RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法

サマリー

ここでは、RNA関連のクロマチンDNA-DNA相互作用をキャプチャし、RNA関連の三次元ゲノム組織をマッピングするプロトコルを提示します。

要約

RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法(RDD)は、特定のRNAによってアンカーされたクロマチン相互作用をマッピングするための標的戦略です。同時に、対象RNAに関連するゲノム遺伝子座を特定し、これらの遺伝子座間の長距離DNA-DNA接触を解消し、空間的組織や調節関係の推論を可能にします。RDDでは、標的RNAに相補的なビオチニル化アンチセンスプローブが用いられ、RNAとクロマチン複合体の濃縮に使われます。細胞は架橋され、クロマチンは断片化され末端修復され、近接結合は設計されたリンカーを用いて、捕獲された複合体内で空間的に隣接するDNA断片を結合します。結合生成物は精製され、シーケンシングライブラリに変換され、高スループットシーケンシングで解析されてRNAアンカーされた相互作用マップが作成されます。RDDは、宿主感染微生物やウイルス由来の内因性RNAだけでなく、さまざまな細胞型や実験条件にも適合しています。この手法は、エンハンサー-プロモーターのペアリング、長距離調節、調節コードRNAおよび非コードRNAに関連する三次元ゲノム構造の解析に適した、遺伝子座特異的かつ高解像度の接触プロファイルを得ます。生化学的濃縮と近接結合、次世代シーケンシングを統合することで、RDDはRNAがクロマチンをどのように組織し遺伝子発現に影響を与えるかを明らかにするための堅牢かつ再現性の高いワークフローを提供します。

概要

Hi-CとChIA-PETは、クロマチン断片間の空間的近接を共有結合DNA接合点に変換し、ループから区画^1,2までのスケールにわたる物理的接触を推定するために配列解析することで、三次元(3D)ゲノム組織の研究を変革しました。タンパク質以外にも、多数のRNAがクロマチン相互作用に関与し、エンハンサー/リプレッサー-プロモーターのコミュニケーションや高次クロマチンの組織に影響を与えます^。しかし、タンパク質アンカーアッセイの進歩にもかかわらず、特定のRNAが結合した遺伝子座間で長距離のDNA-DNA相互作用をどのように組織化するかを直接的に明らかにすることは依然として困難です。RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用法(RDD)⁴の包括的な目標は、高解像度かつRNAアンカーされたクロマチン相互作用マップを生成することで、定義されたRNA種がクロマチンとどのように結合し、局所近傍内でDNA-DNA接触を調整するかを明らかにし、その^RNAを中心としたエンハンサー/リプレッサー-プロモーター通信や高次ゲノム構造に関する機構的推論を可能にすることである.方法論的には、RDDは対象RNAに対するビオチニル化アンチセンスプローブで架橋RNA-クロマチン複合体を濃縮し、空間的に隣接するDNA断片を結合する設計リンカーを用いた複合体近接結合を行い、感染した宿主における外因性細菌やウイルスRNAを含む多様な細胞型や状態における仮説駆動解析に適した遺伝子座特異的接触プロファイルを生成するシーケンシングライブラリを構築します。これらの特徴により、RDDは既存の染色体コンフォメーション手法のRNAアンカー対応法として位置づけられ、調節分析に適した解像度で解釈可能な接触情報を提供します。

RDDの根拠は、既存のRNAクロマチンマッピング戦略の限界に由来します。ChIRP-seqやCHART-seqなどの標的捕捉手法は、単一のRNAのゲノム全体のDNA占有を特定します。これは結合を報告するものの、占有された遺伝子座^6,7間の物理的なDNA-DNA接触は報告しない1RNA対全DNAパラダイムです。GRID-seqやMARGIを含むグローバルアッセイは、すべてのRNAからすべてのDNAに拡張され、RNA中心複合体内のRNA-DNA近接をゲノム全体でカタログ化^{していますが、}RNA中心複合体内でのDNA-DNA接触の明示的な解読はしていません。RD-SPRITEのような多重化手法は、多くのRNAやDNA遺伝子座間で高次の共局在を報告し、核^トポロジー9の側面を伝えますが、シグナルは通常豊富なRNAに支配されており、これにより低存在比の調節RNAが見えにくくなり、単一のRNAの相互作用ネットワークの標的深さが制限されることがあります。ChIA-PET¹⁰、PLAC-seq¹¹、HiChIP¹²などのタンパク質またはマークアンカードリッチメントプラスリゲーション戦略は、ファクター中心ループを効果的にマッピングしますが、RNA特異的キャプチャモジュールなしでは特定のRNAに相互作用を固定せず、RNAアンカーされたDNA-DNA次元を未解決のままにします。標的的な生化学的濃縮と複合体近接結合を統合することで、RDDは関心RNAが共存するクロマチン断片間のDNA-DNA接触を直接捉えます。⁴、低〜中程度のRNAに対する感度と特異性を高め、占有中心的(ChIRP/CHART)^6,7および近接中心的グローバル手法(GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)³を補完する高解像度の遺伝子座特異的接触マップ生成^{します。8,9} タンパク質因子アンカーライゲーション戦略(ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)と概念的に並行しながらも、10,11,12。生物学的な課題が標的RNAに関連するクロマチン座の空間的関係を解決する必要がある場合、特にそのRNAが転写調整のために長距離ゲノム相互作用を台橋・制約する仮説がある場合、またはRNAの結合セットから推定される調節標的を優先し、直接的なRNA中心ハブと単なる共存を区別する際にRDDを検討すべきです。 特定のRNAのエンハンサー/リプレッサーネットワークの区分や、RNAアンカー接触の再配線の追跡、摂動、発生段階、感染の追跡。このような状況下で、RDDはRNAアンカーされたDNA-DNA相互作用情報を、厳密な機構研究に必要な感度、特異性、解像度で提供することで、未充足のニーズに応えます。

プロトコル

注:このRDD法では、例のシステムではショ ウジョウバエ のS2細胞と roX2 および 7SK のncRNAの両方を使用します。反応試薬は 表1に、バッファー組成は 表2、試薬および装置の詳細は 材料 に記載されています。 図1 はRDDライブラリ生成のプロトコルの概要を示しています。回転(F8)を伴う手順は、F8、20rpm、uu20、UU30のパラメータを使用します。ステップ2からステップ10まで使用したすべてのバッファーには、新たに1倍のプロテイナーゼ阻害剤(PI)とRNase阻害剤(RI、0.05 U/μL)を補足します。

プローブ設計の原則:新規かつ未報告のRNAについては、Stellarisプローブデザイナーでプローブをオンラインで設計し、その後アラインメントツール(例:BLAST様アラインメント)やUCSC BLATで非特異的な配列をフィルタリングし、選択プローブの3′ビオチニル化を行います。新しい標的RNAについては、標的RNAに適合する配列を設計し、陰性対照として3′ビオチニル化も施します。品質管理には、転写検証のための標的RNAに対する逆転写プライマーの設計や、汚染評価のためのqPCR用ゲノムDNA標的プライマーの設計が含まれます。結合特異性を評価するために、ゲノム結合部位および非結合領域を位置づけるプライマーを含めます。 roX2 および 7SK 関連のプローブは 表1に示されています。

1. 細胞収穫と二重架橋

1. ショ ウジョウバエ のS2細胞を27°Cで培養します。 合計で約3×10⁹ セルを収集することを目指します。細胞を直接培養培地に再懸浮させ、トリパンブルー計数後に8×10⁸ 細胞を各50mL円錐形遠心分離機チューブに分割します。
   1. 細胞2μLとDPBS8μLを混ぜ、トリパンブルー10μLを加え、ヘモサイトメーターにかけて細胞計数を行います。
      注:ショ ウジョウバエ のS2細胞を例として挙げます。通常、8 x 10⁸ 細胞は、1本の50 mL円錐形チューブで処理される約40 mLの培養体に相当します。ユーザーは使用する細胞タイプや標的RNAの存在量に応じて培養条件や細胞量を調整できます。
2. ホルムアルデヒドを最終濃度1%(w/v)に加え、27°Cで20分間回転させます。
   注意:培養温度または室温(RT;20-25°C)で固定を行います。特に記載がない限り、ミキサー(F1、12rpm)で回転してください。接着型セルには軌道シェーカー(50rpm)を使用します。
   注意:ホルムアルデヒドは有毒です。排気フードを使いましょう。
3. 845 x g のペレットセルをRTで5分間投与;上清液は適切な化学・生物学的廃棄物に捨てます。8×10個8個^のS2 細胞からなる細胞ペレットは通常、約1 cm³ の体積です。
4. ペレットを新たに調製した2 mM EGSで再懸浮し、DPBSで総体積40 mLにし、27°Cで40分間回転させます。
   注:EGSをDMSOに溶解し、DPBSに移管してください( 表2参照)。DMSOのEGSは危険です。
5. 2.5 Mグリシン2 mLを加えて焼入れ(最終0.125 M);27°Cで10分間回転させます。
6. 845 x g のペレットをRTで5分間投与;上清液は適切な化学・生物学的廃棄物に捨てます。27°Cで40mLの予温されたDPBSでペレットを2回洗浄します。
7. 845 x g でペレットを5分間投与します。細胞ペレットを10 mLのDPBSに再懸浮させ、細胞をカウントします。架橋工程では細胞数が約30%減少することもあります。
8. 各50 mLチューブに1×^{10 x 9} の細胞をアリコートします。845 x g のペレットをRTで5分間投与;上清液を捨てる。ペレットは−80°Cで保存します。
   注:以下の反応手順はすべて1つのRDDライブラリに関するものです。

2. 細胞溶解と核の透過化

1. −80°Cの冷凍庫から1×10⁹ S2の二重架橋細胞を1つ取ります。氷水で30分間解凍します。
2. 細胞を50 mLのDPBSに再懸浮させ、845 x g で遠心分離機で5分間RTで処理し、上清液を廃棄します。
3. 細胞溶解:細胞ペレットを0.1%ファルア溶解バッファー(トリトンX-100不使用)20 mLに再懸浮させます。RTで15分間回転します。顕微鏡で確認してください;細胞の種類ごとに時間を調整してください。溶解の成功は、形質膜の透過化と細胞質放出によって示されており、核が標準的な光学顕微鏡下で明確な構造として容易に見えるようになります(図2A)。
4. 核の透過化:10%のSDS(最後の1%)を1.8mL添加します。37°Cで15分間回転させます。3,200 x g で20分間RTで遠心分離し、上清液は捨てます。顕微鏡による検査(図2B);細胞の種類ごとに時間を調整してください。核はより濃く見え、膜のベールのように見えたり、一部は切り離されています。この繰り返しを溶解が完了するまで続けます。
5. 核洗浄:ペレットを20 mLの0.1%ファルア溶解バッファー(トリトンX-100なし)に再懸浮させ、RTで10分間回転させ、その後3,200 x g で遠心分離してRTで20分間、上清液を廃棄し、核ペレットの大きさをマークします。核ペレットは後で使用するために−80°Cで保存してください。

3. クロマチン断片化

1. 核ペレットを0.1%ファルア溶解バッファー(トリトンX-100を含む)15 mLに再懸浮させます。泡を避けて、14mLの丸底試験管に核の懸濁液1.5 mLを分けて注入します。
   1. 超音波検査前にペレットサイズをマークして比較し、超音波検査後もペレットが大きい場合は再度超音波検査を行います。
2. ソニックエイトは振幅38%で4.5分間、30秒のオン/30秒のオフサイクルで行います。超音波処理済みのクロマチンをすべて15mLチューブに集め、3,200 x g で20分間RTで遠心分離し、その後上清液(~13 mL)を新しい15 mLチューブに移します。

4. C1ビーズを用いたプリクリアなクロマチン

1. ストレプタビジンC1ビーズを準備する:ストレプタビジンC1ビーズ400μLを1.5mLチューブ(100μL、^{10 × 9} S2細胞)に入れ、磁石に30秒置き、上清液を除去します。0.1%FA溶解バッファー200 μL(Triton X-100使用)で2回洗浄し、その後0.1% FA溶解バッファー100 μL(Triton X-100使用)で再懸濁します。
2. クロマチンプリクリア:準備済みのストレプタビジンC1ビーズ100μLを、超音波検査クロマチン上清~13mLのチューブ(ステップ3.2より)に加える。RTで20分回転;磁気ラックに1分間置き、上清(事前クリア済みクロマチン)を新しい50mLチューブに移します。10μLを取り、−20°Cで保存してQC1を保持します(図3A)。

5. RNAプローブを事前にクリアされたクロマチンとハイブリダイズする

1. 新たに調製されたハイブリダイゼーションバッファー2巻(26 mL)を、あらかじめクリアされたクロマチン1巻(13 mL)に加えます。RTで30分ローテーションしてください。
2. 混合物を3本の15mLチューブに分けます。各サンプルに100μMのビオチニル化プローブ(DNAオリゴヌクレオチド、 表1)を6μL追加します(15 mLチューブあたり2 μL);37°Cで一晩回転させてください。チューブキャップをフィルムで密封してください。

6. C1ビーズのクロマチン複合体プローブを固定する

1. ストレプタビジンC1ビーズをブロッキングバッファーでブロックする:新鮮なストレプタビジンC1ビーズ400μLを取り、0.1%FA溶解バッファー800μL(Triton X-100なし)で2回洗浄します。ブロッキングバッファー400μLを加え、ミキサー(F8)でRTで30分間インキュベートします。磁石に10分置き、上清液を捨てます。Triton X-100を除き、800μLの0.1%FA溶解バッファーで3回洗浄します。各洗浄の際、ピペットで優しく混ぜ、磁石に少なくとも30秒置いてから上澄液を捨てます。
2. C1ビーズを400μLのハイブリダイゼーションバッファーに再懸浮させます。
3. ストレプタビジンC1ビーズ上のプローブ-クロマチン複合体を固定化:ブロッキングバッファー処理済みストレプタビジンC1ビーズを対応するハイブリダイズドクロマチンに加え、RTで2.5時間回転させます。
4. 磁気ラックを使って15 mLチューブから1.5 mLチューブへ固定反応を移します。それぞれ15mLチューブを磁気ラックに5分間置きます。上澄液を除去してください。ビーズを1 mLのウォッシュバッファーで再懸浮させ、新しい1.5 mLのチューブに移します。
5. ビーズを800μLのウォッシュバッファーで5回洗い、その後TEバッファーで2回洗います。洗浄するにはバッファーを加え、ミキサー(F1、12rpm)で37°Cで5分間キュベーションし、磁気ラックに30秒置き、上清液を捨てます。
6. ビーズをRT時に1,000μLのTEバッファー(1×PI)に保持します。

7. 変性ヨードアセチル-PEG2-ビオチン(IPB)でC1ビーズの空位をブロッキングすること

1. 4.8 mgのIPBを400 μLのIPBウォッシュバッファーに溶解します。RTで15分間回転させてください。
2. β-ME溶液:312 μLのH₂Oにβ-ME 1 μLを加える;混ぜてRTで15分間回転させます。
3. 変性IPB:β-ME溶液44 μLを400 μLのIPBに加える;混ぜてRTで15分間回転させます。
4. C1ビーズをブロックする:プローブ・クロマチン複合体と結合したC1ビーズに変性IPB220 μLを加える(1,000 μL TEで);RTで15分間回転させてください。
5. C1ビーズはTEで5回洗います。バッファーを追加し、ミキサー(F8)でRTで5分間インキュベーションし、その後磁気ラックに30秒置き、上清液を捨てます。

8. クロマチン末端修復(ビーズ上)

1. C1ビーズのクロマチンに693μLのエンドリペアミックスを加え、よく混ぜます。次に7μLのT4 DNAポリメラーゼを加えます。
2. サーモミキサー(800rpm)で12°Cで30分間孵育;その後、ミキサー(F8)で16°Cで15分間使います。
3. ビーズを800μLの氷のように冷たいChIA-PETバッファーで3回洗い、その後TEで1回洗います。各洗浄の際、ピペットで優しく混ぜ、磁石に少なくとも30秒置いてから上澄液を捨てます。

9. クロマチンAテール(ビーズ上)

1. C1ビーズのクロマチンに693μLのAテールミックスを加えてよく混ぜ、その後7μLのKlenowフラグメント(3'-5'エクソ)を加えます。
2. ミキサー(F1、12rpm)で37°Cで50分間孵化します。ビーズを800μLの氷冷ChIA-PETバッファーで3回洗い、次にエリューションバッファーで1回洗います。

10. クロマチン近接結合(ビーズ上)

1. C1ビーズのクロマチンに1,390μLの近接ライゲーション混合物を加えます。ミキサー(F8)をRTで5分間孵化させます。
2. 次に10μLのT4 DNAリガーゼを追加します。ミキサー(F8)をRTで5分間回転させ、その後F1(12rpm)をRTで50分間、その後16°Cで夜間に切り替えます。
3. ビーズを800μLの氷冷ChIA-PETバッファーで3回洗浄し、その後TEバッファーで2回洗います。

11. C1ビーズから近接結合クロマチンDNAを放出する

1. C1ビーズのクロマチンに480μLのLC ChIP洗脱バッファーを加え、よく混ぜ、20 mg/mLの20 μLプロテインナーゼKを加えて脱架します。
2. サーモミキサー(950rpm)で65°Cで一晩孵育します。

12. 近接結合DNA精製(フェノール:クロロホルム:IAA試薬を使用)

1. 高密度位相ロック管を13,500 x g で2分間RTで回します。脱連結生成物(500 μL)を高密度位相ロック管に加えます。
2. 高密度フェーズロックチューブに500μLのフェノール:クロロホルム:IAA(5mLピペットチップ使用)を加えます。手で優しく混ぜます。
   注意:フムフード内での作業をしてください。
3. 遠心分離機で13,500 x g で6分間RTで加熱します。遠心分離中に、3 M酢酸ナトリウム(pH 5.5)を52 μLの底部に加えて1.5 mLのチューブを準備します。キャップに青色染料入りグリコーゲン1μLを置きます。この時点で混ぜたり、チューブを閉じたりしないでください。
4. 高密度フェーズロックチューブから準備された1.5mLチューブへ上清液を迅速に移します。
5. 1.5mLチューブに氷冷イソプロパノール520μLを加えます。優しく混ぜてから、-80°Cの温度で一晩置きます。
6. チューブを-80°Cから外し、RT(約10分)で解凍します。13,500 x g で遠心分離機を4°Cで約1時間、DNAを沈殿させます。チューブの底には青いペレットが存在します。
7. DNAペレットを75%エタノールで洗い、上清液を慎重に除去します。75%氷冷エタノール800μLを加え、13,500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を除去します。エタノール洗浄を一度繰り返します。
   注意:遠心分離後すぐに上清液を除去してください。まず1mLのチップで、次に100μLのチップで除去してください。温かいチューブは青いペレットを外すことがあります。
8. 最後のエタノール洗浄後、13,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、底の残留エタノールを回収し、慎重に残ったエタノールを除去します。
9. DNAペレットを真空で乾燥させます(通常は1分30秒から2分)。DNAペレットを10μLのエリュションバッファーに再懸濁し、RTで約2時間インキュベークします。DNAを核酸定量器で定量し、自動毛細管電気泳動システム(図3B-C)で品質を評価します。

13. 近接結合DNAのTn5標識

1. Tn5タグメンテーション試験: 表1に従い、総反応容積50μLを準備します。氷上のPCRチューブ内に、QC1 DNA50 ng、ddH₂O、4倍タグメンテーションバッファー12.5 μLを順次添加します。最後に、必要な量のTn5酵素を加えます。各加えた後は、泡が出ないようにピペットで上下に10〜20回ずつ優しく混ぜます。必要に応じてチューブを短く回転させてください。
   注意:タグメンテーションには、慎重に混ぜ、気泡を避けることが非常に重要です。さらに、Tn5の量は経験的に最適化され、望ましい断片分布(主に200 bp-1 kb)を得る必要があり、ユーザーはTn5入力を調整することでサイズ範囲を調整できます。
2. タグメンテーション反応:PCR機器で55°Cで10分間インキュベートし、蓋を70°Cに設定し、4°Cで保持します。
3. Tn5放出およびDNA精製:タグメントDNAに50μLのChIPエリュションバッファーと1μLのプロテイナーゼKを加え(最終SDS濃度0.5%)。65°C、900rpmでサーモミキサーで30分間混ぜて培養します。DNA精製キットでDNAを精製し、自動毛細管電気泳動システム(図3D)を用いてDNAを定量します。
   注:この段階では、DNA断片は主に200 bpから1 kbの範囲であるべきです。Tn5酵素とDNAの比率は経験的に最適化されるべきです。
4. Tn5タグメンテーションのスケールアップ:Tn5の試験結果に基づき、同じ条件下で近接結合DNAの反応を拡大します。タグメント後、PCR装置からサンプルを取り出し、氷に置きます。短時間スピンダウンし、RTで2分間インキュベートし、その後10%SDS(w/v;最終SDS濃度:1%)を5.5μL追加します。泡を避けながらピペットで上下に10〜20回ずつ混ぜ、短くスピンダウンしてください。サンプルを37°CでPCR機器で少なくとも15分間培養します。タグメントされたDNAは-20°Cで数日間保存可能です。

14. M280ビーズのブロッキング

1. 20μLのM280ビーズを取り、200μLの1x B&Wバッファーで2回洗います。洗浄時にはバッファーを追加し、ピペッティングでビーズを再懸浮させ、短時間回転させて磁石に30秒置き、上清液を取り除きます。
2. ブロッキングバッファによるビーズブロッキング:M280ビーズを100μLのブロッキングバッファに再懸浮します。ミキサー(F8)をRTで45分間回転させます。
3. ビーズウォッシング:短く回転を下げ、10分間磁石に置き、ブロッキングバッファを捨てます。200μLの2×B&Wバッファーでビーズを2回洗います。
4. ゲノムDNAによるビーズブロッキング:ビーズを2×B&Wバッファー100μLに再懸濁し、せん断ゲノムDNA100μL(~500 ng、300-500 bp)を加え、よく混ぜてミキサー(F8)でRTで30分間回転させます。
5. ゲノムDNA混合物を廃棄し、200μLの1x B&Wバッファーで2回洗浄します。

15. M280ビーズ上の結界DNA固定化

1. 結合DNAをM280ビーズに結合させる:1個のB&Wバッファーを捨てる。断片化されたリグネーションDNAをすべてM280ビーズに加え、混ぜてミキサー(F8)でRTで45分間回転させます。
2. 短く回転を下げて磁石を当て、上清液を捨てます。37°Cで500μLの予備温め済み洗浄バッファーで5回洗浄ビーズを抽出します。1回は1倍のB&Wを500μLで、1回は200μLの1倍のB&Wで。磁石に1分間置き、チューブの底で優しく混ぜてから上澄液を捨てます。ビーズに30μLの洗脱バッファーを加えます(混ぜないでください)。
   1. 洗浄にはバッファーを加え、ミキサー(F8)で5分間孵育し、磁石に30秒置き、その後上清液を捨てます。結合した結実したDNAを持つビーズは-20°Cで保存可能です。

16. M280ビーズにおけるリゲートDNAの増幅

1. PCR反応を準備します(DNAライブラリーの調製キットに従って)。PCRチューブをPCRマシンに移し、プログラムをセットアップします。
   注:PCR増幅サイクルは最終ライブラリの品質に非常に重要です。サイクル数を増やすことでライブラリの複雑さが軽減されます。経験的にサイクル数を最適化し、一般的に15サイクルを超えないようにしましょう。
2. 磁気ビーズを用いてPCR産物を精製します(図3E)。サイズ選択:(0.8-0.61)磁気ビーズを使ってRDDライブラリのダブルサイズ選択を行います。
   1. 最終的なDNAライブラリーは主に250〜600 bpの範囲であるべきです(図3F)。シーケンスのために核酸定量器で10〜30 ngのライブラリーDNAを測定してください。
3. シーケンシング:イルミナシーケンシング用の被験者で、2×150 bp。シーケンスの深さはRNA発現、結合部位密度、ゲノム全体のパターンに依存します。ここで、 roX2 は~23Mリードで飽和し、 7SK は~8Mリードで飽和するため、後者は深さが少なくて済みます。種ごとに始め、さらに余分な深さがあれば冗長性を評価します: ショウジョウバエは~5M、ヒト/マウスは~20M、QC指標で調整します。

結果

本プロトコルは、RNA関連クロマチンDNA-DNA相互作用を検出するためのRDD法を概説しています。ワークフローは、ビオチニル化プローブを用いたRNA-クロマチン複合体の生化学的濃縮から始まり、その後、空間的に隣接するDNA断片を連結するための近接接続を行います。シーケンスライブラリを構築した後、ハイスループットシーケンスが行われます。

RDDデータのバイオインフォマティクス解析は、ChIA-PIPEプラットフォーム¹³によって効率化されています。この分析パイプラインの主要なステップには、生リードからのシーケンシングリンカーのトリミング、ペアエンドリードを参照ゲノムにマッピングすること、一意にマッピングされたリードペアのフィルタリング、PCR重複の除去、プローブ座標に基づいてターゲットRNA部位への相互作用割り当てが含まれます。通常、リンカーと品質フィルタリング後、シーケンス済みリードの約50%が正常に保持されます。有効な相互作用イベントを集約して遺伝子座特異的な接触マップを作成し、RNA誘導クロマチン構造の詳細なプロファイルを提供しました。RDDデータについては、3つのChIA-PIPE調整を実施しました。デフォルトのChIA-PETリンカーの代わりにRDDリンカーシーケンス("ACGCGATGTATCTGACT")を使用し、ループクラスタリングは、RNA相互作用部位の位置精度を高めるために、デフォルトの500 bpに加えてPET延長を50 bpに短縮して実施しました。RNAリッチメントカバレッジはdeepTools(bamCoverage v3.5.1)で1 bpビンサイズを用いて計算されました。これらの修正はリンカー構成、PET拡張の削減による細かなクラスタリング、そして高解像度カバレッジ適応ChIA-PIPEをRDDライブラリに提供しています。

図4は、2種類の非コードRNAの代表的なRDD結果を示しています。roX2¹⁴(図4A,C;緑)はショウジョウバエのX染色体構造と遺伝子発現の調節に関与する用量補償複合体RNA、そして7SK¹⁵(図4B,D;紫色)は高度に保存された小型核RNAで、多細胞動物のP-TEFb活性を調節することで転写延長を調節します。RDDによって検出されたRNA結合およびクロマチン相互作用は、RNAPIIのChIA-PETデータ(青い弧)とともに可視化され、RNA関連ループとプロモーター(P)、エンハンサー(E)、転写開始部位または終了部位(TSS/TES)などの主要な調節要素との構造的関係が浮き彫りになります。集計データにおける顕著な相互作用ピークは、roX2と7SKの両方が重要なエンハンサー-プロモーターまたは長距離クロマチン接触を媒介するモデルを支持しています。

多次元解析は、RDDアンカーによる相互作用とHi-Cゲノム全クロマチンコンフォメーションマップ(下部パネルの赤いヒートマップ)およびエピゲノムマーク(H3K27ac、H3K27me3)、新生転写(RNA-seq)、RNAPIIのChIA-PETデータ(図4C,D)を統合することで実現されます。これらの領域では、トポロジー的に結合するドメイン(TAD)が明確に可視化され、RNA誘導によるクロマチンループはしばしばTAD境界に配置されたり、複数のTADにまたがったりします。ヒストン修飾および転写データを用いた追加の注釈により、活性クロマチン領域と非活性クロマチン領域の識別が可能になります。主要なRNA中心の調節ハブは図に丸で囲まれています。

異なるncRNAごとに明確なパターンが現れます。 roX2 はTES領域に結合し、TSSにループし、TAD境界に局在し、複数のTADを横断する長距離接触を形成することが特徴です。対照的に、 7SK は主にエンハンサーに結合し、隣接するプロモーターと短距離ループを形成し、一般的にTAD境界を通過しません。

これらの結果は、RDDがRNA特異的3Dクロマチン組織の解解析において信頼性が高く高解像度の手法であることを裏付けています。このアプローチにより、多様な生物学的環境におけるゲノム構造や遺伝子発現における調節RNAの空間的役割を直接調査することが可能になります。

図1:RDDライブラリ生成ワークフローの回路図。 RDDライブラリ生成の中心的なワークフローステップは順番に示され、対応する回路図も添付されています。この手技は、二重架橋とクロマチン標識から始まり、その後ビオチン修飾RNAプローブによるハイブリダイゼーションとストレプタビジンによる固定が行われます。その後のステップには、Aテールリング、ビオチン修飾リンカーとの近接結合、ライブラリー構築が含まれます。DNAをライティングした後、精製、Tn5媒介による断片化、ビオチン濃縮、ライブラリー増幅が行われます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:細胞溶解および核の透過化に関する視覚的品質管理基準を示すショウジョウバエS2細胞の代表的な顕微鏡画像。(A) 細胞溶解の成功は、形質膜の透過化と細胞質放出によって特徴づけられ、核が容易に見える状態です。(B) 核の透過が成功していることは、細胞の膨大、細胞膜の部分剥離、そして核が無傷で明確に見えることによって示されます。スケールバー=100μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図3:クロマチン調製剤のエレクトロフェログラム解析。 さまざまなクロマチンサンプルをプロファイリングする毛細血管電気泳動システムのスクリーンショット。 (A) 約1000〜3000 bpの範囲の断片化されたクロマチン(超音波検査)を示し、成功した断片化を示します。 (B) RNAに関連するクロマチン(RNA関連+非結合プローブ)を示し、矢印で示される非結合プローブを表す小さなピークを示します。 (C) RNA関連クロマチンを示し、濃度範囲は1000〜3000 bpで、RNAタンパク質複合体を反映しています。 (D) Tn5でタグ付けされたクロマチンを示し、タグメント効率を示す範囲を示します。 (E) 増幅後のシーケンシングライブラリの断片サイズ分布を示し、約180〜1000 bpにまたがる。 (F) サイズ選択後のシーケンスライブラリの断片サイズ分布を示し、主に約250〜600 bpの範囲で富集された断片。各試料ごとにRFU(相対蛍光単位)値が示されており、クロマチンの完全性とサイズの効果的な定量化を示しています。紫色の峰はマーカーを表しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:ncRNA関連クロマチン相互作用に関するRDDの代表的な結果。(A-B) ncRNA roX2(緑)および 7SK (紫)結合のゲノム位置と、対応する遠隔クロマチン相互作用ループを表示します。RNAPIIのChIA-PET(青)のデータからは、これらのncRNAと遺伝子発現の間に明確な調節関係があり、ピークは相互作用の強さを示しています。略称:TSS = 転写開始部位;TES = 転写終点部位;P = プロモーター;E = エンハンサー。 (C-D) ncRNA roX2および7SK関連クロマチンループおよびTADs(赤)の関係、ならびに活性・不活性クロマチン状態および遺伝子発現レベルの違いを高次元で示します。丸はTAD間で重要な相互作用があるエリアを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:RDD反応試薬。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:RDDバッファの組成。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

手法の重要なステップ
クロマチン中のRNAプローブの量と対応するRNAレベルを推定することは非常に重要です。過剰なプローブは、固定段階でストレプタビジン部位に結合しないプローブを占有し、標的RNA相互作用の捕捉を妨げることがあります。さらに、ストレプタビジンを過剰に添加すると物質が無駄になり、空きサイトの効果的なブロッキングにはより多くの変性IBPが必要になります。ブロッキングが不十分だと、特に近接連結リンカーにビオチン修飾も含まれているため、その後の近接接続の効率に悪影響を及ぼすことがあります。ブロッキングが十分でない場合、リンカーの一部がストレプトアビジンビーズに直接結合し、結果を複雑にすることもあります。さらに、リンカーとクロマチンの比率は慎重に推定される必要があり、リンカーが多すぎるとクロマチンDNAの両端にタグ付けされ、効果的な近接結合が妨げられます。

手法の改良点
本研究では、roX2 ncRNAを用いたショウジョウバエS2細胞を用いたRDD法を示します。試薬の体積は細胞型やncRNA発現レベルに応じて調整する必要があります。ncRNA発現が高い場合は、細胞量を減らすかRNAプローブ濃度を上げたり、その逆も可能です。このプロトコルはビーズ上のクロマチンを固定しますが、別の方法としては、in situ近接結合を行い、その後RNAプローブによる濃縮を行う方法があります。

特異性、制御、品質管理
以前にRDDを記載・検証し、複数のRNAに対して並行してRDDを実施し、強い特異性を示しました。読者は前作^4章16節を参照できます。RDDはプローブ依存的かつ遺伝子座特異的濃縮を必要とし、再現可能であれば直交的に検証される必要があります。真の相互作用は3つの基準を満たします:プローブ標的位座と近傍の非結合領域での濃縮;プローブ依存性(否定対照では存在しないか著しく減少);生物学的複製や独立した検証(例:RT-qPCR)の再現性。アンチセンスプローブはStellarisで設計され、BLAST/BLATでオフターゲットを除去し、3'-ビオチンで注文され、RTおよびqPCR(DNA汚染チェックや部位と非部位の濃縮を含む)で検証されました。ノープローブ、スクランブル/ノンターゲティング、無関係RNAまたは非結合領域プローブの3つの対照を推奨し、qPCRやシーケンシングカバレッジをターゲットおよび対照サンプル間で比較し、フォード豊かさや背景を報告することで特異性を評価します。低存在比RNAについては、プローブ密度(オフターゲット制約内で)を高め、シーケンス深度を上げ、直交検証を行います。

方法のトラブルシューティング
捕捉されたRNA-クロマチン相互作用が著しく低い場合は、リンカー量とクロマチン量の調整による近接結合の効率最適化が必要になるかもしれません。さらに、自動毛細管電泳写真によって非結合プローブの高いピークが観測されました。結果は、プローブが過剰に多数追加されたことを示しており、使用量を減らすことで修正可能です。

手法の限界
RDD法の大きな利点は、特定のRNA関連クロマチン相互作用を効率的に捕捉できることであり、各実験は一度に特定のRNAに集中できる点です。さらに、近接結合はペア間の相互作用を検出するために設計されているため、複数部位間の相互作用を同時に評価することはできません。

手法の意義
RDD法はRNA結合部位を明らかにするだけでなく、それらの部位間の相互作用関係を明らかにし、クロマチン構造の理解を深めます。

RDDの実用的用途と将来的可能性
RDDは、体内の宿主RNAやウイルス・他の微生物からの外因性RNAを含むさまざまなクロマチン関連RNAに適しており、さまざまな研究分野での幅広い応用性を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.5 M EDTA	インビトロジェン	AM9260G
1 M マグネシウムアセテート	シグマ・オルドリッチ	63052-100ML
1 M トリス-HCl、pH 7.0	インビトロジェン	AM9851
1 M トリス-HCl、pH 8.0	インビトロジェン	AM9856
1.5mLチューブ	エッペンドルフ	30108051
10 mM dATP	インビトロジェン	18252015
10% SDS(ウット/ボリューム)	インビトロジェン	AM9822
10回以上;Aテールバッファ	NEB	B7002S
10回以上;エンドリペアバッファ	NEB	B6002S
10回以上;T4 DNAリガーゼバッファー	NEB	B0202S
10回以上;TBEバッファ	インビトロジェン	AM9863
14mL丸底試験管	コーニング	352057
2×PCRマスターミックス	NEB	M0541
20回以上;SSCバッファ	インビトロジェン	AM9770
200-μL型PCRチューブ	サンゴン・バイオテック	F611541-0010
250mLの正方形PET保存ボトル	コーニング	431531
2-メルカプトエタノール(&β;-ME)	シグマ・オルドリッチ	M6250-100mL	!注意 & ベータ;-私が有害です;フムフードには必ず使ってください。
2mLチューブ	エッペンドルフ	22431048
3 M 酢酸ナトリウム pH 5.5	インビトロジェン	AM9740
5 M NaCl	インビトロジェン	AM9759
5 M 酢酸カリウム	シグマ・オルドリッチ	95843-100ML-F
500mLスクエアPET保存ボトル	コーニング	431532
分析的均衡	サルトリウス	BP211D
自動セルカウンター	カウンタースター	IC1000
自動毛細管電気泳動システム	生視	C100100
ビオチン化プローブ	ジェネウィズ		表1
ブロッキングパウダー	インビトロジェン	T2015
ブリッジリンカーオリゴ	ジェネウィズ		表1
CO2インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	51033549
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ	D2650-100mL
イルミナ用DNAライブラリー調製キットV2	ヴァイジーム	TD501
DNA精製キット	ザイモ	D4013
ダルベッコリン酸塩緩衝生塩水(DPBS)(1×)	ギブコ	14190250
EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル	ロッシュ	11836170001
EGS(エチレングリコールビス[succiniMidylsuccinate])	サーモ・サイエンティフィック	21565
洗脱バッファ	キアゲン	19086
エチルアルコール、純粋	シグマ・オルドリッチ	E7023-500mL
ホルムアルデヒド溶液	シグマ・オルドリッチ	47608-250mL-F	!注意:ホルムアルデヒドは有毒です。フムフードには必ず使ってください。
ホルマミド	インビトロジェン	AM9342
ゲルイメージングシステム	タノン	3500R
グリシン	インビトロジェン	50046-1kg
青色染料を用いたグリコーゲン	インビトロジェン	AM9516
高感度カートリッジ	生視	C105105
高密度位相ロック管(1.5 mL)	キアゲン	129046
高感度dsDNA蛍光測定キット	インビトロジェン	Q32851
Illumina用インデックスキットV2	ヴァイジーム	TD202
ヨードアセチル-PEG2-ビオチン(IPB)	サーモ・サイエンティフィック	21334
イソプロピルアルコール	シグマ・オルドリッチ	I9030	!注意:イソプロピルアルコールは有毒です。フムフードには必ず使ってください。
キロベースカートリッジ	生視	C105106
クレノウ断片(3'→5' エクソ-)	NEB	M0212L
磁気ビーズ	ベックマン	A63881
磁気分離ラック 15 mLチューブの場合	インビトロジェン	12301D
磁気分離ラック 2mLチューブの場合	インビトロジェン	12321D
PCRチューブ用の磁気分離ラック	NEB	S1515S
微生物インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	IMH180
顕微鏡	ニコン	エクリプス TS2
ミキサー	エルミ	RM-2L
N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)	シグマ・オルドリッチ	227056-100ML	!注意:DMFは有害です。フムフードには必ず使ってください。
非冷蔵マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5405000204
ヌクレアーゼフリーの水(DEPC処理されていない、1000 mL)	インビトロジェン	AM9932
ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理なし、50mL)	インビトロジェン	AM9937
核酸量化子	インビトロジェン	Q33226
軌道シェーカー	クリスタル	SYC-2102
フェノール:クロロホルム:IAA	ソーラービオ	P1012-100mL
プロテイナーゼK溶液	インビトロジェン	AM2548
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	22628180
冷蔵インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	IMP180
冷蔵マイクロ遠心分離機	エッペンドルフ	5404F1621754
冷蔵庫	ハイアール	DW-25L262
RNase阻害剤	アンビオン	AM2696
RNaseフリーの15mLチューブ	インビトロジェン	AM12500
RNaseフリーの50mLチューブ	インビトロジェン	AM12502
ソニケーター	ソニックス&材料	VCX130
ストレプタビジン被覆磁性ビーズC1	インビトロジェン	65001
ストレプタビジン被覆磁性ビーズ M-280	インビトロジェン	11205D
T4 DNAリガーゼ	NEB	M0202S
T4 DNAポリメラーゼ	NEB	M0203S
TEバッファーpH 8.0	インビトロジェン	AM9849
サーマルサイクラー	バイオ・ラッド	1851148
サーモミキサー	エッペンドルフ	5382000023
トライトン X-100	アクロス・オーガニクス	327371000-100mL
超低温冷凍庫	サーモ・サイエンティフィック	995
真空濃縮器	トミー	MV-100