変性前に、BCAキットを用いてタンパク質濃度を測定し、均一な濃度に調整しました。各グループの全タンパク質は SDS-PAGEで 分離され、その後PVDF膜に移されました。PVDF膜は5%脱脂乳(室温で1〜2時間)でブロックし、その後4°Cで該当する一次抗体とともに一晩培養しました。翌日、膜は室温で30分間二次抗体(抗ウサギ抗体、1:1000)で処理されました。膜ストリップはECL溶液(1-2 mL)でインキュベーションされ、画像を撮影するために露出されました。

使用された抗体は以下の通りです:LYVE1ポリクローナル抗体(1:500)、ポドプラニン抗体(1:500)、および抗VEGF受容体3(1:50)。

統計解析
すべての結果は平均±標準誤差(SEM)で表されます。2つのグループを比較する際、データ分布や特性に応じてStudentのt検定またはWilcoxonランク和検定を用いた統計解析が行われました。統計的有意性はp < 0.05と定義されました。

結果

心臓移植片の評価
心臓移植のマウスモデルは、記載されたプロトコルに従って対照群および実験群の両方で確立されました。移植後24時間でグラフトの機能状態が評価されました。血清心トロポニンI(cTnI)の発現レベルは実験群で対照群より高かったが、その差は統計的に有意ではなかった(図5A)。同時に、心エコー検査では両群間で移植片の駆出率に有意な差は認められませんでした(図5B、 補足図S3)。これらの結果は、リンパアブレーションが追加の心筋損傷を引き起こしなかったことを示しています。

さらに、リンパ管マーカー発現の解析により、実験群のLYVE-1、ポドプラニン、VEGFR3のタンパク質レベルが対照群と比較して有意に低下していることが示され(図5C-H

ディスカッション

心臓リンパ系は、組織液の恒常性を維持し、心臓内の免疫機能を支える上で重要な役割を果たします。間質液の再吸収、脂質輸送、免疫細胞輸送を促進することで、生理的および病理的条件下での心機能を確保します。近年、増え続ける証拠が、心筋梗塞、心不全、心臓移植など、浮腫や炎症反応を特徴とする複数の心血管疾患において心臓リンパ系が重要な関与をしていることが強調されています²²。

特に心筋梗塞(虚血性心疾患)後の病理学的条件下では、心臓リンパ管^が機能不全を遂げます。これにより間質性液体の排出が妨げられ、慢性心筋浮腫を引き起こし、さらに心筋線維症や^{心機能障害}を悪化させます。さらに、リンパのクリアランスが低下すると免疫細胞(例:マクロファージ)の適時な排出が妨げられ、持続的かつ悪化した炎症が心臓修復を妨げます²。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
電気凝固ペン	魏泰	V70
顕微鏡的鉗子	金中	WA3030
顕微鏡的鉗子	金中	WA2040
顕微鏡針ホルダー	金中	YZE010
顕微鏡針ホルダー	金中	YZE020
顕微鏡的はさみ	金中	YBC010
顕微鏡的はさみ	金中	YBC020
ニードルホルダー	金中	J32010
ハサミ	金中	Y00010
小動物用人工呼吸器	卓帝	DW-300