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方法論記事

好中球とリンパ球の比率およびCD4陽性/CD8陽性の比率を持つKi-67は、非小細胞肺がんにおける早期反応を予測します

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DOI:

10.3791/70014

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2026年3月20日

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan, 2Department of internal medicine, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、PD-1/PD-L1阻害薬を投与されているNSCLC患者に対し、ベースラインNLR、フローサイトメトリックCD4/CD8比、腫瘍Ki-67免疫組織化学スコアリング、2サイクル後のRECIST 1.1評価を統合し、再現性重視の品質管理チェックポイントを統合して早期反応評価を標準化します。

要約

本研究は、非小細胞肺がん患者でPD-1/PD-L1阻害薬治療を受けている患者において、短期的反応評価における腫瘍Ki-67発現状態、末梢血中性球対リンパ球比(NLR)、およびCD4陽性/CD8陽性T細胞比の複合的予測価値を評価しました。2021年1月から2023年10月までにビンハイワン中央病院で治療を受けた102名の患者を後ろ向きに分析し、2回の治療サイクルを完了しました。反応はResponse Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)バージョン1.1を用いて評価されました。13名が完全効果、26名が部分的奏効、54名が安定病変、9名が進行性疾患を達成しました。分析のために、反応を完全反応と部分的反応、非反応を安定病態と進行性病変と定義しました。単変数スクリーニングにより、反応状態に関連する候補予測因子が特定され、これらは年齢、東部協同腫瘍学グループのパフォーマンス状況、喫煙歴を調整した多変数ロジスティック回帰分析に入力され、Ki-67の状態、NLR、CD4陽性/CD8陽性比率を短期反応分類の独立予測因子として特定しました。受講者の動作特性解析は、単一マーカーと比較して複合バイオマーカーモデルの識別能力が向上し、臨床環境における早期反応階層化における実用的かつ低侵襲なアプローチを示しました。

概要

非小細胞肺がん(NSCLC)は、肺悪性腫瘍の約85%を占める最も一般的な組織学的サブタイプであり、中国では主に中高齢者に影響を及ぼします1。その病因は多因子的で、タバコ曝露、工業用粉塵や汚染物質との長期接触、遺伝性感受性、環境発がん物質への慢性曝露などが含まれます。初期のNSCLCはしばしば非特異的な呼吸器症状を示し、プライマリケアにおける一般的な気道疾患と誤って診断されることがあり、認識の遅れや、4.5段階で診断される患者の割合が高いことに寄与しています。

近年、免疫チェックポイント遮断は進行したNSCLCの全身治療の中心的要素となっています。プログラムドデス1(PD-1)およびプログラムデスリガンド1(PD-L1)阻害薬は、選定患者において持続的な臨床的利益と生存率の向上を示している6.しかし、反応の異質性は依然として大きく、長期治療の経済的負担と潜在的な毒性は決して軽微ではありません。腫瘍PD-L1免疫組織化学や腫瘍変異負荷(TMB)などの臨床的に使用される予測因子は貴重な情報を提供しますが、両者とも均一な展開を制限する実用的な制約があります。PD-L1評価は腫瘍内の異質性やアッセイ/プラットフォームの変動性によって影響を受けることがありますが、TMBは一般的にシーケンスリソース、より長い処理時間、そして高いコストを必要とします9。これらの制約により、通常利用可能な材料を使用し、標準化された品質管理を用いて、実験室容量が変動するセンターで実行可能なワークフローを臨床的に重要にしています。

実践的な観点からは、少数のアクセス可能なバイオマーカーを統合したプロトコル主導のアプローチが、治療開始後の早期フォローアップ計画を支援する可能性があります。例えば、最初の点滴前の標準化されたベースラインサンプリングと定義された2サイクルの評価ウィンドウを設けることで、臨床医がより詳細なモニタリングや早期再評価が必要な患者を特定しつつ、測定値を各部位で再現するために必要な手順について透明性を保つことができます。この実現可能性と再現性への強調は、方法論的ステップとその品質チェックポイントが貢献の中心となるJoVEプロトコル記事に特に重要です。

Ki-67は腫瘍の成長動態を反映する核増殖マーカーであり、免疫の構造に関連して議論されています。Ki-67の上昇はPD-L1発現と相関し、免疫逃避表現型が免疫チェックポイント阻害剤(ICI)への感受性を形作る可能性が報告されています10。並行して、好中球対リンパ球比(NLR)は全身性炎症状態の容易にアクセスできる指標であり、PD-1/PD-L1阻害薬治療を受ける患者の予後や予測因子として広く研究されています11。NLRが高いことは、相対好好球依存症やリンパ減少症による免疫抑制環境の反映と一般的に解釈され、複数のコホートで反応の低下や生存率の低下と関連しています12。末梢のCD4陽性/CD8陽性T細胞比は適応免疫恒常性のさらなる窓口を提供し、ヘルパー細胞と細胞毒性T細胞区画の機能的バランスは、PD-1/PD-L1遮断下での効果的な抗腫瘍免疫に機械的に関係しています。

Ki-67、NLR、CD4陽性/CD8陽性比率はそれぞれ個別マーカーとして潜在的価値を示しているものの、NSCLCにおける早期反応評価のための運用的かつ低侵襲なワークフローとしての統合的な利用は依然として十分に特徴づけられていません。したがって、本研究では、腫瘍のKi-67発現状態と末梢血のNLRおよびCD4陽性/CD8陽性の比率を組み合わせることで、PD-1/PD-L1阻害薬治療の2サイクル後の短期反応分類が改善されるかどうかを検討し、早期リスク層別化の参考と、日常診療におけるタイムリーな臨床再評価の支援を目的としました。

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プロトコル

1. 倫理および規制遵守

  1. 東莞濱海湾中央病院倫理委員会(承認番号:2021045)から承認を得てください。
  2. すべての手続きがヘルシンキ宣言に準拠していることを確実にしてください。
  3. 治療前に書面によるインフォームドコンセントが取得されていること、および研究ファイルに同意の状況を記載すること。

2. 患者の識別および適格性スクリーニング

  1. 2021年1月から2023年10月の間に、プログラム細胞死タンパク質1/プログラム死リガンド1阻害剤治療を開始した非小細胞肺がんと診断された連続患者を特定します。
  2. 病理診断は病理報告書を確認して確認してください。
  3. 2つの治療サイクルの完了を確認し、1つのサイクルを3週間と定義してください。
  4. 包含基準を適用してください。
    1. 治療開始時の年齢は35歳から80歳であることを確認してください。
    2. ベースライン画像で肝転移がないことを確認する。
    3. 他の原発悪性腫瘍の存在を確認してください。
    4. 医療記録に12ヶ月>生存予定の記録を確認してください。
    5. 完全なベースライン医療記録およびベースライン画像データの入手可能性を確認しましょう。
  5. 除外基準を適用してください。
    1. 治療開始の6か月前に心臓胸部手術を受けた患者は除外します。
    2. 追跡調査に影響する遵守度の低い患者は除外します。
    3. プロトコル遵守に影響する重度の精神疾患を持つ患者は除外します。
    4. ベースライン評価時に血液学的または凝固異常がある患者は除外します。
    5. ベースライン時に重度の活動性感染を有していた患者は除外します。
    6. 登録の30日前に免疫療法または標的治療を受けた患者は除外します。
    7. 移植、経済的制約、死亡により2サイクルの評価期間中に治療を中止した患者は除外します。
  6. 各対象患者に固有の研究IDを割り当て、分析前にすべての記録を非公開化してください。
  7. 2名の研究者が独立して適格性を確認し、不一致は合意によって解決します。
  8. 審査結果を、研究ID、スクリーニング項目、不一致の説明、審査員、日付を含むスクリーニングログに記録してください。
    注:除外決定および解釈を支持するために、炎症マーカーを変化させる可能性のあるベースライン疾患(例:発熱、臨床疑い感染症、全身性コルチコステロイド曝露)をスクリーニングログに記録してください。14。

3. ベースライン臨床データの抽出

  1. 電子カルテシステムから基準変数を取得してください。
  2. 性別、年齢、体格指数、学歴、腫瘍部位、最大腫瘍直径、腫瘍・結節・転移期、治療法、喫煙歴、イースタン協同組合腫瘍学グループの成績状況を記録します。
  3. すべての基準変数を非特定化されたスプレッドシートにエクスポートします。
  4. タイムスタンプ付きの読み取り専用コピーを保存して分析用にデータセットをロックします。
  5. データの正確性を、少なくとも10%のエントリーとソースレコードと照合して検証します。
  6. 修正記録にはフィールド名、元の値、修正済みの値、レビュアーのイニシャル、日付が含まれます。
  7. 回答状況ごとに基準特性をまとめ、表 1として報告用の基準値特性表を作成します。

4. ベースライン末梢血液採取および血液学由来好中球対リンパ球比

  1. 最初の阻害剤投与の2時間以内に、EDTA抗凝固チューブを用いて上肢静脈から空腹静脈血を採取してください(材料 表参照)。
  2. 採取後すぐに各チューブを8〜10回逆さにします。
  3. 採血後2時間以内に自動血液分析装置( 材料表に記載されたモデル)を用いて完全な血液検査を行います。
  4. サンプルテスト前に分析装置の日々の内部品質管理状況を確認し、品質管理の合格・不合格状態、制御レベル、操作者、分析機器モデルを研究ログに記録してください。
  5. 分析装置の出力から絶対好中球数と絶対リンパ球数を記録してください。
  6. 好中球対リンパ球比を、NLR = 絶対好中球数 / 絶対リンパ球数の式を用いて計算します。
  7. 試験ログでは、凝固または溶血されたサンプルを無効とフラグ付けしてください。
  8. 臨床的に可能な場合は、同じ治療前期間内に再度採血を行い、欠落または無効な結果の理由を記録してください。
  9. 採血時間とCBCの稼働時間を記録し、≤2時間の前分析ウィンドウを記録します。

5. CD4陽性/CD8陽性のT細胞比のフローサイトメトリー

  1. 50μLのEDTA抗凝固全血を12 × 75 mmのフローチューブにアリコートします( 材料表参照)。
  2. 4種類のフルオロクロームを用いてCD3、CD4、CD8、CD45を同定する4色T細胞サブセット試薬20μLを追加します(材料 表参照)。
  3. 1〜2秒の渦巻きを起こし、光から守られた状態で20〜25°Cで15分間孵化します。
  4. 10×濃縮液から調製した1×赤血球溶解液450μLを加えます(材料 表参照)。
  5. 優しく逆風させて混真にし、光を遮った状態で20〜25°Cで10分間培養します。
  6. リン酸塩緩衝塩水2mLを加え( 材料表参照)、逆さまに3〜5回混ぜます。
  7. 室温で350×gの遠心分離機で5分間加熱します。
  8. ペレットを乱さずに上澄液を捨てます。
  9. ペレットを300〜500μLのリン酸塩緩衝生理食塩水に再懸浮させて取得します。
  10. 機器のワークフローに従って毎日サイトメーターのパフォーマンスチェックを行い、ランシートに合格・不合格の状態を記録します。
  11. 染色されていない管を使って光電子増倍管の電圧を設定します。
  12. 各フルオロクロムごとに単色コントロール(セルまたはビーズ)を実行します。
  13. 単色コントロールを使って取得ソフトウェア内で補償を計算します。
  14. 同じバッチおよび記録日、オペレーター、電圧スナップショット、補償ファイル名内のすべてのサンプルに対して、同じ電圧設定と補償行列を維持します。
  15. 各サンプルは低〜中流量で採取し、1サンプルあたり少なくとも10,000件のリンパ球イベントを収集してください。
  16. CD45を用いたゲートリンパ球と側面散乱の違い。
  17. ゲートシングルは前方散乱面積と前方散乱高度を比較します。
  18. ゲートCD3陽性T細胞。
  19. CD3陽性イベント内のCD4陽性およびCD8陽性のサブセットを定量化します。
  20. CD4陽性/CD8陽性の比率は、CD4陽性/CD8陽性比率=(CD3陽性者間の%)/(CD3陽性者間CD8陽性の割合)を用いて計算します。
  21. 二変量プロット上でCD4陽性およびCD8陽性の集団の分離を確認しましょう。
  22. 補償の再計算と、予想される個体群分離と矛盾する重複が観察された場合、制御を再度実行します。
  23. 各バッチ(CD45/SSC、シングレット、CD3ゲート、CD4対CD8)の代表的なプロットを保存し、バッチIDと日付とともにアーカイブしてください。
    注意:バッチ追跡をサポートするために、試薬のロット番号と実行日を内部ランシートに記録してください。

6. 腫瘍Ki-67免疫組織化学および二項状態の割り当て

  1. ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織を4μmで切断し、電荷を帯びたスライドにセクションをマウントします( 材料表参照)。
  2. 区画はキシレンで脱水し、エタノールを経て水に再水和します。
  3. シトレート回収バッファー(pH 6)を用いて熱誘発エピトープ回帰を行います(材料 表参照)。
  4. 回収バッファーを沸点近くまで予熱してからタイミングを合わせます。
  5. 回収バッファー内で20分間ヒートスライドします。
  6. スライドを室温で20分間冷ます。
  7. 洗浄液を洗い流して残留液を除去します。
  8. 切片を3%過酸化水素で室温で10分間培養します。
  9. 1回の洗いにつき1〜2分間、ウォッシュバッファーを使ってスライドを3回スライドさせます。
  10. Ki-67一次抗体(クローニングMIB-1;すぐに使える製剤;材料 表参照)で切片を室温で20分間インキュベートします。
  11. 1回の洗いにつき1〜2分間、ウォッシュバッファーを使ってスライドを3回スライドさせます。
  12. HRPベースの検出システムを適用し、製造元の指示に従ってDABでクロモゲンを現像します(材料 表参照)。
  13. 核の染色がはっきり見え、背景が低い状態になったら、水で洗い流してクロモゲンの発生を止めます。
  14. ヘマトキシリンでカウンターステインし、リンス、ブルー、グレードエタノールで脱水、キシレンで透明化し、永久的なマウントメージでマウントします( 材料表参照)。
  15. 400×のブライトフィールド顕微鏡下で断片を観察してください。
  16. 重複しない生存可能な腫瘍フィールドを5つ選び、壊死、クラッシュアーティファクト、エッジ効果を避けましょう。
  17. 各フィールドに少なくとも100個の腫瘍核を数え、明確な茶色の核染色で核の数を記録します。
  18. 5つの分野にわたり、1症例あたり少なくとも500個の腫瘍核を数えてください。
  19. 症例レベルのKi-67標識指数を、100%の公式(%) = (総陽性腫瘍核数/合計腫瘍核数)×計算します。
  20. 各症例の染色強度は、カウントされた腫瘍核の主要な強度を用いて0(なし)、1(淡い黄色)、2(茶色・黄色)、または3(濃い茶色)とスコアします。
  21. 各症例の陽性細胞割合は、症例レベルのラベリング指数を用いて0(0–5%)、1(6–25%)、2(26–50%)、3(51–75%)、または4(>75%)とスコア付けします。
  22. 免疫反応スコアを IRS = 強度スコア×パーセンテージスコアを用いて計算します。
  23. 分析用のKi-67表現状態をIRS 0–4ではKi-67陰性、IRS 5–12ではKi-67が陽性と割り当て、 表1–4 およびモデリング出力全体で一貫してこの二値状態を用いてください。
  24. 2名の病理医による盲検採点を行います。
  25. 病理医の臨床結果や血液バイオマーカー値の判断を盲目にします。
  26. スコアリングの意見の相違は共同レビューで解決し、最終的なコンセンサス分類と日付を記録します。
  27. 各症例の代表画像を研究IDと拡大率とともにアーカイブします。
  28. 各染色ランに既知の陽性対照組織と陰性対照組織(一次抗体は省略)を含めてください。
  29. 制御失敗や背景染色で解釈が困難になる場合に繰り返し染色します。
    注:5フィールドカウント、ラベリング指数、強度スコア、パーセンテージスコア、IRS、監査可能性16の最終的なマイナス/ピジカルステータスを含むスコアリングワークシートをアーカイブしてください。

7. 2サイクル後の反応評価

  1. 通常の臨床ワークフローの中で、サイクル1前にベースライン画像検査を行います。
  2. 2回の治療サイクル後に再度画像検査を行い、各サイクルを3週間と定義します。
  3. Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, バージョン1.1を用いて治療反応を評価する。14
  4. 2名の放射線科医による独立した盲検評価を行います。
  5. 放射線科医の両方にバイオマーカー値や共変量のモデリングを盲目にします。
  6. 意見の相違は合意で解決し、判定の詳細(読者のイニシャル、日付、最終決定)を記録します。
  7. 反応カテゴリーをRECIST 1.1に基づき、完全反応、部分応答、安定病、進行病態に分類します。
  8. 回答グループに完全反応+部分反応を割り当てます。
  9. 非反応群には安定疾患+進行性疾患を割り当てます。
  10. 基準日とフォローアップ画像の日付を保存し、評価ウィンドウが2サイクルに対応していることを確認します。
  11. 監査用研究ID、リーダー、日付を含むRECIST測定シートをアーカイブしてください。

8. 統計分析

  1. 統計ソフトウェア(材料 表参照)を用いて統計解析を行うこと。
  2. 正規分布の連続変数を平均±標準偏差として提示し、独立標本t検定を用いてグループを比較します。
  3. カテゴリ変数をカウントとパーセンテージとして提示し、適切な場合はカイ二乗検定またはフィッシャーの正確検定を用いてグループを比較します。
  4. あらかじめ指定されたコーディング方式に従って独立変数をコードし、コーディングテーブルを テーブル2としてコンパイルします。
  5. 多変数モデリングにおいて、単変数分析を用いて予測変数をスクリーニングし、あらかじめ定められた基準を満たす変数を選択します。
  6. 応答=0、非応答=1を従属変数として多変数ロジスティック回帰モデルに適合させます。
  7. 多変数モデルを年齢、イースタン協同腫瘍グループのパフォーマンス状況、喫煙歴に合わせて調整します。
  8. 最終調整済みモデル推定値を 表3として報告してください。
  9. 単一予測変数および結合モデルの受信者動作特性曲線を生成する。
  10. NLRおよびCD4陽性/CD8陽性比のYouden指数を用いてROCベースの閾値を算出し、 表4に報告された二分分析で一貫して導出閾値を適用します。
  11. 単一予測変数および結合モデルの識別および分類性能を 表4にまとめます。
  12. 好中球対リンパ球比およびCD4陽性/CD8陽性比を同一アウトカムコーディングおよび調整セットの下で連続的な予測因子として扱う感度解析を実施します。
  13. 感度分析結果は補足 表S1として報告してください。
  14. 原稿本文の値と対応する表や図の一貫性を確認し、最終出力ファイルや使用されたソフトウェアバージョンをアーカイブします。

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結果

基準的特徴
非小細胞肺がん患者の102人の基線臨床的特徴は 表1にまとめられています。反応群(完全反応+部分反応)には男性30名、女性9名、非反応群(安定病+進行性疾患)は男性50名、女性13名(p = 0.771)を含みました。反応群では79.49%が65歳未満で、非反応群では66.67%でした。体格指数、教育レベル、腫瘍・リンパ節転移期、血小板数、治療前の最大腫瘍直径(いずれもp > 0.05)において、グループ間で統計的に有意な差は認められませんでした。対照的に、喫煙歴、東部協同腫瘍学グループのパフォーマンス状況、Ki-67発現状況、末梢血好中球対リンパ球比、CD4陽性/CD8陽性T細胞比はグループ間で有意に異なっていました(すべてのpが0.05<; 表1)。

2サイクル後の短期治療反応
治療反応は、Response Evaluation Criteria in ...

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ディスカッション

免疫チェックポイント阻害は進行性非小細胞肺がん(NSCLC)の全身療法の重要な要素となっていますが、臨床的に意義のある利益は15–16の患者のサブセットに集中しています。この反応の異質性と長期治療のコストおよび潜在的な毒性は、早期反応の階層化を追跡計画や適時の再評価に臨床的に重要にしています17。このJoVEプロトコルでは、組織ベースの増殖指標(Ki-67免疫組織化学)と、免疫・炎症状態を反映する2つの末梢血指標(好中球対リンパ球比率およびCD4陽性/CD8陽性T細胞比)を統合し、2回の治療サイクル後の短期応答分類を支援する実用的なワークフローを説明しています。

年齢、東部協同腫瘍学グループのパフォーマンス状況、喫煙歴、Ki-67発現状態、好中球対リンパ球比、CD4陽性/CD8陽性T細胞比を合わせた解析では、反応分類と一貫した関連が示されました。これらの関係の方向性は、増殖...

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開示事項

著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害や個人的関係は一切ないと述べています。

謝辞

免疫組織化学およびフローサイトメトリーに関する技術支援をいただいた東莞濱海湾中央病院病理科および中央研究所に感謝いたします。この研究は広東医科学技術研究基金プロジェクト(助成金番号B2022247)によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
自動血液分析装置シスメックス・コーポレーションXN-1000完全な血球数とNLR計算
ブライトフィールド顕微鏡オリンポスBX53組織学的評価
シトレート抗原回収バッファー(pH 6.0)アブカムAB93678熱誘発抗原回収
DAB基板キットベクター研究所SK-4100染色発生
EDTA抗凝固血液採取チューブBDバイオサイエンス367525末梢血液採取
フローサイトメーターBDバイオサイエンスFACSCanto IIT細胞サブセット解析
フローサイトメトリーチューブ(12 figure-materials-1ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織ブロック臨床病理アーカイブ該当なしNSCLC腫瘍サンプル
四色T細胞サブセット試薬(CD3/CD4/CD8/CD45)BDバイオサイエンス340499リンパ球サブセット検出のために
ヘマトキシリン染色シグマ・オルドリッチH3136核のカウンターステイン
HRP検出キットダコ(アジレント)K5007二次抗体検出システム
Ki-67一次抗体(クローンのMIB-1)アブカムAB16667免疫組織化学的検出
ミクロトームライカ・マイクロシステムズRM2235カット4 figure-materials-2リン酸緩衝生理食塩水(PBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック10010023セル洗浄と再懸濁
正に帯電した顕微鏡スライドサーモフィッシャー・サイエンティフィックJ1800AMNZ組織切片マウント
赤血球溶解液BDバイオサイエンス349202フローサイトメトリー前の赤血球溶解
統計解析ソフトウェアIBMSPSS v26.0データ分析

参考文献

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