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方法論記事

温度制御された心臓保存中の心臓エネルギーの連続測定のためのリン31磁気共鳴分光法

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DOI:

10.3791/70070

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2026年3月17日

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿では、臓器保存中の心筋エネルギーの連続的かつ定量的な評価を可能にする 、生外 リン31磁気共鳴分光法の再現可能かつ温度制御されたプロトコルを記述しました。

要約

信頼性の高い臓器保存は、ドナーの利用可能性を高め、移植の成果を向上させるために極めて重要です。ドナー心臓では静的保存が標準ですが、保存期間中に心筋エネルギーを正確にモニタリングする方法が必要です。

リン31磁気共鳴分光法(31P MRS)は、リン酸クレアチン(PCr)、アデノシン三リン酸(ATP)、無機リン酸(Pi)、細胞内pHなどの主要なエネルギー代謝物を直接的かつ動的に測定することを可能にします。この技術により、 生外 保存中の心筋代謝状態を縦断的、定量的、そして正確に評価することが可能です。MRSの利点には、エネルギー状態の動的評価と心室エネルギーの全体的な評価が含まれます。

プロトコルは豚ドナーの回収、心麻痺の投与、そしてカルディクトミーから始まります。大動脈弓は上腕頭幹の近位部で切断され、上行大動脈の長さを最大化します。肋状カニューレが遠位上行大動脈に固定され、左心房にマーキングが施され、心臓は温度特異的心無力で満たされた円筒形の断熱容器に収められます。蓋はカニューレに接続され、心臓を中に吊るし、容器は密封され、1時間にわたり1°C以内の温度を保ちます。

容器はリン同調コイル用の開口部を備えたカスタマイズされた発泡スチロールボックスに入れられ、コイル中心が左心室(LV)の中心に合わせられます。スカウト画像では、 31Pコイル付近のLV位置が確認されています。B0 シミングは均一な励起を確保し、その後非局在化した 31PのMRスペクトルを取得します。後処理ではスペクトルピークを特定し、PCr/ATP、PCr/Pi比、細胞内pHを計算します。

当プロトコルでは、 31PのMRSはh0から8までの連続したタイムポイントで実施されます。時間点間には、心臓は標準的な保管装置に所望の温度で保存されます。

31P MRSにより、エネルギー消耗の時間依存的な変化や、蓄積温度がエネルギー消耗を緩和する役割を研究できるようになりました。

概要

心臓移植は、終末期心不全の選定患者に対する決定的な治療法であり続けています。しかし、適切なドナー臓器の持続的な不足と現在の保存戦略の限界は、最適な結果と移植利用可能性の拡大に対する大きな障壁となっています2,3。従来、ドナー心臓は冷静保存で保存されており、これは簡単かつコスト効率が高いものの、長期輸送中に亜臨床的なエネルギー枯渇を受けやすいです2,4。リスクが高く地理的に遠隔の臓器を受け入れるプログラムが増える中で、虚血時間や総検査のみに頼るのではなく、保存中の心筋の代謝状態を客観的に特徴づけるツールの必要性が高まっています(5,6,7)。さらに、心筋の代謝や虚血耐性は温度に強く影響され、不十分な冷却や過度の低体温症は、保存中のエネルギー枯渇や細胞損傷を悪化させる可能性があります。したがって、複数の臨床的に関連性の高い保存温度でドナー心臓を評価することで、時間をかけて心筋の生存率を最もよく維持する状態を特定するのに役立ちます。

保存中の心筋バイオエナジーの正確かつ動的な評価は、保存技術の向上と臓器利用の最大化に不可欠です。現在、標準的な運用は約4〜8°C8の範囲で静的冷蔵を用いています。このプロトコルは短期間の保存で成功を収めていますが、この温度での長期保存は心筋の完全性を損なう可能性があります。したがって、適切な保存条件を明確にするためには、さまざまな温度と期間にわたる代謝活動の連続測定が不可欠です。従来の保存損傷の評価は、しばしば侵襲的で破壊的、断続的かつ局所的な組織状態のスナップショットしか提供しない心筋生検による組織学的検査や生化学的アッセイに依存しています。これに対し、リン31磁気共鳴分光法(31P MRS)は強力で非破壊的なモダリティであり、リン酸クレアチン(PCr)、アデノシン三リン酸(ATP)、無機リン酸(Pi)、細胞内pHなどの主要なエネルギー代謝物を、完全な心組織6,10,11,12内で直接、連続的に測定することを可能にします。同じ臓器内で追加の組織取り扱いなしに繰り返し測定できることで、31P MRSは心筋エネルギー状態の全体的かつ縦断的な洞察を提供し、生検や血清代替アプローチと比較して実験の精度と再現性を高めます。6,13。

31PMRSによる心臓移植の生存可能性の評価は、Bernardらによってレビューされています。ここでは、保存中の豚心臓のex vivo 3 Tesla 31P MRSに関する詳細な温度制御プロトコルを示します。この方法は、基板枯渇の監視、ストレージ変数の検証、保存介入の検証のための実用的な枠組みを提供します。このプロトコルは、温度依存性保存、虚血再灌流損傷、限界および拡張基準ドナー心臓の溶液最適化など、静的冷蔵保存中に連続的かつ全心室測定を求める検査室に特に適しています。

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プロトコル

このプロトコルは施設動物ケアガイドラインに従い、ジョンズ・ホプキンス動物ケア・使用委員会(プロトコル番号SW24M319)により、外科的収穫を含む生きた動物を含むすべての手技に承認されています。その後のすべての 生外 実験は安楽死後に得られた組織を用いて行われました。

1. 収穫前の手順

  1. インキュベーターの温度は目標保存温度より2°C低い設定にしてください。インキュベーターを少なくとも2時間は安定させてください。
  2. インキュベーターに6〜7個の氷嚢を入れて、設定温度まで冷やしてください。輸送中に温度を保つために十分な量の氷嚢を確保してください。
  3. 修正されたセントトーマス心筋麻痺溶液を準備します:
    1. 乳酸リンガー溶液バッグ1リットルに、
      1. 8.4%炭酸水素ナトリウム30 mL
      2. 30 mmol 5 mL/塩化カリウム 10 mL
      3. 硫酸マグネシウム20mmol/10mL 2.5mL
      4. 50%デキストロース15mL
      5. 50mg/10mLのニトログリセリン100mg
      6. 5000 Uの冷たいエリスロポイエチン
    2. 合計3リットルの心臓麻痺液を準備し、事前に冷却されたインキュベーターに保存します。
  4. 断熱クーラーは、心臓の垂直高さを最適な位置に調整できる内蔵のシリコンチューブで別れておく。クーラーの蓋の開口部のすぐ下にあるシリコーンチューブのポイントに黒い基準マークをつけます。
  5. 収穫した心臓を固定・吊るすためのリブ付きカニューレを取っておきましょう。カニューレの外表面に黒い基準マークを付けて、再現可能なアライメントポイントとして使います。

2. 収穫手順

  1. テラゾール、ケタミン、キシラジンを1本の注射器に混ぜて筋肉内投与し、複数回の注射に伴うストレスや痛みを最小限に抑えるために動物を鎮静させます。
    1. テラゾール(50mgチレタミン+50mgゾラゼパム)を各成分ごとに4.4mg/kgで投与しました。
    2. ケタミンは2.2 mg/kgです。
    3. キシラジンは2.2mg/kgです。
  2. 動物を挿管し麻酔してください。
    1. 潮水量は5〜10 mL/kgです。
    2. 呼吸数は12〜15回/分。
    3. 呼気末端正圧、5 cm H2O。
    4. 酸素流量1〜2 L/minで0.5-2%のイソフルランを吸入します。
  3. 末梢静脈内ラインを設置し、胸骨切開を行い心膜15を開いてください。必要に応じて抗不整脈薬を投与してください。
  4. 心麻痺針を上行大動脈に挿入し、大動脈弁の上、しかし大動脈弓の下に位置させます。
  5. 1リットルの心麻痺液の袋を針に刺して接続します。
  6. 左心房、下大静脈、上大静脈を換気します。
  7. アーチ近位部に大動脈クロスクランプを装着します。
  8. 冠動脈を約75〜80 mmHgの圧力で心肌不全の血流を開始します。インラインゲージを使って圧力を監視してください。
  9. 解剖学的な完全性を保ちながら心臓を収穫する。
  10. 収穫した心臓に冷えた生理食塩水を流し、表面を素早く冷やします。
  11. 心臓を冷たい心不全症の溶液を入れたボウルに入れます。
  12. 心筋の先端に心筋温度プローブを挿入し、心筋麻痺用の溶液のボウルに体温計を挿入して体温を測定します。
  13. 大動脈を肺動脈(PA)から分離してください。
  14. リブ付きカニューレを大動脈にシルクタイとジップタイで固定し、カニューレのマーク部分が左心室(LV)の位置に対応していることを確認してください。
  15. クーラーにセントトーマス溶液を60〜70%まで満たし、その後ハートとボウルの溶液をクーラーに移して完全に満たし、浸透感を最大化します。
  16. 最終溶液と組織温度を測定・記録してください。
  17. リブ付きのカニューレを、あらかじめ決めた位置でシリコーンチューブでクーラーフタに取り付けます。リブ付きカニューレとシリコーンチューブのマークが揃っているか確認し、クーラーを閉じたときにLVが蓋に対して一定の向きを保ち、各スキャンでLVの位置が再現可能になるようにしてください(図1A)。
  18. MRデータ収集時に最適なMR場均一性と良好な信号対雑音比を確保するために、器官の空気除去を行います。
  19. クーラーの蓋をしっかり固定し、LVの位置を整えましょう。
  20. 氷嚢とクーラーボックスを輸送バッグに入れてください。

3. 分光プロトコル

  1. このプロトコルは3TのMRスキャナーに最適化されています。MRスキャナーは多核分光機能を備えています。4kWの広帯域高周波増幅器と受信機、標準ベンダー提供のリンコイル(P140)も含まれます。 31Pコイルは直径14cmのシングルループ送受信コイルで、チューニングとマッチング用の2本のロッドがあります。
  2. 搬送前にMRI施設スタッフに通知し、スキャンの利用可能性を確認してください。
  3. 発泡スチロール製の箱を準備します。外寸法は長さ33.5cm、幅28cm(長辺)、幅23cm(短辺)、厚さ4cm。箱の片側に幅3.3cmのスリットを開け、 31Pコイルを心臓の隣に配置できるようにします(図1B)。
  4. 心臓が吊り下げられ、コイルの中心軸に隣接し、左心室の位置を狙ってクーラーを挿入します(図1C)。高さ25.4cm、幅11.4cmのクーラーを用意してください。シリコーンチューブは、心臓マウントポイントの蓋内側から7cmの長さで固定されています(図1D)。
  5. クーラーの周囲の隙間に氷嚢を置き、クーラーとコイルの間にスペースを作らないように注意し、スキャン中の安定性を確保するために箱の蓋をテープで貼ります(図1E)。
  6. レーザーガイドとセンタリングランドマークを用いてクーラーを磁石アイソセンターに合わせ、最適なB0 均一性を確保します(図1F)。
  7. 31Pコイルをスキャンコネクタに接続し、チューニングロッドとマッチングロッドをコイルに取り付けます(図1F)。
  8. 三平面ローカライザーのスカウト画像を取得し、コイルの位置と 31Pコイルへの最適なLV近接を確認します(図2)。
  9. LVの位置が間違っている場合は、クーラーの蓋を回してスカウトスキャンを再実行してください。
  10. 局所化された2次シミング16の静電場B0マップを取得し、高スペクトル品質に必要な関心領域全体で均一な磁場を確保します。
    1. B0マップを入手すると、「Shimtool」16 はそのマップを読み込んだ状態で自動的に発射されます(図3)。
    2. すべてのスライスで心筋を輪郭とする平滑化された多角形のクリックポイント(図3A)。
    3. 「シムツール」は制約付き最小二乗法を用いて局所共鳴周波数と、1次(x, y, z)および2次(xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y2)/2)のシム場補正を決定します(図3C)。これらの補正用語をスキャナーにアップロードし、以下のスキャンに適用してください。
  11. 31PMRS取得前に、コイルのチューニングロッドを回して無線周波数コイルの最適なチューニングを実現し、MRシステムにインピーダンスを合わせることで、信号伝送の効率を最大化し、無線周波数システム内の反射を最小限に抑えます(図4)。
  12. 初期の非局在化 31P磁力波スペクトル(繰り返し時間[TR]:10秒、反転角=90°、断熱的B-1-非感度回転4(BIR-4)パルスを使用;エコー時間[TE] = 0.1 ms;帯域幅=3000ヘルツ(Hz);1024スペクトル点、5つの平均)を取得し、PCrピークとγ-ATPピーク間の中心における共鳴周波数を決定します。総取得時間:50秒。
  13. その後、3.12(TR: 16秒、反転角=90°、断熱BIR-4パルスを用いた計算に基づいてオフセット周波数を調整した後、完全に緩和した非局在性 31P磁力波スペクトルを取得します;TE = 0.1 ms;帯域幅=3000 Hz;スペクトルポイント512、平均20)。総捕捉時間:5分20秒。
  14. スキャン後、体液と心筋の体温を測定します。目標からの偏差が≤1°Cであることを保証します。
  15. 心臓は次の予定されたスキャンまで、望む温度でインキュベーターに保存してください。

4. データ分析

  1. 完全に緩和した 31PMRSデータをエクスポートします。SDATデータファイルと処理のためのグラフィカルユーザーインターフェースへの読み込み(図5A)17。
  2. まず、15 Hzのローレンツフィルター(図5B)でスペクトルをアポダイズし、0次と1次 位相シフトをかけて、PCrピークの中心で周波数を0ppm(ppm)に設定します(図5C)。
  3. 表1に記載された知識値を用いてAMARES関数18を用いてスペクトルをフィットさせます。
  4. 次のウィンドウ(図6)で適切なフィッティングを検討し、各ピークが正しく特定されているか(個々の成分)、解析後に残留信号が最小限に抑えられているか(残留物)を確認しましょう。
  5. 分光ピーク振幅に基づいて心筋代謝物比のPCr/ATPおよびPCr/Piを計算します(図7)。γ-ATP共鳴はATPの指標として用いられます。
  6. 調整後のPiとPCrの化学シフトに基づいて細胞内pHを計算し、温度条件14を反映します。
    注意:プロトコルはMRIスキャンの後(ステップ3.15)ごとに一時停止可能です。温度管理が常に維持されていることを確認してください。

5. 方程式

  1. 先に述べたように細胞内pH(pHi)を計算します。
    式1
    ここでTは温度(°C)、δ0 はPCrとPi共鳴の観測される化学シフト差(ppm)です。

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結果

局所化された2次 シミング16 は、関心領域全体でより均質なB0 磁場をもたらし、各時刻(0 h: 14.0 to 4.0 Hz; 4 h: 17.5 to 3.2 Hz; 8 h: 16.0 to 3.2 Hz)で示されました。これにより、各時刻で優れたスペクトル品質が達成されることが保証されました(図7)。体 外 冷蔵中の心筋代謝変化は、高エネルギーリン酸塩の急速な枯渇と進行的な細胞内酸性化を示しています。PCr/ATP、PCr/Pi、細胞内pHの測定パラメータすべてにおいて、静的冷蔵保存の最初の4時間以内に最も急激な低下が起こり、この初期保存期間における代謝脆弱性の高まりを反映しています。この段階の後、さらなる劣化はより緩やかな速度で進行し、h8でエネルギー予備が最小レベルに近づき、著しいアシドーシスが観察されます(図8)。

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ディスカッション

本論文は、心臓保存中の心筋エネルギーの連続評価のための外科準備および 31P MRS取得・解析プロトコルについて記述しています。 31P MRSは異なる冷蔵温度での主要な心臓代謝物の連続的かつ非破壊的な評価を可能にし、心筋組織の代謝生存可能性に関する新たな洞察を提供します。この 31PMRSプロトコルは比較的高速で、スキャナー時間が最小限で済むため、組織温度の変化が大きく起こる前に心臓エネルギーを評価できます。このアプローチは他の大型動物モデルにも適応可能であり、移植後のエネルギー代謝を標的とした体内外灌 流プラットフォームや 介入にも拡張される可能性があります。

このプロトコルの重要なステップには、収穫時およびスキャン後の正確な体温モニタリングが含まれており、心筋温度を厳格な範囲内に保つことが代謝生存率の維持と再現可能なMR結果の確保に不可欠です。さらに、心臓を完全に脱空気状態にすることは、最適なMR場の均質性を確保するために不可...

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開示事項

私たちには利益相反はありません。

謝辞

ジョンズ・ホプキンス大学の心臓外科および放射線科のチームの皆様に感謝いたします。この研究の成功を支えてくださっています。この研究は米国胸部外科学会(AATS)の資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
インキュベーターベンチマークサイエンティフィック H2265-HCMyTemp 65HC ヒーティング冷却インキュベーター
断熱クーラーゲータレードUPC 052000047097ゲータレード 断熱スポーツ飲料クーラー
jMRUIバージョン7.0ジャワwww.jmrui.euデータ解析のためのグラフィカルユーザーインターフェース
心筋体温プローブデロイヤル81-030415DeRoyal 400シリーズ心筋体温プローブ(15mm)
磁気共鳴スキャナーフィリップスhttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingアチエヴァ3T、フィリップス・ヘルスケア
シングルループリンコイルフィリップス・ヘルスケア https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140、フィリップス・ヘルスケア

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